Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

L’objectif global de la stadification et de la dissection des tissus olfactifs pupilles et périphériens adultes en développement chez les espèces de drosophiles est de générer des échantillons pour des analyses moléculaires et développementales des tissus olfactifs périphériques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement et de l’évolution du système olfactif, telles que l’expression, la dynamique, les niveaux et les modèles de gènes spécifiques dans les tissus olfactifs périphériques en développement. Grâce à cette méthode, nous pouvons obtenir des informations sur le développement du système olfactif périphérique chez les espèces de drosophiles.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes sensoriels, tels que le goût périphérique et les systèmes visuels. Pour une expérience de séquençage de l’ARN, prévoyez de collecter entre 100 et 200 disques antennaires ou antennes pour quatre étapes de développement différentes. Pour l’immunohistochimie, prévoyez de disséquer 10 à 20 mouches.

Nettoyez tous les matériaux impliqués dans la dissection avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, nettoyez davantage les matériaux avec des neutralisants de RNase. Et fabriquez toutes les solutions en utilisant de l’eau sans nucléase ou traitée au DEPC.

Pour prélever des nymphes, surveillez les larves à des intervalles de 30 minutes. Et collectez la nymphe au stade de prénymphe APF de l’heure zéro. Les larves seront immobiles et entourées d’une nymphe très claire, presque de couleur blanche.

À ce stade, transférez les larves dans une petite boîte de Pétri de deux pouces avec un papier filtre humide. Pour les dissections de l’étage APF de zéro heure, procédez immédiatement au prélèvement du disque antennaire prénymphal. Sinon, couvrez le plat d’un film de paraffine et laissez les animaux se développer à 25 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’ils soient au stade de développement d’intérêt.

Pour accélérer le développement nymphal d’autres espèces de drosophiles, collectez les larves de nymphes de l’heure zéro et triez-les dans un flacon frais. Notez ensuite le nombre de jours entre la prépupe et l’âge adulte. Et il suffit d’adapter cette fois à la chronologie de melanogaster.

Pour commencer, refroidissez 150 microlitres de solution d’isolement d’ARN dans un tube de 1,5 millimètre sans RNase. Ensuite, déposez plusieurs gouttelettes distinctes de PBS sur le tampon de dissection. Dans chaque goutte de PBS, placez une chrysalide à disséquer.

Pour les pupes de zéro à deux heures, utilisez des pinces pour saisir les crochets buccaux et tirez sur ces structures pour arracher et exposer les cerveaux et les disques imaginaires. Pour les pupes de huit heures, retirez d’abord délicatement la boîte nymphale du quart le plus antérieur de la nymphe, pour exposer la tête en développement. Détachez ensuite la tête au niveau de l’articulation du cou.

Les disques antennaires sont dans la tête à ce stade de développement. Transférez maintenant les tissus contenant les disques antennaires dans une autre gouttelette de PBS. Ensuite, identifiez le disque antennaire de l’œil relié au cerveau au niveau des lobes optiques.

À l’aide d’une pince, débranchez le disque antennaire de l’œil et transférez-le dans une nouvelle gouttelette. Dans les pupes de huit heures, les disques oculaires coupent les disques antennaires et les deux sont antérieurs au cerveau. Dans la gouttelette suivante, divisez l’œil et les disques antennaires à l’aide d’une pince.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette P20, prélevez délicatement le tissu disséqué avec une quantité minimale de liquide. Déposez le disque dans le réactif de solution d’isolement de l’ARN et continuez à disséquer les disques antennaires jusqu’à ce qu’au moins 100 disques soient recueillis. 40 heures après la formation de la nymphe, l’antenne adulte a pris sa forme finale, mais elle est toujours transparente.

Au moins 50 prénymphes à ce stade sont nécessaires pour la collecte de séquences d’ARN. Préparez d’abord 150 microlitres de solution d’isolement d’ARN réfrigérée. Sur le tampon de dissection, placez une chrysalide dans une gouttelette de PBS.

Ensuite, stabilisez le corps à l’aide d’une paire de pinces et décollez doucement la nymphe du quart le plus antérieur pour exposer la tête. Ensuite, retirez soigneusement la tête au niveau de l’articulation du cou. Maintenant, transférez doucement la tête dans une gouttelette propre de PBS.

Là, pour retirer la membrane entourant la tête, faites pipper la tête de haut en bas dans le PBS. Avec ce nettoyage, l’antenne devrait devenir visible. Déconnectez maintenant l’antenne de la membrane entre le deuxième et le troisième segment au niveau de l’articulation segmentaire.

Le troisième segment contient les récepteurs olfactifs antennaires. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez doucement le tissu disséqué dans la solution d’isolement de l’ARN, en minimisant la quantité de liquide transférée. Pour l’extraction de l’ARN, disséquez des adultes pendant qu’ils sont anesthésiés sur un tampon CO2.

Tout d’abord, traitez le tampon de CO2 et la pince avec des inhibiteurs de RNase. Ensuite, anesthésez les adultes et observez le tampon sous un microscope de dissection. À l’aide de deux paires de pinces, stabilisez le corps et tirez ou pincez doucement le troisième segment antennaire du deuxième segment antennaire pour recueillir les tissus.

Transférez les antennes dans un tube de solution d’isolement d’ARN en trempant la pince dans le liquide et en relâchant. L’antenne doit être immergée. Si l’antenne se colle à la paroi latérale, l’ARN se dégradera prématurément.

Après avoir collecté suffisamment d’antennes, procédez à l’extraction de l’ARN. Ou stockez le tube de collecte à 80 degrés Celsius indéfiniment. Si les antennes sont destinées à l’immunohistochimie, effectuez cette dissection sur un coussin de dissection avec la mouche immergée dans du PBS avec ou sans Triton.

Le tissu olfactif en développement disséqué peut être utilisé pour l’extraction de l’ARN suivie d’une RT-PCR afin d’évaluer l’expression des gènes. Par exemple, l’expression des transcrits des récepteurs de surface et des transcrits des récepteurs olfactifs peut être étudiée de cette manière. Alternativement, les tissus peuvent être utilisés pour l’immunohistochimie afin de déterminer le profil d’expression et la localisation subcellulaire des gènes d’intérêt.

Par exemple, les mouches transgéniques Rn-EGFP peuvent être colorées avec des anticorps anti-GFP et anti-laminine. L’analyse montre que 40 heures après la formation de la nymphe, le gène Or67d est actif dans des cellules spécifiques de l’antenne, entraînant l’expression de la GFP sous le système GAL4-UAS. Une fois maîtrisées, les dissections peuvent être faites en une heure si elles sont effectuées correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le temps et de planifier de manière appropriée la cueillette, le vieillissement et la dissection, en fonction du calendrier de développement de la nymphe pour chaque espèce de drosophile. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la qRT-PCR, l’immunohistochimie, ainsi que d’autres techniques de coloration in vivo et de profilage transcriptionnel peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le modèle et les profils de transcription au niveau des systèmes au sein d’un tissu en développement. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’évolution et du développement des systèmes sensoriels pour explorer la dynamique transcriptionnelle et la découverte de nouveaux gènes dans d’autres systèmes sensoriels chez les espèces de drosophiles.

N’oubliez pas que travailler avec des pinces tranchantes, certaines solutions d’extraction d’ARN et du formaldéhyde peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que la pratique préalable des dissections, le développement de la motricité fine, une grande attention et le port de vêtements de laboratoire appropriés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.