Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la morphologie détaillée des neurones larvaires d'arborisation dendritique de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en collectant des embryons, en les faisant vieillir, puis en générant des clones génétiques marqués par la GFP grâce à une expression induite par choc thermique de la lipase. La deuxième étape consiste à sélectionner des larves possédant des clones neuronaux fluorescents et à acquérir une image de leurs arborisations dendritiques.

Après l’imagerie des larves, celles-ci sont disséquées, fixées et soumises à une coloration immunohistochimique afin d’être montées et de permettre la visualisation de la morphologie de leurs arborisations dendritiques et de leurs terminaisons axonales par microscopie confocale en immunofluorescence. Aujourd’hui, je vais démontrer un protocole d’analyse morphologique des neurosensils périphériques postérieurs sula et des exons à l’aide de mosaïques génétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine du développement neuronal, telles que quelles sont les programmes génétiques qui contrôlent l’identité neuronale, la forme des arborisations dendritiques et les connexions externes ?

Commencez ce protocole en collectant des embryons sur des plaques contenant du jus de pomme. Le choc thermique est appliqué dans un bain-marie à 38 degrés Celsius, et sa durée varie selon la génétique des embryons et la taille des clones souhaitée. Pour ce protocole, générez des clones markum à partir d'embryons portant un marqueur avec un promoteur spécifique aux neurones d'arborisation dendritique pand. Avant le choc thermique, maintenez les embryons marqueurs à 25 degrés Celsius, entourés de tissu humide, pendant deux heures.

Préparez les plaques de collecte pour le choc thermique en les rendant immergeables à l’aide de plaques vides et de paraflin. Ensuite, soumettez les embryons marqueurs à un choc thermique d’une heure pour générer de petits clones ou un marquage de neurones uniques. Pour augmenter le nombre de clones, appliquez un choc thermique prolongé en incubant pendant 45 minutes dans le bain, puis pendant 30 minutes à température ambiante, et enfin à nouveau pendant 30 minutes dans le bain.

Pour générer des clones flipout, collectez les embryons pendant 24 heures consécutives. Ce protocole utilise un activateur spécifique de classe quatre. Soumettez les embryons flipout à un choc thermique pendant une heure après le choc thermique.

Placer les plaques de collecte dans une boîte de Pétri de 10 centimètres entourée de tissus humides et de milieu de culture. Les embryons sont maintenus à 25 degrés Celsius pendant la culture embryonnaire ; surveiller et reconstituer la pâte de levure selon les besoins, car la nutrition affecte de manière critique le développement neuronal.

Conserver la culture jusqu'à ce que des larves de troisième stade errantes puissent être collectées, rincer brièvement et délicatement les larves de troisième stade à l'eau du robinet, puis les transférer sur une boîte de gélose. Observer ensuite les larves à l'aide d'un microscope stéréoscopique à fluorescence puissant et de pinces à insectes. Identifier les larves présentant des neurones positifs pour la GFP dans la paroi corporelle et les transférer sur une lame creuse contenant une goutte de glycérol à 80 %.

Placez une lame couvre-objet sur la préparation pour immobiliser la larve. Veillez à ce qu'aucun air ne subsiste entre la larve et la lame couvre-objet. Utilisez une microscopie confocale standard pour visualiser les neurones d'intérêt à travers la cuticule de la larve.

Pour modifier la position de la lave afin d'obtenir un meilleur angle de vision, poussez délicatement sur la lamelle pour faire rouler la lave. Commencez ce protocole en transférant une lave sur la plaque de protection SIL à l'aide de pinces à insectes. Ensuite, fixez-la aux extrémités antérieure et postérieure.

Ensuite, ajoutez du tampon HL 3.1 sans calcium. Coupez maintenant partiellement les deux extrémités de la larve perpendiculairement à l'axe antéro-postérieur. Puis effectuez une incision le long de la ligne médiane entre les deux trachées.

Coupez soigneusement chaque connexion trachéenne individuelle avec la paroi corporelle avant de retirer délicatement l'intestin. Cela permet de maintenir intacts les nerfs segmentaires qui cheminent entre le SNA et le SNC. Tandis que la larve reste fixée à la plaque de protection, fixez-la dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif doux, en effectuant chaque dissection en moins de cinq minutes.

