Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une technique d’introduction de microparticules dans le système circulatoire du poisson-zèbre adulte par injection dans le rein du poisson. Les microparticules introduites sont visualisées dans le système vasculaire par une technique simple d’imagerie intravitale dans les branchies des poissons. Cette procédure peut être utilisée, par exemple, pour effectuer des mesures répétées du pH sanguin des poissons in vivo par l’introduction de sondes fluorescentes microencapsulées pour le pH.

Pour ce faire, dans un premier temps, le colorant sensible au pH SNARF-1 conjugué au dextran est encapsulé dans la coquille de polyélectrolyte semi-perméable en utilisant une approche couche par couche. Le colorant fluorescent est co-précipité dans des micronoyaux poreux de carbonate de calcium, et les noyaux sont recouverts de plusieurs couches de polymères non biodégradables chargés de manière opposée et recouverts d’un polymère biocompatible contenant du polyéthylène glycol. Ensuite, des noyaux de carbonate de calcium sont résolus pour obtenir des microcapsules entières renfermant SNARF-1.

À la deuxième étape de l’anesthésie et de la fixation des poissons, des microcapsules préparées sont injectées directement dans le rein de l’animal pour délivrer un colorant encapsulé dans le système circulatoire du poisson. Ensuite, une intervention chirurgicale minimale est nécessaire pour enlever le couvercle branchial et les capillaires dénudés des branchies de poisson. Ensuite, la visualisation des microcapsules dans le sang et l’enregistrement du spectre fluorescent peuvent être effectués in vivo par microscopie intravitale pour surveiller le pH sanguin.

Lorsque l’injection est bien effectuée, il est possible d’observer des microcapsules fluorescentes dans les branchies des poissons immédiatement après la procédure. Le spectre de fluorescence de la sonde encapsulée peut être enregistré à l’aide d’un spectromètre couplé à un microscope fluorescent. SNARF-1 a deux pics d’émission, et le rapport entre deux longueurs d’onde correspondant à ces pics peut être utilisé pour mesurer le pH.

La procédure proposée permet de délivrer des microcapsules fluorescentes dans le système circulatoire des poissons et de surveiller à distance la fluorescence dans le sang des poissons in vivo. Dans le cas de la recherche physiologique, le principal avantage de cette méthode est les mesures répétées des paramètres sanguins chez de petits animaux de laboratoire, qui sont généralement difficiles à réaliser. Si une sonde fluorescente sensible à la lumière est utilisée, il est conseillé d’effectuer l’ensemble de la procédure dans une pièce à faible luminosité.

Mélangez ici deux millilitres de solution d’un colorant fluorescent lié au polymère choisi, SNARF-1-dextran, avec 0,6 millilitre d’une solution molaire de chlorure de calcium et 0,6 millilitre d’une solution molaire de carbonate de sodium sous agitation rapide. À cette étape, des micronoyaux poreux de carbonate de calcium entourant le colorant fluorescent sont synthétisés. Après cinq à 10 secondes d’agitation, transférez la suspension dans des microtubes de deux millilitres et centrifugez pendant 15 secondes pour granuler des micronoyaux de carbonate de calcium.

Jetez le surnageant, lavez les noyaux avec environ deux millilitres d’eau déminéralisée et secouez la suspension. Répétez la procédure de centrifugation et de lavage trois fois. Incuber la suspension pendant une minute dans un bain à ultrasons pour réduire l’agrégation des micronoyaux.

Remettez en suspension les microcarottes de carbonate de calcium dans environ deux millilitres d’une solution de quatre microgrammes par millilitre de HAP polymère cationique pour déposer la première couche polymère sur les matrices. Conservez les micronoyaux dans la solution de pH pendant environ cinq minutes en les secouant constamment. Après 15 secondes de centrifugation, jeter le surnageant avec des HAP non liés et laver les micronoyaux à l’eau trois fois par plusieurs étapes de centrifugation et de lavage.

