Name: Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez l'analyse morphologique des neurones dendritiques périphériques de larves de Drosophila utilisant des mosaïques génétiques marquées au GFP. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la neurodéveloppement et l'identité neuronale.

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Les auteurs remercient le RIKEN pour le financement. Nous remercions également Cagri Yalçin, Caroline Delandre, et Jay Parrish pour les discussions sur les protocoles génétiques et immunohistochimie.

1.Préparation de réactifs <ol><li> Préparer Ca + + libre HL3.1 salée 28. <ol><li> En mm: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl2, 10 NaHCO 3, HEPES 5, 115 le saccharose, le tréhalose et 5; pH 7,2. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. Note: Ca + solution + libre empêche la contraction des muscles lors de la dissection. </li></ol></li><li> Faire de poly-L-lysine (PLL) lamelles. <ol><li> Dissoudre 100 mg de PLL dans l'eau 4,2 ml et de faire des aliquots 300μl dans des tubes Eppendorf et congeler à -20 ° C. </li><li> Avant de lamelles de revêtement, premier dégel d'une partie aliquote, le mettre à 10ml dans le trou DDH 2 O et d'ajouter 20 pi de Kodak Photo-Flo, la concentration finale de PLL est de 0,7 mg / ml. </li><li> Plonger des lamelles pour les 30mins dans une solution de PLL, enlever et sécher, puis rincer rapidement à l'eau et à sec. Répéter deux fois. Lamelles traitées durer environ un mois. </li></ol></li></ol> 2. Croisements génétiques <ol><li> To générer des clones MARCM. Voici par exemple une croix en utilisant un pilote pan-DA 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, SAMU-mCD8:: GFP; baignoire-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Pour générer Flp-out clones. Voici une croix par exemple en utilisant une classe IV-pilote spécifique 8: PPK-Gal4 x yw, hsFLP; SAMU-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP </li></ol> 3. Collecte des embryons <ol><li> Gardez drosophile croise dans une bouteille de collection à 25 ° C et de recueillir des embryons sur un jus de pomme gélose 29 répandit avec une fine couche de pâte de 30,31 levure. </li></ol> 4. Traitement par choc thermique des embryons <ol><li> Placer une assiette vide en opposition à la plaque de gélose de pomme jus de sur lequel les embryons ont été posées. Seal autour de ces deux plaques avec du parafilm (Fig. 2). </li><li> Lors de choc thermique ème submerger,Plaque e dans le bain d'eau et la maintenir enfoncée en utilisant un poids de métal. </li><li> Pour les embryons MARCM <ol><li> Recueillir des embryons pour 2h et incuber dans un plat de 10cm de Pétri entouré par des tissus humidifié à 25 ° C pour une 2h supplémentaires. Remarque: Régler le protocole de choc thermique modifie la fréquence à laquelle les clones sont générés. </li><li> Pour un plus petit nombre de clones, visant simples neurones isolés, submerger et de choc thermique dans le bain-marie pendant 1h à 38 ° C. </li><li> Pour un plus grand nombre de clones, de choc thermique pour les 45mins à 38 ° C, de récupérer à la température ambiante 30 minutes, puis un choc thermique à nouveau pour une 30mins supplémentaires. </li></ol></li><li> Recueillir Flp-out embryons pour 24h, et le choc thermique pour 1h à 38 ° C. </li></ol> 5. Le dépistage de clones <ol><li> Après un choc thermique, enlevez le couvercle de l'arrangement étanche à l'eau et placez la plaque de gélose de pomme jus dans une boîte de Pétri 10cm entourées de tissus humidifiés. Culture des embryons et des larves subséquentes à 25 ° C jusqu'à ce que se promenerING 3 ème stade. Remarque: les conditions de culture, en particulier la nutrition, ont été montré de modification DA morphologie dendritique tonnelle 32,33. Assurez-vous que les larves de plus en plus avoir accès à la pâte de levure à tout moment, de suivre et reconstituer la levure coller comme requis. </li><li> De ce point dans le protocole de partir, manipuler délicatement avec une pince les larves d'insectes. </li><li> Brièvement et rincer doucement les larves dans l'eau du robinet, puis placez-les sur une plaque de gélose. Remarque: Cette étape permet de réduire de fond auto-fluorescence de la nourriture ou de saleté sur la surface des larves. </li><li> Examiner les larves sous un microscope à fluorescence puissante dissection. Identifier les larves avec GFP-positives neurones / cellules de la paroi du corps. </li></ol> 6. Imagerie in vivo dans des dendrites <ol><li> Placer la larve dans un verre à glisser la dépression avec une petite goutte de glycérine à 80%. Placer une lamelle sur la lame d'immobiliser la larve. Assurez-vous que l'air ne reste entre la larve et l'coverslip. </li><li> Poussez doucement la lamelle à rouler la larve pour permettre la visualisation du neurone d'intérêt. L'image de la mCD8:: GFP-étiquetée tonnelle dendritiques par microscopie confocale. </li></ol> 7. Dissection des larves Notez avant de commencer: DA dendrites neuronales se dégrader rapidement après le début de la dissection. Disséquer chaque larve individu dans moins de 5min à assurer la morphologie des dendrites bon. <ol><li> Disséquer errance 3 e stade larvaire sur une plaque Sylgard comme décrit précédemment 34 avec les modifications suivantes: <ol><li> Pour l'imagerie des neurones DA Termini axone, s'assurer que le système nerveux central est intact et les nerfs segmentaires ne sont pas brisés. Après l'ouverture de la larve, d'abord soigneusement couper les connexions trachéale à la paroi du corps puis retirez délicatement le tube digestif entier. </li><li> Si l'imagerie des dendrites seul, enlever la SNC pour permettre à un plat de montage. </li></ol></li></ol> 8. Fixation et le blocage des filets larvaires <ol><li> Avec la larve encore épinglé à la plaque Sylgard, le fixer dans