Autrement, les arborisations des neurones autorisés dendritiques commenceront à se dégrader. Après la fixation, éliminer les tissus larvaires en excès. Puis laver les filets trois fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage.

Après les lavages, incuber les larves pendant 20 minutes à température ambiante dans la solution de blocage avec agitation douce. Une fois le blocage terminé, remplacer la solution de blocage par la solution d'anticorps primaire. Placer l'échantillon dans un petit récipient en plastique entouré de papier absorbant humide et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, poursuivre l'incubation pendant une heure supplémentaire à température ambiante.

Ensuite, lavez le filet de lave six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Ajoutez maintenant l'anticorps secondaire et placez les filets dans un récipient sombre pour éviter la photodégradation du fluorochrome. Incubez les filets pendant plusieurs heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius, suivies d'une heure à température ambiante.

Enfin, laver les lambeaux six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Les tissus sont alors prêts à être montés. Pour visualiser les terminaisons axonales, monter simplement la cuticule du lambeau larvaire, côté cuticule vers le bas, dans du glycérol à 80 % sur une lame creuse.

Pour obtenir des images plus nettes des dendrites, réalisez une monture permanente avec des lamelles revêtues de PLL. Pour marquer les lamelles, ajoutez un aliquot de PLL, portez à 10 millilitres d'eau doublement distillée et ajoutez 20 microlitres de Kodak photo flow.

Immergez les lamelles pendant 30 minutes dans la solution de PLL et laissez-les sécher à l'air après retrait. Rincez-les ensuite brièvement à l'eau et à l'air. Séchez-les à nouveau.

Répétez ce processus deux fois. À compter du bain de PLL, les lamelles traitées resteront utilisables environ un mois. Placez maintenant un muscle de larve disséqué, côté muscle vers le bas, dans une goutte de PBS sur une lamelle de PLL.

Le filet adhérera rapidement à la lame en utilisant un morceau de papier-mouchoir. Éliminez autant de liquide que possible, toutefois, ne laissez pas complètement sécher. Ensuite, déshydratez les filets larvaires à l’aide d’une série de bains d’éthanol de 10 minutes, en commençant par de l’éthanol à 35 %, suivi par du 50 %, puis du 70 %, puis du 95 %, puis du 100 %, et enfin d’un second bain d’éthanol à 100 %.

Suivez les bains d'éthanol par deux ou trois bains de 10 minutes dans le xylène. Ensuite, déposez une goutte de DPX sur une lame propre et placez délicatement la lamelle dans le DPX, en la remplissant côté vers le bas. Conservez la lame à l'abri de la lumière et attendez un jour pour que le DPX durcisse.

Avant l’imagerie du tissu par microscopie in vivo et focale, il est possible de capturer des images de ce type. L’arborisation complète d’un neurone d’arborisation dendritique de classe quatre. Il s’agit d’un agrandissement d’une arborisation dendritique provenant d’un neurone de classe trois marqué par IHC, correctement fixé afin de préserver la morphologie.

L'encart montre la dégradation pouvant survenir après une dissection et une fixation infructueuses. Cette superposition montre un seul terminus axonal de classe quatre dans le SNC. L'axone est marqué avec un anticorps anti-GFP en vert et tous les terminaux de classe quatre sont co-marqués avec un anticorps anti-CD2 en magenta.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer et de fixer rapidement les échantillons en traçant les axones depuis la périphérie jusqu'au SNC. Il est utile de garder à l'esprit que les neurones du SNP de chaque segment corporel projettent vers le segment correspondant du cordon nerveux ventral. En outre, si vous souhaitez uniquement visualiser les dendrites, retirez les CNAs pendant la dissection, et la coloration peut être effectuée en tube plutôt que sur des plaques.

Lors du montage de ces filets pour l'imagerie des dendrites, commencez par couper la tête avec les crochets buccaux et l'extrémité postérieure avec les étincelles. Pour une préparation optimale.