Name: La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez une méthode complète de préparation d'embryons de Drosophila pour la visualisation du système nerveux embryonnaire par immunofluorescence. Ce protocole permet d'étudier le développement neuronal et les effets des mutations génétiques.

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SG est soutenu par des fonds de l&#39;Université d&#39;État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le Tampon PEMFA l'aide de canaux 100 mM, EGTA 2 mM, et 1 mM MgSO 4. Ajuster le pH du tampon à 7,0. Le tampon est PEMFA filtre stérilisé et stocké à 4 ° C. </li><li> Préparer PBT en ajoutant 1 ml de Triton X-100 à 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer 5% de BSA (sérum albumine bovine) avec NaAcide 0,01% dans du PBS 1X (pH 7,0). </li><li> Préparer la solution saline à l'aide de NaCl 0,7% et 0,03% de Triton X-100 dans de l'eau déminéralisée. </li><li> Préparer le fixatif en combinant 4 pièces tampons PEMFA avec 1 partie de formaldéhyde 37%. </li></ol> 2. Collecte d'embryons <ol><li> Préparer une cage pour la souche de drosophile d'intérêt en plaçant&gt; 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur d'alimentation avec plaque de gélose. </li><li> Laisser la cage de mouches dans l'obscurité à température ambiante pendant 72 heures, en changeant les plaques toutes les 8-12 heures, de sorte que les mouches s'acclimater à la cage et ne détiennent pas leurs oeufs. </li><li> Pour l'expérience de collecter des embryons pendant 12 heures. Retirer la boîte de Pétri à partir du conteneur et de le remplacer. Prenez la boîte de Pétri enlevé et laver les embryons hors du plat en utilisant la solution saline et un pinceau propre. </li><li> Recueillir les embryons dans une passoire fine. Rincer avec une solution saline pour enlever tout excès de levures. </li><li> En utilisant une spatule délicatement ramasser les embryons et les placer dans un petit flacon de verre avec un capuchon. Ajouter environ 1 ml de solution saline. </li></ol> 3. Retrait des membranes chorion et vitelline et de fixation <ol><li> Après la collecte des embryons, préparer la solution Heptane-Fix en combinant 50% d'heptane et fixateur de 50%. La solution sera en couches avec l'heptane sur le dessus et le fixatif sur le fond. </li><li> Dans le flacon en verre laver les embryons en les incubant dans la solution saline pendant 5 minutes. Retirer l'excès salins aide d'une pipette Pasteur. </li><li> Rincez les embryons avec de l'eau déminéralisée. </li><li> Dechorionate les embryons en les incubant dans l'eau de Javel à 50% pendant 3 minutes. </li><li> Rincez abondamment avec de l'embryon de l'eau déminéralisée. </li><li> Fixer les embryons en les incubant pendant 30 minutes dans la solution d'heptane-Fix en agitant doucement. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur remplacer le fixateur (couche inférieure) avec du méthanol en laissant l'heptane dans le tube. Agiter vigoureusement pour enlever la membrane vitelline. Les embryons seront devitellinized couler au fond du tube. </li><li> Recueillir les embryons dans un flacon en verre de nouvelles en utilisant une pipette Pasteur. Rincez les embryons cinq fois avec du méthanol, à chaque fois incuber les embryons pendant 5 minutes. </li></ol> 4. Coloration des anticorps, de montage et de visualisation <ol><li> Réhydrater les embryons dans un mélange de solution PBT 50% et 50% de méthanol pendant 5 minutes. Puis réhydrater en solution PBT 100% pendant 5 minutes. </li><li> Bloquer les embryons en les incubant dans du BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01% pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Les embryons sont maintenant prêts pour la coloration des anticorps. Préparer l'anticorps primaire en le diluant à la concentration appropriée en utilisant la BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01%. Nous utilisons un anticorps contre la protéine chaîne de cystéine (CSP), une protéine vésiculaire synaptique et un anticorps anti-HRP ou la peroxydase de raifort, qui reconnaît un neuronaux spécifiques en glucides présents dans le fragment de glycoprotéines de surface et les étiquettes tous les neurones. </li><li> Incuber les embryons nuit à 4 ° C dans la solution d'anticorps primaire. </li><li> Le lendemain, lavez les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure. </li><li> Préparer la solution d'anticorps secondaire par dilution de la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps Alexa secondaires à une concentration de 1:200. </li><li> Incuber les embryons pendant deux heures dans 4 ° C dans la solution d'anticorps secondaire. </li><li> Laver les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure. </li><li> Incuber les embryons nuit dans un milieu Vectashield montage. </li><li> Montez les embryons sur une lame de verre et de sceller la lamelle avec du vernis à ongles. Visualisez embryons en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Fusionnées Figure 1: Un représentant des images montrant le SNC embryonnaire au stade 16-17, utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez la coloration distincte de la commissure. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> HRP-FITC "/&gt; Fusionnées Figure 2: Un des images représentatives montrant le PNS embryon au stade 16 à 17 en utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez les régularités répétées des neurones périphériques.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

