Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

L’objectif global de cette méthodologie est de rendre la micro-injection de larves de zerbrafish plus facile et plus précise. Cette méthode aide les chercheurs utilisant des systèmes de modèles de poisson-zèbre à immobiliser les larves de poisson-zèbre dans des orientations spécifiques dans de grands réseaux. La technique permet un accès plus facile à des tissus spécifiques pour la micro-injection et l’imagerie, et est très efficace lorsqu’un grand nombre de larves sont nécessaires pour des applications telles que les modèles d’infection ou de xénogreffe de cancer.

Mes stratégies de fabrication dans les modèles de poisson-zèbre sont très complémentaires. L’un est simple et artificiel. L’autre est en direct et complexe.

Les deux partagent la même échelle de taille. Ils sont tous deux transparents. Et les deux permettent des observations à une résolution de cellule unique.

Comme vous le montrez ici, ils peuvent être facilement combinés, et ils pourraient avoir des applications à l’étude de pratiquement n’importe quelle maladie majeure. Après avoir préparé un bloc PDMS dans une boîte de Pétri recouverte d’une fine pellicule de E-3, selon le protocole textuel, utilisez une pipette de transfert pour transférer le nombre requis d’embryons sur la surface du bloc PDMS. À l’aide d’une boucle de cheveux ou d’un outil similaire, poussez les embryons dans les divots de microstructure, en particulier pour les orientations dorsale et ventrale.

Lors du chargement des larves dans les divots, il est important d’avoir suffisamment d’eau recouvrant le bloc PDMS pour permettre une manipulation facile. Il est également important de les enfoncer dans les divots afin qu’ils restent en place pendant l’injection. Pour orienter le poisson-zèbre sur des canaux de microstructure préalablement préparés selon le protocole texte, utilisez une pipette de transfert pour dessiner E-3 sur le bloc PDMS à motifs.

Le niveau de E-3 doit descendre en dessous du bord du bloc, mais être toujours présent dans le réservoir et les canaux, et une fine couche reste sur le PDMS. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez 10 embryons anesthésiés dans le réservoir, en faisant attention de ne pas déborder des bords. À l’aide d’une boucle de cheveux, manipulez chaque embryon dans la tête de l’entonnoir, d’abord à l’entrée du canal approprié, en vous assurant que l’embryon a la bonne orientation lorsqu’il entre dans le canal.

Ensuite, utilisez une boucle de cheveux pour faire glisser chaque embryon dans le canal, jusqu’à ce qu’il atteigne les microcaractéristiques d’orientation dans les parois du canal qui le maintiennent en place. Après la préparation des aiguilles de micro-injection et de la solution de microinjection, utilisez une pointe de pipette finement effilée pour charger cinq microlitres de solution dans l’aiguille. Montez l’aiguille dans un micromanipulateur monté sur un support magnétique et connectez-la à un micro-injecteur à pompe PICO.

Ensuite, à l’aide d’une pince, cassez la pointe d’une aiguille à un angle de 45 degrés en pinçant la pointe effilée. Ajustez la taille du bolus d’injection à un nanolitre en ajustant le temps d’injection sur le contrôleur de pompe PICO. Ajustez l’angle de l’aiguille de micro-injection sur le contrôleur de micromanipulation, en commençant par 45 degrés avec l’aiguille parallèle à la longueur de l’embryon.

Un angle plus raide peut être utilisé pour minimiser le mouvement latéral de l’embryon pendant la micro-injection. En contrôlant la boîte de Pétri avec la main gauche, et le micromanipulateur nécessaire avec la droite, amenez l’aiguille aussi près que possible du site de micro-injection prévu, tel que la vésicule otique. À l’aide du contrôleur de micromanipulation, insérez l’aiguille dans le tissu cible et utilisez la pédale de pompe PICO pour injecter le volume prédéfini.

Si le tissu résiste à la pénétration, tapotez doucement le bouton du contrôleur de micromanipulation. Pour libérer les embryons, utilisez une pipette de transfert pour faire couler E-3 sur la surface de haut en bas, ou en faisant tourner le plat de manière à ce que les embryons soient libérés dans l’E-3 environnant. Transférez les embryons dans une boîte de récupération de E-3 sans MS-222.

Pour dépister les embryons à l’aide du dispositif PDMS dans les puits d’une plaque à six puits, utilisez une pipette de 1 000 microlitres ou une pipette de transfert à pointe étroite pour amorcer le dispositif en faisant passer E-3 à travers l’orifice. Utilisez E-3 et MS-222 pour remplir le puits jusqu’à ce que l’appareil soit couvert. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, vous pouvez introduire quatre embryons préalablement injectés dans chaque puits.

À l’aide d’une boucle de cheveux ou d’un outil similaire, positionnez les embryons à l’entrée des canaux d’imagerie dans l’orientation souhaitée et poussez-les partiellement dans l’appareil. Cela aidera à les attirer uniformément dans l’appareil. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres ou d’une pipette de transfert, aspirez E-3 à travers le dispositif à partir de l’orifice jusqu’à ce que les embryons soient aspirés dans les canaux dans la bonne orientation pour l’imagerie.

Transférez la plaque de puits dans un microscope à fluorescence inversée. Pour imager les embryons, ajustez le grossissement en sélectionnant l’objectif approprié, par exemple 10x pour l’imagerie de la migration du poisson-zèbre. Ajustez l’intensité de la source lumineuse et le temps d’exposition pour chaque canal, afin que chaque signal soit clair, mais pas saturé.

Enfin, capturez des images pour chaque canal fluorescent et transmis. En utilisant le dispositif de canal microstructuré pour stabiliser les embryons dans l’orientation latérale, la capacité des neutrophiles à répondre aux chimioattractants standard fMLP et LTB4 micro-injectés dans les vésicules otiques, d’embryons de poisson-zèbre deux jours après la fécondation, a été testée. Pour visualiser le recrutement des neutrophiles, des injections ont été tracées avec de la rhodamine dextran de haut poids moléculaire et réalisées dans des embryons transgéniques avec des neutrophiles fluorescents verts.

Des embryons non injectés et des embryons injectés avec de la rhodamine seule ont été utilisés comme témoins négatifs. Après la microinjection, les embryons ont été transférés dans le dispositif de canal d’imagerie et imagés à l’aide d’un microscope fluorescent EVOS 30 minutes et cinq heures après l’injection. Comme prévu, un petit nombre de neutrophiles fluorescents ont été recrutés dans la vésicule otique injectée simulée au début de l’étude, probablement en raison d’un recrutement médié endommagé.

Fait intéressant, on a observé que le traceur de rhodamine dextran s’accumulait dans les otolithes au cours de l’expérience. Pour les deux chimioattractants, les neutrophiles ont été recrutés en plus grand nombre, en particulier en réponse à LTB4. Une fois maîtrisée, cette technique peut grandement améliorer la vitesse et la précision de la micro-injection de poisson-zèbre.

Le développement de cette technique a été motivé par des défis spécifiques dans notre laboratoire. Nous avons affiné cette approche pour l’adapter aux besoins de nos projets sur les infections fongiques et les xénogreffes tumorales dans des modèles de poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les réseaux de surface microstructurés pour la micro-injection de poisson-zèbre et pour l’imagerie en direct étendue.