Répétez la même procédure avec une solution de polymère anionique PSS de quatre milligrammes par millilitre pour déposer la deuxième couche polymère sur les matrices. Juste avant d’ajouter la couche suivante, il est conseillé d’appliquer une incubation d’une minute dans un bain à ultrasons. Répéter séquentiellement le dépôt de polymères cationiques et anioniques six fois pour obtenir une enveloppe de microcapsules à 12 couches.

Ensuite, incubez des micronoyaux avec des coquilles dans la poly-L-lysine greffée de polyéthylène glycol pendant au moins deux heures. Ensuite, lavez une fois les micronoyaux couverts à l’eau par centrifugation séquentielle et remise en suspension. Enfin, dissoudre des matrices de carbonate de calcium dans deux millilitres de solution EDTA 0,1 molaire, ajustée à un pH d’environ 7,1, pour obtenir des microcapsules creuses.

Jeter le surnageant après une centrifugation de 45 secondes et répéter le lavage avec de l’EDTA deux fois. Jeter le surnageant après une centrifugation de 45 secondes et ajouter deux millilitres de solution saline. Répétez trois fois les étapes de centrifugation de lavage avec une solution saline.

Étudier la distribution granulométrique et la concentration des microcapsules préparées dans un hémocytomètre au microscope fluorescent. Utilisez ImageJ ou un logiciel équivalent pour l’analyse granulométrique des particules. Stockez la sonde encapsulée obtenue dans l’obscurité.

Pour préparer le système optique, placez l’ensemble requis de filtres fluorescents sur le microscope fluorescent en fonction des caractéristiques du colorant fluorescent appliqué et allumez la lampe fluorescente. Tirez le levier vers les oculaires. Connectez la fibre optique d’une extrémité au spectromètre et de l’autre extrémité à un collimateur.

À l’aide d’adaptateurs, faites jouer le collimateur dans la mise au point du tube de la caméra ou d’un autre port disponible du microscope fluorescent. Pour l’étalonnage des microcapsules préparées, placez environ cinq microlitres de la suspension de microcapsules sur une lame de microscope et faites sécher la goutte dans un endroit sombre. Allumez le spectromètre.

Exécutez le programme de contrôle du spectromètre et préparez le spectromètre pour les mesures. Pour calibrer les caractéristiques spectrales du SNARF-1 microencapsulé, utilisez des séries de tampons de pH différents. Déposez environ 10 microlitres de tampon de sodium sur les microcapsules séchées avec SNARF-1 et couvrez-les d’une lamelle.

Placez une lame de verre sur la platine du microscope. Localisez les microcapsules à l’aide d’un grossissement d’environ 400. Tournez le levier du microscope sur le port de la caméra.

Enregistrez la fluorescence avec le spectromètre. Assurez-vous que le signal spectral est bien au-delà du niveau de fond et observez que les microcapsules ne sont pas dans une bulle. Évitez l’allumage prolongé des mêmes microcapsules, car SNARF-1 est sensible au photoblanchiment.

Retournez le levier vers les oculaires. Calculer le rapport de l’intensité de fluorescence du SNARF-1 encapsulé à la longueur d’onde correspondant aux pics d’émission du colorant protoné et déprotoné. Construisez une courbe d’étalonnage du rapport dépendant du pH du milieu.

Prélever environ 10 microlitres de sang de poissons euthanasiés. Déterminez son pH à l’aide d’un pH-mètre à l’aide d’une microélectrode. Ensuite, déposez du sang sur une lame avec des microcapsules séchées et enregistrez le rapport de l’intensité de fluorescence comme décrit pour les tampons d’étalonnage.

Comme vous devez tenir compte de l’influence des composants sanguins sur la lecture du SNARF-1 encapsulé, ajustez le coefficient linéaire de la courbe d’étalonnage pour que la courbe corresponde aux mesures dans le sang de poisson. Pour préparer l’aiguille à l’injection, libérez une aiguille en acier de l’extrémité de la seringue à insuline en retirant le plastique avec une lancette bien aiguisée. Insérez l’aiguille à mi-chemin dans le microcapillaire en verre.

