Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

Les neurones sensoriels de l'arborisation dendritique des

L’objectif général de cette procédure est de visualiser la morphologie détaillée des neurones drosophiles, larvaires, dendritiques, arborisés. Ceci est accompli en collectant d’abord des embryons, en les faisant vieillir et en générant des clones génétiques marqués à la GFP par l’expression de la lipase induite par le choc thermique. La deuxième étape consiste à sélectionner des larves avec des clones de neurones fluorescents et à prendre une image de leurs ABA dendritiques.

Après avoir imager la lave, ils sont disséqués, fixés et immuno-colorés afin qu’ils puissent être montés et que leurs ports dendritiques et leurs morphologies terminales axonales puissent être visualisés par microscopie confocale à immunofluorescence. Aujourd’hui, je vais démontrer un protocole d’analyse morphologique des OID et des exons des capteurs périphériques inférieurs de sula à l’aide de mos génétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neurodéveloppemental, telles que quels sont les programmes génétiques qui contrôlent l’identité neuronale, la forme orale dendritique et le câblage externe ?

Commencez ce protocole en recueillant des embryons sur des assiettes de jus de pomme. Le choc thermique est délivré dans un bain-marie à 38 degrés Celsius, et la durée varie en fonction de la génétique de l’embryon et de la taille des clones souhaitée. Pour ce protocole, générez des clones de markum à partir d’embryons avec un pilote de neurones d’arborisation dendritique avant le choc thermique, maintenez les embryons marqueurs à 25 degrés Celsius, entourés d’humidité et de tissus pendant deux heures.

Préparez les plaques de collecte pour les chocs thermiques en les rendant submersibles à l’aide de plaques vides et de para fill. Ensuite, la chaleur choque les embryons marqueurs pendant une heure pour générer de petits clones ou un marquage de neurone unique. Pour augmenter le nombre de clones, utilisez un choc thermique prolongé en incubant pendant 45 minutes dans le bain, suivi de 30 minutes à température ambiante, puis de 30 minutes supplémentaires dans le bain.

Pour générer des clones flipout, prélevez des embryons pendant 24 heures consécutives. Ce protocole utilise un pilote spécifique de classe quatre. Choquez les embryons retournés par la chaleur pendant une heure après le choc thermique.

Placez les plaques de prélèvement dans une boîte de Pétri de 10 centimètres entourée d’humidité et de tissus et de culture. Les embryons sont à 25 degrés Celsius pendant la culture des embryons, surveillez et reconstituez la pâte de levure au besoin. Parce que la nutrition affecte de manière critique le développement neuronal.

Maintenez la culture jusqu’à ce que la lave du troisième stade puisse être recueillie brièvement et rincez doucement les larves du troisième stade à l’eau du robinet et transférez-les sur une plaque de gélose. Examinez maintenant les larves à l’aide d’un puissant microscope à dissection de fluorescence et d’une pince à insectes. Identifiez les larves avec des neurones positifs à la GFP dans la paroi corporelle et transférez-les sur une lame de dépression avec une goutte de glycérol à 80 %.

Placez une lamelle sur la glissière pour immobiliser la lave. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’air entre la lave et la lamelle. Utilisez la microscopie confocale standard pour visualiser les neurones d’intérêt à travers la cuticule de lave.

Pour changer la position de la lave afin d’obtenir un meilleur angle de vue, appuyez doucement sur la lamelle pour faire rouler la lave. Commencez ce protocole en transférant une lave sur la plaque de protection SIL à l’aide d’une pince à insectes. Ensuite, fixez-le aux extrémités antérieure et postérieure.

Ajoutez ensuite le tampon HL 3.1 sans calcium. Maintenant, coupez à mi-chemin des deux extrémités de la lave perpendiculairement à l’axe antérieur postérieur. Coupez ensuite le long de la ligne médiane entre les deux trachées.

Coupez soigneusement chaque connexion trachéale individuelle à la paroi du corps avant de retirer doucement l’intestin. Cela permet de garder intacts les nerfs segmentaires qui circulent entre le SNP et le SNC. Avec la larve toujours épinglée à la plaque de garde de cellule, fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante sur un agitateur tournant doucement, effectuez chaque dissection en moins de cinq minutes.

