Name: La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez une méthode complète de préparation d'embryons de Drosophila pour la visualisation du système nerveux embryonnaire par immunofluorescence. Ce protocole permet d'étudier le développement neuronal et les effets des mutations génétiques.

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SG est soutenu par des fonds de l&#39;Université d&#39;État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le Tampon PEMFA l'aide de canaux 100 mM, EGTA 2 mM, et 1 mM MgSO 4. Ajuster le pH du tampon à 7,0. Le tampon est PEMFA filtre stérilisé et stocké à 4 ° C. </li><li> Préparer PBT en ajoutant 1 ml de Triton X-100 à 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer 5% de BSA (sérum albumine bovine) avec NaAcide 0,01% dans du PBS 1X (pH 7,0). </li><li> Préparer la solution saline à l'aide de NaCl 0,7% et 0,03% de Triton X-100 dans de l'eau déminéralisée. </li><li> Préparer le fixatif en combinant 4 pièces tampons PEMFA avec 1 partie de formaldéhyde 37%. </li></ol> 2. Collecte d'embryons <ol><li> Préparer une cage pour la souche de drosophile d'intérêt en plaçant&gt; 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur d'alimentation avec plaque de gélose. </li><li> Laisser la cage de mouches dans l'obscurité à température ambiante pendant 72 heures, en changeant les plaques toutes les 8-12 heures, de sorte que les mouches s'acclimater à la cage et ne détiennent pas leurs oeufs. </li><li> Pour l'expérience de collecter des embryons pendant 12 heures. Retirer la boîte de Pétri à partir du conteneur et de le remplacer. Prenez la boîte de Pétri enlevé et laver les embryons hors du plat en utilisant la solution saline et un pinceau propre. </li><li> Recueillir les embryons dans une passoire fine. Rincer avec une solution saline pour enlever tout excès de levures. </li><li> En utilisant une spatule délicatement ramasser les embryons et les placer dans un petit flacon de verre avec un capuchon. Ajouter environ 1 ml de solution saline. </li></ol> 3. Retrait des membranes chorion et vitelline et de fixation <ol><li> Après la collecte des embryons, préparer la solution Heptane-Fix en combinant 50% d'heptane et fixateur de 50%. La solution sera en couches avec l'heptane sur le dessus et le fixatif sur le fond. </li><li> Dans le flacon en verre laver les embryons en les incubant dans la solution saline pendant 5 minutes. Retirer l'excès salins aide d'une pipette Pasteur. </li><li> Rincez les embryons avec de l'eau déminéralisée. </li><li> Dechorionate les embryons en les incubant dans l'eau de Javel à 50% pendant 3 minutes. </li><li> Rincez abondamment avec de l'embryon de l'eau déminéralisée. </li><li> Fixer les embryons en les incubant pendant 30 minutes dans la solution d'heptane-Fix en agitant doucement. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur remplacer le fixateur (couche inférieure) avec du méthanol en laissant l'heptane dans le tube. Agiter vigoureusement pour enlever la membrane vitelline. Les embryons seront devitellinized couler au fond du tube. </li><li> Recueillir les embryons dans un flacon en verre de nouvelles en utilisant une pipette Pasteur. Rincez les embryons cinq fois avec du méthanol, à chaque fois incuber les embryons pendant 5 minutes. </li></ol> 4. Coloration des anticorps, de montage et de visualisation <ol><li> Réhydrater les embryons dans un mélange de solution PBT 50% et 50% de méthanol pendant 5 minutes. Puis réhydrater en solution PBT 100% pendant 5 minutes. </li><li> Bloquer les embryons en les incubant dans du BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01% pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Les embryons sont maintenant prêts pour la coloration des anticorps. Préparer l'anticorps primaire en le diluant à la concentration appropriée en utilisant la BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01%. Nous utilisons un anticorps contre la protéine chaîne de cystéine (CSP), une protéine vésiculaire synaptique et un anticorps anti-HRP ou la peroxydase de raifort, qui reconnaît un neuronaux spécifiques en glucides présents dans le fragment de glycoprotéines de surface et les étiquettes tous les neurones. </li><li> Incuber les embryons nuit à 4 ° C dans la solution d'anticorps primaire. </li><li> Le lendemain, lavez les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure. </li><li> Préparer la solution d'anticorps secondaire par dilution de la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps Alexa secondaires à une concentration de 1:200. </li><li> Incuber les embryons pendant deux heures dans 4 ° C dans la solution d'anticorps secondaire. </li><li> Laver les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure. </li><li> Incuber les embryons nuit dans un milieu Vectashield montage. </li><li> Montez les embryons sur une lame de verre et de sceller la lamelle avec du vernis à ongles. Visualisez embryons en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Fusionnées Figure 1: Un représentant des images montrant le SNC embryonnaire au stade 16-17, utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez la coloration distincte de la commissure. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> HRP-FITC "/&gt; Fusionnées Figure 2: Un des images représentatives montrant le PNS embryon au stade 16 à 17 en utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez les régularités répétées des neurones périphériques.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

