Name: Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Découvrez une technique d'injection rénale de microparticules fluorescentes chez le zebrafish adulte pour visualiser le pH sanguin in vivo. Cette méthode permet des mesures répétées des paramètres physiologiques.

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Auteurs reconnaissent grandement l’aide de Bogdan Osadchiy et Evgenii Protasov (Université d’état d’Irkoutsk, Russie) dans l’élaboration du protocole vidéo. Cette recherche a été financée par la Fondation russe de la Science (#15-14-10008) et la Fondation russe pour la recherche fondamentale (#15-29-01003).

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la Directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale et ont été approuvés par l’Animal sujets recherche Comité d’Institut de biologie à l’Université d’état d’Irkoutsk.
1. fabrication de Microcapsules
Remarque : Les Microcapsules transportant un colorant fluorescent sont préparés à l’aide d’une couche par couche de charge opposée polyélectrolytes7,8. Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante.
<ol><li>Pour synthétiser poreux CaCO3 microcores enfermant le colorant fluorescent, mélanger 2 mL de la solution de SNARF-1-dextran (la plupart liés au polymère de colorant fluorescent comme FITC-BSA peut être utilisé) à une concentration de 2 mg/mL à 0,6 mL chacune des solutions de 1 mol/L de CaCl2 et Na2CO3 sous agitation rapide. Remarque : Faire attention aux sensibilités différentes de colorants fluorescents et photoblanchiment ; Si on utilise une sonde fluorescente sensible à la lumière (comme le SNARF-1), la manipulation et le stockage des microparticules doivent être effectuées avec comme peu de lumière que possible.</li>
	<li>Après 5-10 s d’agitation, transférer la suspension pour tubes de microcentrifuge de 2 mL et centrifuger pendant 15 s à 10 000-12 000 g pour granuler CaCO3 microcores.</li>
	<li>Jeter le surnageant, laver les carottes avec environ 2 mL d’eau désionisée et Resuspendre le culot en secouant.</li>
	<li>Répéter le procédé de centrifugation-laver trois fois au total. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.</li>
	<li>Incuber le microcores pendant 1 min dans un bain ultrasonique pour réduire leur agrégation. ATTENTION : N’oubliez pas de protéger les oreilles avec un casque.</li>
	<li>Pour déposer la première couche de polymère sur les modèles, remettre en suspension les carottes dans environ 2 mL d’une solution de 4 mg/mL de poly(allylamine hydrochloride) (HAP) à 1 mol/L de NaCl.<ol>
<li>Gardez le microcores dans la solution pendant environ 5 min avec agitation constante.</li>
		<li>Après 15 s de centrifugation, jeter le surnageant avec le PAH indépendant. Laver le microcores couvert au moins 3 fois par centrifugation multiples et étapes de lavage l’eau désionisée. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.</li>
		<li>Incuber le microcores pendant 1 min dans un bain ultrasonique pour réduire leur agrégation. Remarque : Si le colorant fluorescent appliqué est cationique, lancer de poly (4-styrenesulfonate de sodium) (PSS) à 1 mol/L de NaCl (voir étape 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’étape 1.6 avec environ 2 mL d’une solution de 4 mg/mL de PSS (également contenant 1 mol/L de NaCl) pour déposer la deuxième couche de polymère sur les modèles.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.6 et 1.7 six fois à déposer 12 couches de polymères. NOTE : Il n’est pas recommandé de prendre une pause longue (~ 12 h ou plus) dans la procédure jusqu'à environ 3-5 couches ont été déposés parce que CaCO3 microcores sans couverture peut avoir tendance à recristalliser. Notez que la couverture PSS provoque une agrégation supérieure de la microcores, et la longue pause est recommandable qu'uniquement lorsque les HAP ou poly-L-lysine greffée avec du polyéthylène glycol (PEG-g-PLL) est la couche demi-taille.</li>
	<li>Incuber le microcores couvert en 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pour microtube) pendant au moins 2 h.<ol>