Sinon, les nites des neurones d’autorisation dendritiques commenceront à se dégrader. Après la fixation, retirez les tissus larvaires en excès. Ensuite, lavez les filets trois fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage.

Après les lavages, incubez les larves pendant 20 minutes à température ambiante dans une solution de blocage en les secouant doucement. Une fois le bloc terminé, remplacez la solution de blocage par la solution d’anticorps primaire. Placez l’échantillon dans le petit récipient en plastique entouré d’humidité et de mouchoirs et incubez-le toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, continuez l’incubation pendant une heure supplémentaire à température ambiante.

Ensuite, lavez le filet de lave six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Ajoutez maintenant l’anticorps secondaire et placez les filets dans un récipient sombre pour éviter le photoblanchiment du Fluor. Incuber les filets pendant des heures à température ambiante ou une nuit à quatre degrés Celsius, suivis d’une heure à température ambiante.

Enfin, lavez les filets six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Les tissus sont alors prêts à être montés. Pour visualiser les terminaisons axonales, il suffit de monter la cuticule du filet larvaire côté vers le bas dans du glycérol à 80 % dans une lame de dépression.

Pour obtenir des images plus claires des dendrites, faites un passe-partout permanent avec des lamelles revêtues de PLL. Pour coder les lamelles de couverture et l’aliquote de PLL. Amenez-le jusqu’à 10 millilitres d’eau double distillée et ajoutez 20 microlitres de flux photo Kodak.

Immergez les lamelles de recouvrement pendant 30 minutes dans la solution PLL et séchez-les à l’air libre une fois retirées. Ensuite, rincez-les brièvement à l’eau et à l’air. Séchez-les à nouveau.

Répétez ce processus deux fois. En commençant par le bain PLL, les lamelles traitées dureront environ un mois. Montez maintenant un filet de larve disséqué, côté muscle vers le bas, dans une goutte de PBS sur une feuille de couverture PLL.

Le filet adhérera rapidement à la lamelle à l’aide d’un morceau de papier de soie. Retirez autant de liquide que possible, cependant, ne le laissez pas se dessécher complètement. Ensuite, des filets larvaires déshydratés et une série de bains d’éthanol de 10 minutes, en commençant par 35 % d’éthanol, suivis de 50 %, puis de 70 %, puis de 95 %, puis de 100 % et enfin d’un deuxième bain à 100 % d’éthanol.

Faites suivre les bains à l’éthanol de deux ou trois bains de 10 minutes au xylène. Ensuite, placez une goutte de DPX sur une diapositive propre et placez soigneusement le couvercle dans le DPX, remplissez-le côté vers le bas. Gardez la diapositive dans l’obscurité et attendez un jour que le DPX se mette en place.

Avant d’imager le tissu à l’aide de la microscopie in vivo et focale, il est possible de capturer des images comme celle-ci. L’arbre entier d’un neurone d’arborisation dendritique de classe quatre. Il s’agit d’un gros plan d’un arbre dendritique d’un neurone de classe trois marqué IHC qui a été correctement fixé pour préserver la morphologie.

L’encart montre la dégradation qui peut survenir après l’échec d’une dissection et d’une fixation. Cette superposition montre une seule terminaison axonale de classe quatre dans le SNC. L’axone est marqué avec de l’anti GFP en vert et tous les termites de classe quatre ont été co-colorés avec de l’anti CD deux en magenta.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer et de fixer rapidement les échantillons en traçant les axones de la périphérie au SNC. Il est utile de garder à l’esprit que les neurones SNP de chaque corps segmenteront le projet vers le segment cognitif du code nerveux de l’évent. De plus, si vous souhaitez uniquement visualiser les dendrites, retirez les CNA pendant la dissection, et la coloration peut être effectuée en appendice des tubes plutôt que sur des plaques.

Lors du montage de ces filets pour l’imagerie des dendrites, coupez d’abord la tête avec des crochets buccaux et le postérieur avec des étincelles. Pour une préparation plaisir.