Soudez-le rapidement et doucement à l’aide d’une torche à gaz. Connectez le microcapillaire en verre au micro-injecteur et rincez-le à l’eau stérile trois fois. Assurez-vous que le liquide s’écoule à travers l’aiguille.

Remplissez le système d’eau. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le système. Le jour de l’expérience, prendre la suspension préparée de microcapsules dans une solution saline stérile contenant de la moitié à six millions de microcapsules par microlitre.

Remettez-le en suspension par le bain à ultrasons pendant une minute. Lors de l’injection suivante, agitez périodiquement le flacon pour remettre les microcapsules en suspension et éviter leur agrégation. À l’aide d’une cuillère, sortez le poisson de l’anesthésique et placez-le doucement sur une éponge humide en position latérale avec la tête vers la gauche si vous êtes droitier ou vers la droite si vous êtes gaucher.

Juste avant l’injection, aspirez un à deux millimètres d’air dans le capillaire en verre relié au micro-injecteur. Ensuite, chargez-le avec environ deux microlitres de microcapsules dispersées. Stabilisez doucement le corps du poisson sur l’éponge avec votre main non dominante.

Trouvez la ligne latérale du poisson. Placez l’aiguille un millilitre en dessous du milieu d’un segment abdominal de la ligne latérale. Puis, par un mouvement de grattage, écartez l’écaille de poisson et faites une perforation.

Insérez l’aiguille dans le corps à un angle de 45 degrés par rapport à la surface de la table. Poussez l’aiguille vers la colonne vertébrale jusqu’à ce qu’elle repose soigneusement contre la colonne vertébrale. Ensuite, libérez lentement environ un microlitre de suspension de microcapsules dans le rein et retirez lentement l’aiguille.

Rincez le poisson de la tête à la queue avec un jet d’eau pour éliminer les microcapsules renversées au point d’injection. Utilisez des ciseaux de dissection pour retirer le couvercle branchial de la tête du poisson et dénuder les branchies du poisson. Rincez les branchies à l’eau.

À l’aide d’une cuillère, transférez le poisson sur une lame de microscope et placez-le sur la platine d’un microscope fluorescent. Lorsque vous effectuez les procédures suivantes, assurez-vous que les branchies du poisson ne se dessèchent pas. Pour ce faire, humidifiez-les périodiquement avec de l’eau à l’aide d’une pipette Pasteur.

Assombrissez la pièce et, à l’aide d’un faible grossissement, inspectez les branchies pour trouver des microcapsules fluorescentes. Lorsque vous le trouvez, passez l’objectif à une magnitude plus élevée et positionnez-le au centre du champ de vision. Tournez le levier vers le port avec un spectromètre connecté.

Enregistrez le signal spectral. Retournez le levier vers les oculaires. Répétez plusieurs fois les mesures pour différentes microcapsules.

Transférez les poissons dans l’aquarium avec une aération appropriée pour la récupération. La procédure de mesure peut être répétée plusieurs fois pour un individu à l’aide d’une anesthésie répétée ou d’une autre méthode de fixation. L’image montre un exemple représentatif de mesures in vivo du sang de poisson-zèbre et de l’hypercapnie par un colorant fluorescent encapsulé SNARF-1.

Dans des conditions de contrôle, le pH sanguin reste stable pendant quatre heures après l’injection de microcapsules, tandis qu’une exposition de cinq minutes sous un taux élevé de dioxyde de carbone provoque une acidification du sang des poissons. Lors de l’exécution de la procédure, il est important de minimiser le stress des animaux causé par la manipulation et la chirurgie. Avec un peu de pratique, l’injection et l’enregistrement du signal prennent en moyenne environ deux à trois minutes, de sorte que ce protocole permet de terminer les manipulations avant que le poisson ne se réveille d’une anesthésie légère.

Pendant la procédure, assurez-vous que les branchies du poisson sont toujours humidifiées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une implantation simple et efficace de microparticules dans le système circulatoire des petits poissons. Comme démontré, cette technique est très pratique pour les enregistrements répétés in vivo du pH sanguin chez le poisson-zèbre adulte à l’aide de microcapsules remplies d’une sonde fluorescente.