La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

L’objectif global de cette procédure est de préparer les embryons d’oph et de melanogaster pour la visualisation de l’ensemble du système nerveux. Pour ce faire, il faut d’abord prélever des embryons de la souche de mouche d’intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à enlever le corium avec de l’eau de Javel.

La troisième étape de la procédure consiste à appliquer de l’heptane et du méthanol pour enlever la membrane de viline. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer des anticorps sur les embryons. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la structure du système nerveux de l’embryon de drosophile grâce à la microscopie par immunofluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que le rôle que les mutations peuvent jouer dans le développement du système nerveux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à sortir accidentellement des embryons du flacon. Commencez ce protocole en préparant les réactifs qui seront nécessaires, y compris P-E-M-F-A, tampon PBC 5 % BSA avec une solution saline d’azoture de sodium à 0,01 % et un fixateur de formaldéhyde.

Préparez une cage pour la souche de drosophile d’intérêt en assommant les mouches avec du dioxyde de carbone, puis en transférant au moins 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur avec une plaque d’alimentation en gélose au jus de pomme. Placez la cage à mouches dans l’obscurité à température ambiante pendant 72 heures. Changez les plaques d’alimentation en gélose au jus de pomme toutes les huit à 12 heures afin que les mouches s’acclimatent à la cage et ne retiennent pas leurs œufs pour l’expérience.

Après la période d’acclimatation de 72 heures, prélever les embryons 12 heures après le dernier changement de la plaque d’alimentation en gélose au jus de pomme. Retirez la plaque d’alimentation en gélose au jus de pomme de la cage de ponte et remplacez-la par une solution saline. Rincez la plaque d’alimentation en gélose au jus de pomme.

Récupérez les embryons dans un tamis fin. À l’aide d’un pinceau propre, délogez les embryons qui restent collés à l’assiette. Rincez les embryons dans le tamis avec une solution saline pour éliminer tout excès de levure à l’aide d’une spatule, ramassez doucement les embryons et placez-les dans un petit flacon en verre.

Ajouter environ un millilitre de solution saline. Ensuite, fermez le flacon et incubez pendant cinq minutes pour laver les embryons. Suite à la collecte d’embryons.

Préparez la solution fixe d’heptane en combinant 50 % d’heptane et 50 % de fixateur. La solution sera recouverte d’heptane sur le dessus et de fixateur sur le dessous. Après cinq minutes, utilisez une pipette à pâtes pour retirer l’excès de solution saline du flacon en verre des embryons.

Rincez les embryons avec de l’eau déminéralisée en appliquant environ un millilitre d’eau déminéralisée sur le flacon en verre contenant les embryons. Laissez les embryons reposer pendant une minute avant de retirer l’eau à une solution d’eau de Javel à 50 %. Secouez le flacon plusieurs fois à la main, puis incubez pendant trois minutes afin d’enrober les embryons.

Les embryons cuits couleront au fond du flacon. Les COR embryonnaires flotteront. Retirez l’eau de Javel et les COR après l’incubation de trois minutes.

Après la décoration, rincez abondamment les embryons avec de l’eau déminéralisée en appliquant environ un millilitre d’eau déminéralisée sur le flacon en verre contenant les embryons. Laissez les embryons reposer pendant une minute avant de retirer l’eau restante. Les CORs flotteront et devront être retirés. Ajoutez la solution de fixation d’heptane aux embryons et incubez-les pendant 30 minutes en les secouant doucement pour les fixer après la fixation.

Utilisez une pipette à pâtes pour retirer le fixateur, qui est la couche inférieure, en laissant l’heptane dans le tube. Ensuite, ajoutez du méthanol au fond du tube à la place du fixateur et bouchez le tube, secouez vigoureusement à la main pour retirer la membrane vitelline. Suite à cette étape, les embryons isés couleront au fond du tube.

À l’aide d’une pipette à pâtes, retirez le méthanol et les hets du flacon, laissant derrière eux les embryons désionisés. Ensuite, rincez les embryons cinq fois avec du méthanol, en enlevant le méthanol avec une pipette à pâtes entre chaque rinçage. Pour chaque rinçage, incubez les embryons pendant cinq minutes.

Placez les embryons dans un mélange de solution 50 % PBT et 50 % de méthanol pendant cinq minutes pour les réhydrater. Poursuivez ensuite le processus de réhydratation en les transférant dans une solution 100 % PBT pendant cinq minutes. Ensuite, bloquez les embryons en les incubant dans une solution d’azoture de sodium à 5 % BSA avec 0,01 % pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Ensuite, préparez l’anticorps primaire pour la coloration de l’embryon en le diluant à la concentration appropriée à l’aide d’une solution d’azoture de sodium à 5 % BSA et à 0,01 %. Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre la protéine vésiculaire de la chaîne de cystéine et l’anticorps anti-HRP. L’anti-HRP reconnaît une fraction glucidique spécifique des neurones présente dans les glycoprotéines de surface, qui marque tous les neurones.

Incuber les embryons pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans la solution d’anticorps primaires. Lavez les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure. En appliquant environ un millilitre de PBT sur le flacon en verre contenant les embryons, laissez les embryons reposer pendant six minutes avant de retirer le PBT.

Répétez ce processus d’application du PBT, d’incubation et d’élimination du PBT 10 fois. Préparez la solution d’anticorps secondaire dans l’obscurité car elle est sensible à la lumière en la diluant à la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps secondaires Alexa à une concentration de un à 200.

Incuber les embryons pendant deux heures à quatre degrés Celsius dans la solution d’anticorps secondaires. Enveloppez le flacon en verre des embryons et la solution d’anticorps secondaires dans du papier d’aluminium afin d’éviter l’exposition à la lumière. Lavez les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure.

Ajoutez un milieu de montage de bouclier vectoriel aux embryons et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Utilisez une pipette pastel pour aspirer les embryons avec une partie du support de montage. Appliquez les embryons et le milieu sur une lame de verre.

Appliquez une lamelle sur les embryons et scellez-la avec du vernis à ongles. Visualisez les embryons à l’aide d’un microscope à fluorescence ici. Le SNC embryonnaire est montré aux stades 16 et 17

La protéine de chaîne de cystine est représentée en rouge. Les neurones HRP sont représentés en vert. Notez la coloration distincte de la commissure dans cette image représentative.

Le SNP embryonnaire est montré aux stades 16 ou 17. Encore une fois, la protéine de la chaîne de cystine est représentée en rouge et les neurones sont indiqués en vert. Notez les modèles répétés de neurones périphériques.

Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’être conscient des embryons afin de ne pas les retirer accidentellement du flacon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les embryons oph fla pour la visualisation de l’ensemble du système nerveux.