La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

L'objectif général de cette procédure est de préparer des embryons d’oph et de melanogaster pour une visualisation en montage entier du système nerveux. Cela est réalisé en premier lieu en collectant les embryons à partir de la souche de drosophiles d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer le corium à l'aide d'eau de Javel.

La troisième étape de la procédure consiste à appliquer de l'heptane et du méthanol pour éliminer la membrane vitelline. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer des anticorps sur les embryons. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la structure du système nerveux de l'embryon de drosophile par microscopie en immunofluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme le rôle que peuvent jouer les mutations dans le système nerveux en développement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles risquent de pipeter accidentellement les embryons hors du flacon. Commencez ce protocole en préparant les réactifs nécessaires, notamment le P-E-M-F-A, le tampon PBC 5 % BSA avec une solution saline contenant 0,01 % d'azoture de sodium et le fixateur au formaldéhyde.

Préparez une cage pour la souche de drosophile d'intérêt en anesthésiant les mouches au dioxyde de carbone, puis en transférant au moins 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur muni d'une plaque de nourriture en gélose au jus de pomme. Placez la cage de mouches à l'obscurité à température ambiante pendant 72 heures. Remplacez les plaques de nourriture en gélose au jus de pomme toutes les huit à douze heures afin que les mouches s'acclimatent à la cage et ne retiennent pas leurs œufs pour l'expérience.

Après la période d'acclimatation de 72 heures, collectez les embryons 12 heures après le dernier changement de la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme. Retirez la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme de la cage de ponte et remplacez-la par une solution saline. Rincez la plaque de nourriture contenant l'agar à jus de pomme.

Recueillir les embryons dans une passoire fine. Utiliser un pinceau propre pour détacher les embryons éventuellement restés collés à la boîte. Rincer les embryons dans la passoire avec de la solution saline pour éliminer toute levure en excès à l’aide d’une spatule, puis prélever délicatement les embryons et les placer dans un petit flacon en verre.

Ajoutez environ un millilitre de solution saline. Ensuite, fermez le flacon et incubez pendant cinq minutes pour laver les embryons. Après la collecte des embryons.

Préparez la solution fixative à l'heptane en mélangeant 50 % d'heptane et 50 % de fixatif. La solution se stratifiera avec l'heptane en haut et le fixatif en bas. Après cinq minutes, utilisez une pipette en plastique pour éliminer l'excès de solution saline du flacon en verre contenant les embryons.

Rincez les embryons avec de l'eau déionisée en appliquant environ un millilitre d'eau déionisée dans le flacon en verre contenant les embryons. Laissez les embryons reposer pendant une minute avant de retirer l'eau à l'aide d'une solution d'eau de javel à 50 %. Secouez le flacon plusieurs fois à la main, puis incubez pendant trois minutes afin d'enrober les embryons.

Les embryons désenveloppés couleront au fond du flacon. Les enveloppes embryonnaires (COR) flotteront. Éliminez l'eau de Javel et les COR après une incubation de trois minutes.

Après la décoration, rincer soigneusement les embryons avec de l'eau déionisée en appliquant environ un millilitre d'eau déionisée dans le flacon en verre contenant les embryons. Laisser reposer les embryons pendant une minute avant d'éliminer l'eau ; les COR résiduelles flotteront et doivent être retirées. Ajouter la solution de fixation à l'heptane aux embryons et les incuber pendant 30 minutes avec agitation douce pour les fixer après la fixation.

Utilisez une pipette à pâtes pour retirer le fixateur, qui constitue la couche inférieure, en laissant l'heptane dans le tube. Ensuite, ajoutez du méthanol au fond du tube en remplacement du fixateur et fermez le tube. Secouez vigoureusement à la main pour éliminer la membrane vitelline. À la suite de cette étape, les embryons fixés couleront au fond du tube.

À l’aide d’une pipette à pâtes, retirez le méthanol et les hets du flacon en laissant derrière les embryons désionisés. Rincez ensuite les embryons cinq fois avec du méthanol, en éliminant le méthanol à l’aide d’une pipette à pâtes entre chaque rinçage. Pour chaque rinçage, incubez les embryons pendant cinq minutes.

Placer les embryons dans un mélange composé de 50 % de solution PBT et de 50 % de méthanol pendant cinq minutes afin de les réhydrater. Poursuivre ensuite le processus de réhydratation en les transférant dans une solution PBT à 100 % pendant cinq minutes. Bloquer ensuite les embryons en les incubant dans une solution contenant 5 % de BSA et 0,01 % d'azoture de sodium pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Ensuite, préparez l'anticorps primaire pour la coloration des embryons en le diluant à la concentration appropriée à l'aide d'une solution de BSA à 5 % contenant 0,01 % d'azoture de sodium. Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre la protéine vésiculaire à chaîne de cystéine et l'anticorps anti-HRP. L'anti-HRP reconnaît une partie glucidique neuronale spécifique présente dans les glycoprotéines de surface, ce qui marque tous les neurones.

Incuber les embryons toute la nuit à quatre degrés Celsius dans la solution d'anticorps primaire. Laver les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure. En appliquant environ un millilitre de PBT dans le flacon en verre contenant les embryons, laisser les embryons reposer pendant six minutes avant d'éliminer le PBT.

Répétez ce processus d'application du PBT, d'incubation et de retrait du PBT dix fois. Préparez la solution d'anticorps secondaire à l'abri de la lumière, car elle est sensible à la lumière, en la diluant à la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps secondaires Alexa à une concentration de un à 200.

Incuber les embryons pendant deux heures à quatre degrés Celsius dans la solution d'anticorps secondaire. Envelopper le flacon en verre contenant les embryons et la solution d'anticorps secondaire dans du papier d'aluminium afin d'éviter toute exposition à la lumière. Laver les embryons 10 fois avec du PBT pendant une heure.

Ajouter du milieu de montage avec agent de protection antifade aux embryons et les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius pour le montage. Utiliser une pipette pasteur pour aspirer les embryons avec une certaine quantité de milieu de montage. Déposer les embryons et le milieu sur une lame en verre.

Appliquez une lame couvre-objet sur les embryons et scellez-la avec du vernis à ongles. Observez les embryons à l'aide d'un microscope à fluorescence ici. Le SNC embryonnaire est montré aux stades 16 à 17.

La protéine à chaîne de cystine est indiquée en rouge. Les neurones HRP sont indiqués en vert. Remarquez la coloration distincte du commissure sur cette image représentative.

Le SNP embryonnaire est montré au stade 16 à 17. Là encore, la protéine cystine string apparaît en rouge, et les neurones apparaissent en vert. Remarquez les motifs répétés des neurones périphériques.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de faire attention aux embryons afin de ne pas les retirer accidentellement du flacon. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des embryons oph fla pour une visualisation en montage entier du système nerveux.