L&#39;embryon de drosophile est un système puissant pour étudier les modifications cellulaires et moléculaires au cours du développement neuronal. Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer embryons monter ensemble pour l&#39;immunohistochimie. Nous avons adapté ce protocole à partir du protocole décrit dans Carroll et Scott, 1985. Ce protocole peut également être adapté pour tester d&#39;autres anticorps neuronale, mais l&#39;optimisation des anticorps devrait être fait. De plus, des anomalies du ...

<table><tbody><tr><td>Formaldéhyde à 37 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-IgG de chèvre dirigé contre la souris</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage drosophile embryons

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

L&#39;embryon de drosophile est un système modèle intéressant pour étudier les bases cellulaires et moléculaires du développement neuronal. Nous décrivons ici la procédure pour la visualisation de la drosophile embryonnaire du système nerveux en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines neuronales. Depuis la toute embryonnaire nerveux périphérique et le système nerveux central sont bien caractérisés au niveau des cellules individuelles (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), les aberrations de ces systèmes peuvent être facilement identifiés à l&#39;aide des anticorps contre différentes protéines neuronales. Les embryons en développement sont collectées à certains moments afin de s&#39;assurer que les embryons sont au stade de développement approprié pour la visualisation. Après la collecte, les couches externes de l&#39;embryon, la membrane chorion et l&#39;enveloppe vitelline qui entoure l&#39;embryon, sont enlevés avant la fixation. Les embryons sont ensuite incubés avec des anticorps neuronale et visualisés en utilisant des anticorps marqués par fluorescence secondaire. Les embryons à des stades de 12 à 17 sont visualisés pour accéder au système embryonnaire nerveux. Au stade 12 la bande de germe de SNC commence le shortening et par l&#39;étape 15 du modèle définitif de la commissure a été atteint. Au stade 17 les contrats SNC et le SNP est entièrement développé (Campos-Ortega et al. 1985). Ainsi, les variations dans la structure de la SNP et du SNC peuvent être facilement observés au cours de ces stades de développement.

Nous décrivons la procédure pour préparer scène<em&gt; Drosophile</em&gt; Embryons pour la visualisation du système nerveux embryonnaire, lors de l&#39;embryogenèse.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