<li>Laver le microcores avec de l’eau par centrifugation séquentielle et des mesures de remise en suspension. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour obtenir des microcapsules creuses, dissoudre les CaCO3 modèles en ajoutant 2 mL de 0,1 mol/L tétraacétique (EDTA) solution acide (ajusté à pH 7.1 avec NaOH) à la microcores couverte.<ol>
<li>Après environ 5 min d’incubation, centrifuger les microcapsules pour 45 s et jeter le surnageant avec l’EDTA.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.10-1.10.1 deux fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver les microcapsules avec 0,9 % NaCl trois fois par centrifugation plusieurs étapes dans les 45 s suivie d’étapes de lavage. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant. Remarque : La solution finale microcapsule injectable doit être stérile (par exemple en ajoutant l’ampicilline, 0,1 mg/mL), et les médias devraient être biocompatibles dans le but d’enquête (milieux isotoniques avec pH neutre).</li>
	<li>Estimation de la concentration des microcapsules préparés dans un hémocytomètre sous un microscope à fluorescence. Prendre une série de photos de microcapsules, mesurer le diamètre d’environ une centaine de microcapsules ImageJ9 ou équivalent logiciel et étudier la répartition de la taille à l’aide d’un histogramme.</li>
	<li>Magasin obtenu encapsulé sonde dans l’obscurité. NOTE : après plusieurs lavages en stérile 0,9 % NaCl, les microcapsules peuvent être stockées pendant des mois à 4 ° C. Il n’est pas recommandé de compléter le séchage des microcapsules pendant le stockage.</li>
</ol>2. préparation d’optique montage et étalonnage des microcapsules SNARF-1
Remarque : Des mesures de pH rugueux avec microencapsulés SNARF-1 peuvent être faites en utilisant des images dans les deux canaux d’un microscope à fluorescence7, mais dans le présent protocole, un microscope à fluorescence une voie connecté à un spectromètre de fibre a été appliqué.
<ol><li>Placez le jeu de filtres de fluorescence pour le microscope à fluorescence selon les caractéristiques du colorant fluorescent appliqué requis et allumez la lampe fluorescente.<ol>
<li>Tirez sur le levier pour les oculaires. ATTENTION : Léger excédent peut endommager la matrice du spectromètre. Ainsi, assurez-vous que le levier est en mode « oculaire » lorsque le spectromètre n’est pas utilisé.</li>
		<li>Connectez une extrémité de la fibre optique pour le spectromètre et l’autre extrémité à un collimateur. L’utilisation d’adaptateurs, placer le collimateur dans la mise au point du tube caméra ou autre port disponible du microscope à fluorescence.</li>
		<li>Allumez le spectromètre. Exécutez le programme de contrôle de spectromètre et préparer le spectromètre pour les mesures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’étalonnage du lot microcapsule, placer ~ 5 µL de la suspension de microcapsules (microcapsules ~ 10 000 par µL dans l’eau désionisée) sur une lame de microscope et sécher la goutte dans un endroit sombre (par exemple, dans un thermostat à 35 ° C).<ol>
<li>Pour calibrer les caractéristiques spectrales du SNARF-1 micro-encapsulée, utilisez une série de tampons avec différentes valeurs de pH dans la gamme ~ 6-9. Laisser tomber ~ 10 µL d’un tampon sur les microcapsules séchées avec SNARF-1-dextran et recouvrir d’un lamelle couvre-objet.</li>
		<li>Placer la lame sur la platine du microscope. Localiser les microcapsules à l’aide d’un objectif de 40 ×.</li>
		<li>Tournez le levier de microscope pour le port de la caméra. S’inscrire à leur fluorescence avec le spectromètre. Tournez le levier vers les oculaires. Remarque : Assurez-vous que le signal spectral est bien au-delà du niveau de fond et faire en sorte que les microcapsules dans le champ de vision ne sont pas dans une bulle (en optant pour un grossissement inférieur si nécessaire). Évitez d’illumination prolongée des microcapsules mêmes. SNARF-1 est sensible au photoblanchiment.