L&#39;embryon de drosophile est un système puissant pour étudier les modifications cellulaires et moléculaires au cours du développement neuronal. Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer embryons monter ensemble pour l&#39;immunohistochimie. Nous avons adapté ce protocole à partir du protocole décrit dans Carroll et Scott, 1985. Ce protocole peut également être adapté pour tester d&#39;autres anticorps neuronale, mais l&#39;optimisation des anticorps devrait être fait. De plus, des anomalies du ...

<table><tbody><tr><td>Formaldéhyde à 37 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-IgG de chèvre dirigé contre la souris</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage drosophile embryons

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

L&#39;embryon de drosophile est un système modèle intéressant pour étudier les bases cellulaires et moléculaires du développement neuronal. Nous décrivons ici la procédure pour la visualisation de la drosophile embryonnaire du système nerveux en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines neuronales. Depuis la toute embryonnaire nerveux périphérique et le système nerveux central sont bien caractérisés au niveau des cellules individuelles (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), les aberrations de ces systèmes peuvent être facilement identifiés à l&#39;aide des anticorps contre différentes protéines neuronales. Les embryons en développement sont collectées à certains moments afin de s&#39;assurer que les embryons sont au stade de développement approprié pour la visualisation. Après la collecte, les couches externes de l&#39;embryon, la membrane chorion et l&#39;enveloppe vitelline qui entoure l&#39;embryon, sont enlevés avant la fixation. Les embryons sont ensuite incubés avec des anticorps neuronale et visualisés en utilisant des anticorps marqués par fluorescence secondaire. Les embryons à des stades de 12 à 17 sont visualisés pour accéder au système embryonnaire nerveux. Au stade 12 la bande de germe de SNC commence le shortening et par l&#39;étape 15 du modèle définitif de la commissure a été atteint. Au stade 17 les contrats SNC et le SNP est entièrement développé (Campos-Ortega et al. 1985). Ainsi, les variations dans la structure de la SNP et du SNC peuvent être facilement observés au cours de ces stades de développement.

Nous décrivons la procédure pour préparer scène<em&gt; Drosophile</em&gt; Embryons pour la visualisation du système nerveux embryonnaire, lors de l&#39;embryogenèse.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

L'embryon de Drosophila est un système modèle attrayant pour étudier les bases cellulaires et moléculaires du développement neuronal. Nous décrivons ici le...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des embryons d’oph et de melanogaster pour une visualisation en montage complet du système nerveux. Cela est réalisé en premier lieu en collectant les embryons à partir de la souche de drosophiles d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer le corium à l'aide d'eau de Javel.La troisième étape de la procédure consiste à appliquer de l'heptane et du méthanol pour éliminer la membrane vitelline. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer des anticorps sur les embryons. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la structure du système nerveux de l'embryon de drosophile par microscopie en immunofluorescence.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme le rôle que peuvent jouer les mutations dans le système nerveux en développement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles risquent de pipeter accidentellement les embryons hors du flacon. Commencez ce protocole en préparant les réactifs nécessaires, notamment le P-E-M-F-A, le tampon PBC 5 % BSA avec une solution saline contenant 0

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Drosophila melanogaster larves fournir un système modèle idéal pour étudier les mécanismes du transport axonal dans les larves de nerfs segmentaires. En utilisant cette procédure, 3 e stade larvaire porteuses de mutations différentes peuvent être comparés à des larves de type sauvage.

Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3 Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Nous présentons ici un protocole de montage pour...

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Source : Jeong, S. Visualisation du modèle de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la visualisation des projections axonales dans les embryons de Drosophila. L’immunomarquage des motoneurones, la dissection précise pour exposer les structures neuronales et la microscopie à contraste d’interférence différentielle révèlent collectivement une architecture neuronale détaillée, mettant l’accent sur les modèles de projection axonale.

Visualisation des modèles de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez la drosophile

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l'innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Ce protocole décrit trois étapes pour préparer les lobes optiques de la drosophile larvaire et adulte à l’imagerie : 1) dissections cérébrales, 2) immunohistochimie et 3) montage. L’accent est mis sur l’étape 3, car des orientations de montage distinctes sont nécessaires pour visualiser des structures spécifiques du lobe optique.

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Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

Découvrez une méthode complète de préparation d'embryons de Drosophila pour la visualisation du système nerveux embryonnaire par immunofluorescence. Ce protocole permet d'étudier le développement neuronal et les effets des mutations génétiques.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

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