L'embryon de Drosophila est un système modèle attrayant pour étudier les bases cellulaires et moléculaires du développement neuronal. Nous décrivons ici le...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des embryons d’oph et de melanogaster pour une visualisation en montage complet du système nerveux. Cela est réalisé en premier lieu en collectant les embryons à partir de la souche de drosophiles d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer le corium à l'aide d'eau de Javel.La troisième étape de la procédure consiste à appliquer de l'heptane et du méthanol pour éliminer la membrane vitelline. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer des anticorps sur les embryons. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la structure du système nerveux de l'embryon de drosophile par microscopie en immunofluorescence.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme le rôle que peuvent jouer les mutations dans le système nerveux en développement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles risquent de pipeter accidentellement les embryons hors du flacon. Commencez ce protocole en préparant les réactifs nécessaires, notamment le P-E-M-F-A, le tampon PBC 5 % BSA avec une solution saline contenant 0,01 % d'azoture de sodium et le fixateur au formaldéhyde.Préparez une cage pour la souche de drosophile d'intérêt en anesthésiant les mouches au dioxyde de carbone, puis en transférant au moins 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur muni d'une plaque de nourriture en gélose au jus de pomme. Placez la cage de mouches à l'obscurité à température ambiante pendant 72 heures. Remplacez les plaques de nourriture en gélose au jus de pomme toutes les huit à douze heures afin que les mouches s'acclimatent à la cage et ne retiennent pas leurs œufs pour l'expérience.Après la période d'acclimatation de 72 heures, collectez les embryons 12 heures après le dernier changement de la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme. Retirez la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme de la cage de ponte et remplacez-la par une solution saline. Rincez la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme.Recueillir les embryons dans une passoire fine. Utiliser un pinceau propre pour détacher les embryons éventuellement restés collés à la boîte. Rincer les embryons dans la passoire avec de la solution saline pour éliminer toute levure excédentaire à l’aide d’une spatule, puis les prélever délicatement et les placer dans un petit flacon en verre.Ajoutez environ un millilitre de solution saline. Ensuite, fermez le flacon et incubez pendant cinq minutes pour laver les embryons. Après la collecte des embryons.Préparez la solution fixative à l'heptane en mélangeant 50 % d'heptane et 50 % de fixatif. La solution se stratifiera avec l'heptane en haut et le fixatif en bas. Après cinq minutes, utilisez une pipette en plastique pour retirer l'excès de solution saline du flacon en verre contenant les embryons.Rincez les embryons avec de l'eau déionisée en appliquant environ un millilitre d'eau déionisée dans le flacon en verre contenant les embryons. Laissez les embryons reposer pendant une minute avant de retirer l'eau à l'aide d'une solution d'eau de javel à 50 %. Secouez le flacon plusieurs fois à la main, puis incubez pendant trois minutes afin d'enrober les embryons.Les embryons désenveloppés couleront au fond du flacon. Les coquilles d'embryons (COR) flotteront. Éliminez l'eau de Javel et les COR après une incubation de trois minutes.Après la décoration, rincer soigneusement les embryons avec de l'eau déionisée en appliquant environ un millilitre d'eau déionisée dans le flacon en verre contenant les embryons. Laisser reposer les embryons pendant une minute avant d'éliminer l'eau ; les COR résiduelles flotteront et doivent être retirées. Ajouter la solution de fixation à l'heptane aux embryons et les incuber pendant 30 minutes avec agitation douce pour les fixer après la fixation.Utilisez une pipette à pâte pour retirer le fixateur, qui constitue la couche inférieure, en laissant l'heptane dans le tube. Ensuite, ajoutez du méthanol au fond du tube en remplacement du fixateur et fermez le tube. Secouez vigoureusement à la main pour éliminer la membrane vitelline. À la suite de cette étape, les embryons fixés couleront au fond du tube.À l’aide d’une pipette à pâtes, retirez le méthanol et les hets du flacon en laissant les embryons désionisés. Rincez ensuite les embryons cinq fois avec du méthanol, en éliminant le méthanol à l’aide d’une pipette à pâtes entre chaque rinçage. Pour chaque rinçage, incubez les embryons pendant cinq minutes.Placer les embryons dans un mélange composé de 50 % de solution PBT et de 50 % de méthanol pendant cinq minutes afin de les réhydrater. Poursuivre ensuite le processus de réhydratation en les transférant dans une solution PBT à 100 % pendant cinq minutes. Bloquer ensuite les embryons en les incubant dans une solution contenant 5 % de BSA et 0,01 % d'azoture de sodium pendant une heure à quatre degrés Celsius.Ensuite, préparez l'anticorps primaire pour la coloration des embryons en le diluant à la concentration appropriée à l'aide d'une solution de BSA à 5 % contenant 0,01 % d'azoture de sodium. Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre la protéine vésiculaire liant la cystéine et l'anticorps anti-HRP. L'anti-HRP reconnaît une structure glucidique neuronale spécifique présente dans les glycoprotéines de surface, ce qui permet de marquer tous les neurones.Incuber les embryons toute la nuit à quatre degrés Celsius dans la solution d'anticorps primaire. Laver les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure. En appliquant environ un millilitre de PBT dans le flacon en verre contenant les embryons, laisser les embryons reposer pendant six minutes avant d'éliminer le PBT.Répétez ce processus d'application du PBT, d'incubation et de retrait du PBT dix fois. Préparez la solution d'anticorps secondaire à l'abri de la lumière, car elle est sensible à la lumière, en la diluant à la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps secondaires Alexa à une concentration de un à 200.Incuber les embryons pendant deux heures à quatre degrés Celsius dans la solution d'anticorps secondaire. Envelopper le flacon en verre contenant les embryons et la solution d'anticorps secondaire dans du papier d'aluminium afin d'éviter toute exposition à la lumière. Laver les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure.Ajouter du milieu de montage avec agent de protection antifade sur les embryons et les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius pour les monter. Utiliser une pipette pastel pour aspirer les embryons avec une partie du milieu de montage. Déposer les embryons et le milieu sur une lame en verre.Appliquer une lame couvre-objet sur les embryons et sceller la lame avec du vernis à ongles. Visualiser les embryons à l’aide d’un microscope à fluorescence ici. Le SNC embryonnaire est montré aux stades 16 à 17.La protéine à chaîne de cystine est indiquée en rouge. Les neurones HRP sont indiqués en vert. Remarquez la coloration distincte du commissure sur cette image représentative.Le SNP embryonnaire est montré au stade 16 à 17. Là encore, la protéine à chaîne de cystine apparaît en rouge, et les neurones apparaissent en vert. Remarquez les motifs répétés des neurones périphériques.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de faire attention aux embryons afin de ne pas les retirer accidentellement du flacon. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des embryons oph fla pour une visualisation en montage entier du système nerveux.

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