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.2.3 pour différents microcapsules 10 à 15 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer les ratios de pic de fluorescence (par exemple, à l’aide de R ou Scilab) pour tous les spectres enregistrés et de déterminer la courbe de régression entre le ratio médian (pour chaque tampon) et le pH du milieu à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> NOTE : SNARF-1 a un spectre avec deux pics correspondant à l’émission de la teinture protoné et déprotoné, et le rapport entre les pics est sensible au pH du milieu. Dans cette étude, le rapport entre l’intensité de fluorescence pour 605 et 660 nm est utilisé. Ces longueurs d’onde sont choisies selon le filtre utilisé. a et b sont des coefficients à déterminer par régression non linéaire (par exemple, à l’aide de R). Valeurs de 0,15 et 1.1 sont respectivement les valeurs minimales et maximales de j’ai605/i660 observée au cours de l’étalonnage.</li>
	<li>Recueillir environ 10 µL de sang poisson d’environ 5 animaux adultes. Poisson de la place dans une boîte de Pétri avec 1 µL/mL suspension d’huile de clou de girofle pour l’anesthésie de l’eau et attendre jusqu'à ce que l’animal se tourne sur le côté et ne répond plus aux pincées de la nageoire (habituellement environ 2-3 min). Transférer le poisson sur une lame de verre. Couper la queue de poisson avec une lancette et recueillir environ 2 µL de sang de poissons de la veine caudale. Remarque : Pour éviter la coagulation du sang, traiter l’incision avec de l’héparine (5000 U/mL) et utiliser des capillaires en verre hépariné et tubes de microcentrifuge de recueillir le sang.<ol>
<li>S’écouler environ 10 µL de sang avec une pipette sur l’extrémité de la microélectrode et déterminer le pH à l’aide d’un pH-mètre.</li>
		<li>Laisser tomber le sang sur une lame de microcapsules séchées et enregistrer le rapport entre l’intensité de fluorescence, comme pour les mémoires tampons d’étalonnage (étapes 2.2 à 2.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuster le coefficient linéaire de la courbe d’étalonnage à faire la courbe correspond à la mesure dans le sang de poissons (pour plus de détails, voir Borvinskaya et coll. 20175).</li>
</ol>3. préparation pour Injection
<ol><li>Libérer l’aiguille d’acier de la pointe du stylo à insuline (ou seringue) en enlevant le plastique avec une lancette pointu. Remarque : Une aiguille fine (Ø0.33 mm ou moins) ou capillaire de verre (habituellement Ø1 mm) peut être préparé pour la microinjection10,11.</li>
	<li>Insérer l’aiguille à mi-chemin dans le verre microcapillaire ; rapidement et en douceur, souder à l’aide d’un chalumeau à gaz.</li>
	<li>Connectez le microcapillaire de verre à le microinjector et rincez-la à l’eau stérile trois fois. Veiller à ce que le liquide s’écoule à travers l’aiguille.</li>
	<li>Remplir le système avec de l’eau distillée. Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le système.</li>
</ol>4. injection
<ol><li>Remettre en suspension la suspension préparée des microcapsules (en stérile 0,9 % NaCl, ou tout autre support utilisé pour les injections, avec une concentration de 0,5 à 6 millions de microcapsules par microlitre) en utilisant le bain à ultrasons pendant 1 min. Remarque : Étant donné que les microcapsules ont tendance à précipiter, au cours de l’injection suivante, agiter le flacon avec les microcapsules mécaniquement (à l’aide d’un rotor) ou manuellement toutes les quelques minutes pour remettre en suspension les et empêcher leur agrégation.</li>
	<li>Placer le poisson dans un plat de Pétri avec un anesthésique (0,1 mL/L d’huile de clou de girofle en suspension dans l’eau) pendant environ 2-3 min. Attendez que le poisson se tourne sur le côté et ne répond plus à un léger pincement de la nageoire.</li>
	<li>À l’aide d’une cuillère, transférer le poisson hors de l’anesthésique et placez-le délicatement sur une éponge humide dans une position latérale avec la tête vers la gauche (pour droitier) ou vers la droite (pour une personne gauchère).</li>
	<li>Juste avant l’injection, sucer 1 ou 2 mm d’air dans le verre capillaire lié à microinjector. Puis, chargez-le avec environ 2 µL de microcapsules dispersées. NOTE : Avant l’injection, la solution de la microcapsule doit être réglée à la température à laquelle les poissons sont maintenus.</li>