PFA 4% dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante sur une légère rotation shaker. </li><li> Supprimer les traces des tissus larvaires (la graisse corporelle, la trachée, etc) après fixation. </li><li> Laver dans du PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100) 10mins 3x sur la plaque Sylgard et agitateur. Si l'examen de Termini axone, garder le filet sur la plaque Sylgard. (Si dendrites coloration, il est possible de transférer les filets des larves dans un tube de 0,5 ml à cette étape 34) </li><li> Bloquer les larves pendant 20 minutes à température ambiante dans 5% des taux sériques normaux âne (NDS) dans PBST sur un agitateur. </li></ol> 9. Coloration des filets larvaires <ol><li> Retirer la solution de blocage et incuber en anticorps primaire (dans 5% NDS / PBST) nuit à 4 ° C dans un petit récipient Tupperware entouré par humidifié tissus. </li><li> Retirer les tubes de 4 ° C et incuber une heure supplémentaire à température ambiante. </li><li> Lavez 10mins 6x dans le PBST. Ajouter le ANTIB secondairesOdy (dans 5% NDS / PBST), et le couvercle pour éviter la photo-blanchiment fluorophore 34. </li><li> Incuber soit à température ambiante pendant deux heures ou une nuit à 4 ° C suivie d'une heure à température ambiante. </li><li> Laver les larves 6x 10 minutes dans du PBST et procéder à un montage. </li></ol> 10. Montage des filets de larves d'examen de la tonnelle dendrite <ol><li> Mont chaque filet des larves aussi plate que possible en utilisant des ciseaux de dissection ou un scalpel pour couper la tête (y compris les crochets bouche), et la partie arrière (y compris les stigmates) 34. </li><li> Mettez le filet des larves sur la diapositive cuticule vers le bas, montez dans le glycérol 80%, et sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles pour une «rapide» de montage 34. </li><li> Pour un montage permanent et une image plus claire <ol><li> Placer le filet de muscles disséqués larves vers le bas sur une goutte de PBS sur une lamelle de PLL, il sera rapidement adhérer à la lamelle. </li><li> Retirez autant de liquide que possible après le montage, uter ne lui permettent pas de sécher complètement. </li><li> Prenez la lamelle (avec filet de larves jointe) grâce à une série d'éthanol: l'éthanol 35%, suivie par 50%, 70%, 95%, et enfin 2x éthanol à 100% pour chacun des 10 minutes (le 2ème solution 100% EtOH doit être changé fréquemment ), et enfin, laver 2-3x 10 minutes dans le xylène. </li><li> Mettre une goutte de milieu de montage DPX (Xylène Plastifiant Distyrene) sur une lame propre et soigneusement préparer le filet de la lamelle à l'envers sur le dessus. Gardez à l'obscurité, et d'attendre une journée pour le DPX de mettre en avant l'imagerie. </li></ol></li></ol> 11. Montage des filets de larves d'examen des terminus axone <ol><li> Gardez les nerfs segmentaires courant entre le PNS et le SNC intacte lors de la dissection, la fixation et coloration afin de permettre le traçage des axones des neurones périphériques du corps de cellules sensorielles de la VNC. </li><li> Montez chaque filet de la cuticule des larves vers le bas dans 80% de glycérine dans une diapositive dépression. Trace les axones du corps cellulaire DA auVNC sous le microscope confocal. Remarque: PNS neurones dans chaque projet segment du corps mur pour le segment apparenté de la VNC. </li></ol> 12. Les résultats représentatifs: Les résultats représentatifs sont présentés dans les figures 3-5. Fig. 3 montre la tonnelle entière d'un neurone de classe IV da, capturé in vivo sous le microscope confocal. Fig. 4 montre un gros plan d'une partie de la tonnelle d'un dendrite immunohistochimiquement étiquetés neurone de classe III qui a été correctement fixé afin de préserver la morphologie. L'encart montre la dégradation associée qui peut survenir après une dissection infructueuses et la fixation (deux colorés avec des anticorps anti-GFP). Fig. 5 montre une seule classe IV axone terminal dans le SNC (anti-GFP, vert); tous les terminus de classe IV sont co-colorés avec anti-CD2 (magenta). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> Figure 1 Aperçu Protocole. a) Recueillir et ensuite de choc thermique embryons. b) Sélectionnez une larve avec un clone GFP-positives DA neurone, puis l'image de la GFP-étiquetée dendrite tonnelle dans la larve vit. c) Disséquer la larve, puis immunohistochimiquement tacher le filet. d) Monter le filet taché, puis l'image de la tonnelle dendritiques et projections axonales des neurones DA les clones. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> Figure 2: préparation de la plaque de gélose de pomme jus pour choc thermique. Prenez la plaque (flèche blanche, AB), ajouter un second plat de Pétri sur le dessus (flèche rouge b) et joint d'étanchéité autour de Parafilm (flèche bleue, b). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> Figure 3 en image in vivo de la tonnelle d'un dendrite mCD8:: GFP-étiquetée clone MARCM (génotype comme en 2.1), représentant une classe IV (v'ada) neurone d'une larve de 3 e stade larvaire. La barre d'échelle est 50 microns. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; Figure 4 mCD8:: GFP-étiquetée clone MARCM d'un neurone de classe III (ddaA) colorés avec des anticorps anti-GFP, montrant une bonne morphologie après dissection réussie et la fixation (en vert). L'encart montre la dégradation des dendrites (flèches blanches) survenant après la dissection infructueuses et la fixation (magenta). La barre d'échelle est 25 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> Figure 5 La 3 e stade larvaire VNC. Un clone Flp-out d'un terminus de classe VI seul axone (VDAB) (génotype comme en 2.2) est détecté à l'aide d'anticorps anti-GFP (vert). Anti-CD2 étiquettes tous les terminus de classe IV (magenta). La barre d'échelle est 25 um.