	<li>Doucement stabiliser le corps des poissons sur l’éponge avec la main non dominante.<ol>
<li>Trouver la ligne latérale des poissons. Mentalement, sélectionnez un segment qui s’étend de l’opercule jusqu'à la fin de la cavité abdominale. Trouver au milieu de ce segment. Mettre l’aiguille de 1 mm plus bas dans la direction ventrale.</li>
		<li>Avec un mouvement de grattage, déplacez doucement le poisson met à l’échelle côté et faire une piqûre. Introduire l’aiguille dans le corps à un angle de 45° à la surface de la table.</li>
		<li>Pousser l’aiguille vers la colonne vertébrale jusqu'à ce qu’il repose bien contre elle.</li>
		<li>Libèrent environ 1 µL de suspension des microcapsules dans le rein et retirer doucement l’aiguille. Remarque : Pour trouver le bon point de ponction plus facilement, il est utile de pratique trouver le rein de tronc de transilluminating les poissons à l’aide d’une lumière de fond, comme illustré dans la Figure 2 a et 2 b.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rincer le poisson de la tête à la queue avec un jet d’eau afin d’éliminer tout déversements microcapsules au site d’injection.</li>
</ol>5. in Vivo de visualisation
<ol><li>Utiliser des ciseaux de dissection pour enlever l’opercule de la tête de poisson et DDE les branchies des poissons. Rincer les branchies avec de l’eau.</li>
	<li>À l’aide d’une cuillère, transférer le poisson sur une lame de microscope et placez-le sur la scène du microscope à fluorescence. Remarque : Assurez-vous que les branchies des poissons ne sèchent pas durant les interventions successives. Pour éviter cela, périodiquement les humidifier avec de l’eau à l’aide d’une pipette Pasteur (environ toutes les 1-2 min).</li>
	<li>Assombrir la pièce et à l’aide de faible grossissement (x 10 objectif) inspecter les branchies pour trouver les microcapsules fluorescents. Remarque : Lorsque la procédure est utilisée pour l’introduction de certaines particules fluorescentes dans système circulatoire du poisson, il est recommandé d’inspecter les branchies de plusieurs personnes pour des particules fluorescentes inattendues avant les injections. Branchies de poissons zèbres sauvage n’ont pas d’autofluorescence, mais dans certains cas des particules fluorescentes sporadiques (comme des morceaux d’aliments ou symbiotes unicellulaires) peuvent être présents sur les branchies. Si nécessaire, ces particules peuvent être reconnus basée sur leur forme spécifique (par exemple, morceaux d’aliments ont une forme irrégulière, à la différence des microcapsules sphériques) ou spectre de fluorescence (c.-à-d., couleur).<ol>
<li>Basculez la lentille à une magnitude plus élevée (objectif x 40) et placer une microcapsule ou un groupe de microcapsules au centre du champ de vision.</li>
		<li>Tournez le levier sur le port avec un spectromètre connecté. Enregistrer le signal spectral.</li>
		<li>Tournez le levier vers l’oculaire.</li>
		<li>Répéter les mesures pour différents microcapsules plusieurs fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les poissons dans l’aquarium avec une aération adéquate pour la récupération. Remarque : Avec un minimum de pratique, il est possible d’effectuer l’injection et le signal d’enregistrement au taux approximatif de 2-3 min par poisson. La mesure peut être répétée pour un individuelle plusieurs fois avec l’utilisation de doses répétées de faibles et inoffensifs de l’anesthésie ou une autre méthode de fixation. Pour l’observation à long terme, utiliser un système avec anesthésie continue12.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour illustrer l’injection de microparticules dans les reins de poisson-zèbre, nous avons utilisé semi-perméable microcapsules chargées avec un colorant indicateur. Ainsi, le protocole contient des instructions pour la fabrication de microcapsules à l’aide de l’Assemblée de couche par couche de charge opposée polyélectrolytes7,8,15,16,17 ,<sup clas...

L’administration de taille micro particules dans l’organisme animal est une tâche importante dans des domaines tels que la drogue et vaccin livraison1, système vasculaire visualisation2, implantation de cellules transgéniques3et implantation de minuscules capteurs optiques 4 , 5. Toutefois, la procédure d’implantation pour les particules de micro-échelle dans le système vasculaire des petits animaux de laboratoire est difficile, surtout pour les organismes aquatiques sensibles. Pour les échantillons de recherche populaires comme le poisson-zèbre, il est conseillé que ces procédures de préciser à l’aide de protocoles vidéo.
Microinjections intracardiaques et capillaires nécessitent un personnel formé et des installations de microchirurgie unique pour la livraison de microobjects dans le sang du poisson-zèbre. Auparavant, un rétro-orbitaire injection manuelle3 a été proposé comme une méthode simple et efficace pour l’administration de cellules entières. Cependant, dans notre expérience, à cause de la petite surface du réseau capillaire oeil, il faut beaucoup de pratique pour atteindre les résultats escomptés de cette technique.
Ici, on décrit une méthode pour l’implantation de microparticules robustes et efficaces dans le système circulatoire par injection manuelle directement dans le tissu rénal du poisson-zèbre adulte, qui est riche en capillaires et de vaisseaux rénaux. Cette technique est basée sur le protocole vidéo greffe de cellules dans le poisson-zèbre rein6, mais les opérations microchirurgicales traumatiques et beaucoup de temps ont été éliminées. La méthode proposée se caractérise par une mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible.
Une partie importante du protocole proposé est la visualisation de l’implanté microparticules (s’ils sont fluorescents ou colorisée) dans les capillaires de gill, qui permet la vérification de la qualité de l’injection, une évaluation approximative relative du nombre de injection de particules et la détection du signal spectral pour mesures physiologiques directement à partir de la circulation sanguine. Par exemple des applications possibles de la technique décrite, nous démontrons le protocole pour des mesures in vivo du poisson-zèbre pH du sang à l’aide d’une sonde fluorescente microencapsulée, SNARF-1, initialement suggéré dans Borvinskaya et al. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Sonde fluorescente Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>. Tout autre colorant fluorescent lié à un polymère approprié peut être utilisé comme charge de microcapsule</td></tr><tr><td>Conjugué albumine-fluorescéine isothiocyanate (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Sonde fluorescente</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Sonde fluorescente</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO3 formation de matrices</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3 formation de matrices</td></tr><tr><td>Poly(chlorhydrate d’allylamine), MW 50000 (HAP)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Polymère cationique</td></tr><tr><td>Poly(4-styrènesulfonate de sodium), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Polymère anionique</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] greffé avec du polyéthylène glycol [5 kDa], g = 3,0 à 4,5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)</td><td>Polymère final pour augmenter la biocompatibilité des microcapsules</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Pour dissoudre les polymères appliqués</td></tr><tr><td>Système de purification de l’eau</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Pour préparer de l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>Stegler</td><td></td><td>Pour la formation</td></tr> <tr><td>de modèles de CaCO3Eppendorf&nbsp ; Recherche&nbsp ; pipette Plus, 1000 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Solutions de dosage</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; Recherche&nbsp ; pipette plus, 10 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Solutions de dosage Pointes de</td></tr><tr><td>pipette, plage de volume 200 à 1000 & micro ; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Solutions de dosage</td></tr><tr><td>Pointes de pipette, plage de volume 0,1-10&nbsp ; &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Solutions de dosage</td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse Microspin 12, BioSan</td><td></td><td></td> à grande vitesse <td>Pour le procédé de centrifugation-lavage des microcapsules</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifugation, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Synthèse et stockage des microcapsules</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>Pour réduire l’agrégation de microcapsules</td></tr><tr><td>Nettoyeur</td><td></td><td></td> à ultrasons <td>Pour réduire l’agrégation de microcapsules Casques</td></tr><tr><td>d’écoute&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Pour protéger les oreilles des ultrasons</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>Pour dissoudre le CaCO3</td></tr><tr><td>modèles Phosphate monosodique</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Préparation des tampons de pH</td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Préparation des tampons de pH</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>Pour ajuster le pH de la solution EDTA et des tampons</td></tr><tr><td>Chambre</td><td></td><td></td> thermostatique <td>Pour sécher les microcapsules sur une lame de verre</td></tr><tr>Hémocytomètre <td></td><td></td> Chambre de<td>numération des cellules sanguines</td><td>Pour étudier la distribution de la taille et la concentration des microcapsules préparées</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>Visualisation in vivo des microcapsules dans le sang</td></tr> <tr><td>de poissonJeu de filtres fluorescents pour SNARF-1 (à choisir en fonction du modèle de microscope ; un exemple est fourni)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualisation de microcapsules avec des sondes fluorescentes</td></tr><tr><td>Spectromètre à fibre QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Étalonnage de microcapsules au microscope</td></tr><tr><td>Fibre optique QP400-2-VIS NIR, 400 &mu ; m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Pour connecter le spectromètre avec le port du microscope</td></tr><tr><td>Collimateur F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td> Pour connecter le <td></td><td>spectromètre avec le port du microscope</td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Étalonnage des microcapsules au microscope</td></tr><tr><td>Lamelles, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Étalonnage des microcapsules au microscope</td></tr><tr><td>Microcapillaires en verre Intra MARK, 10 & micro ; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Pour recueillir le sang de poisson</td></tr><tr><td>Huile de clou de girofle</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Anesthésie de poisson</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>Pour couper la queue du poisson et libérer l’aiguille en acier de l’extrémité de l’auto-injecteur d’insuline</td></tr><tr><td>Héparine, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Pour traiter toutes les surfaces qui entrent en contact avec le sang de poisson lors de la collecte de sang de poisson</td></tr><tr><td>Sept 2 Go Pro pH-mètre avec une microélectrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Pour déterminer le pH du sang de poisson</td></tr><tr><td>Aiguilles du stylo à insuline Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Pour la procédure d’injection. Toute aiguille fine (& Oslash ; 0,33 mm ou moins) est appropriée</td></tr><tr><td>Capillaires en verre, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml ; te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>Pour le procédé d’injection</td></tr><tr><td>Chalumeau</td><td></td><td></td><td>à gaz Pour souder l’aiguille d’acier au capillaire en verre</td></tr><tr><td>Micro-injecteur IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Pour le dosage précis de microcapsules en suspension Boîtes de</td></tr><tr><td>Pétri, 60 mm x 15 mm, polystyrène</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Pour les manipulations avec des poissons sous anesthésie</td></tr><tr><td>Cuillère</td><td></td><td></td> <td>en plastiquePour les manipulations avec des poissons sous anesthésie</td></tr><tr><td>Éponge</td><td></td><td></td> humide <td>Pour les manipulations avec des poissons sous anesthésie</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Pour retirer le couvercle branchial de la tête du poisson</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur, 3,5 mL</td><td>MARQUE</td><td>Z331767</td><td>Pour humidifier les branchies des poissons</td></tr></tbody></table>

une administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’injection de rein

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

L’administration systémique de taille micro particules dans un organisme vivant peut être appliquée pour la visualisation du système vasculaire, drogue et administration de vaccins, implantation de cellules transgéniques et de minuscules capteurs optiques. Toutefois, des microinjections intraveineuse en petits animaux, qui sont principalement utilisés dans les laboratoires biologiques et vétérinaires, sont très difficiles et nécessitent un personnel formé. Ici, nous démontrons une méthode robuste et efficace pour l’introduction de microparticules dans le système circulatoire du adult poisson zèbre (Danio rerio) par injection dans le rein de poissons. Pour visualiser les microparticules introduites dans le système vasculaire, nous proposons une technique d’imagerie intravitale simple dans les branchies des poissons. Surveillance in vivo du poisson-zèbre pH sanguin a été accompli à l’aide d’une injection fluorescentes microencapsulés probe, SNARF-1, afin de démontrer une des applications possibles de la technique décrite. Cet article fournit une description détaillée de l’encapsulation de colorant sensibles au pH et illustre les principes de l’injection rapide et visualisation des microcapsules obtenues pour in vivo d’enregistrement du signal fluorescent. La méthode proposée d’injection se caractérise par un taux de mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible. Toutes les procédures décrites peuvent être exécutées sur d’autres espèces de petits poissons, comme les guppys et chez les sujets exposés.

Les résultats obtenus proviennent d’un des trois principales catégories du protocole présenté : la formation de microparticules fluorescentes par encapsulation d’un colorant fluorescent (Figure 1), l’injection de rein de microcapsules avec davantage de visualisation dans branchies capillaires (Figure 2 et 3) et, enfin, l’in vivo spectrale enregistrement de fluorescence SNARF-1 pour surve...

Cet article illustre les principes d’une injection rapide et mini-invasive de microparticules fluorescentes dans le circulatory system de petits poissons et de la visualisation en vivo des microparticules dans le sang du poisson.

Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une technique d’introduction de microparticules dans le système circulatoire du poisson-zèbre adulte par injection dans le rein du poisson. Les microparticules introduites sont visualisées dans le système vasculaire par une technique simple d’imagerie intravitale dans les branchies des poissons. Cette procédure peut être utilisée, par exemple, pour effectuer des mesures répétées du pH sanguin des poissons in vivo par l’introduction de sondes fluorescentes microencapsulées pour le pH.Pour ce faire, dans un premier temps, le colorant sensible au pH SNARF-1 conjugué au dextran est encapsulé dans la coquille de polyélectrolyte semi-perméable en utilisant une approche couche par couche. Le colorant fluorescent est co-précipité dans des micronoyaux poreux de carbonate de calcium, et les noyaux sont recouverts de plusieurs couches de polymères non biodégradables chargés de manière opposée et recouverts d’un polymère biocompatible contenant du polyéthylène glycol. Ensuite, des noyaux de carbonate de calcium sont résolus pour obtenir des microcapsules entières renfermant SNARF-1.À la deuxième étape de l’anesthésie et de la fixation des p

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Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

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Cette vidéo démontre la micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans la veine de la queue d’un embryon de poisson-zèbre pour étudier leurs effets chimiques sur la fonction rénale.

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blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

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Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

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