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<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La Drosophile larvaire DA neurone modèle fournit un excellent système pour étudier les mécanismes génétiques que la morphologie des neurones de contrôle et de la formation des circuits. MARCM est généralement utilisé pour l&#39;étiquetage et pour générer des clones mutants DA neurone. Pour MARCM nous utilisons soit un pan-neural (p. ex Gal4 C155) ou spécifique des neurones DA pilote. L&#39;utilisation d&#39;un pilote pan-neuronal, il est possible d&#39;utiliser directement plusieurs ...

<table border="1"><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> SZX16 microscope à dissection de fluorescence (avec GFPHQ filtre) </td><td> Olympus </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Pince en direct insectes </td><td> TSF </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm en verre glisser la dépression </td><td> Toshinriko Co. </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (ou Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Ce produit a prouvé plus efficace </td></tr><tr><td> DPX milieu de montage </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5h10 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr><tr><td> Souris anti-CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> Dilution 1:700 </td></tr><tr><td> Souris anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> Dilution 1:10 </td></tr></table>

analyse morphologique des drosophile larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Développement du système nerveux requiert la spécification correcte de la position du neurone et de l&#39;identité, suivie par le développement des neurones dendritiques précise classe spécifique et le câblage axonal. Récemment, le dendritiques arborisation (DA) des neurones sensoriels de l&#39;Drosophile larvaire du système nerveux périphérique (SNP) sont devenus puissants modèles génétiques dans lesquels d&#39;élucider les mécanismes à la fois générales et spécifiques à chaque classe de la différenciation neuronale. Il ya quatre principales classes de neurones DA (I-IV) 1. Ils sont nommés dans l&#39;ordre croissant de complexité des dendrites tonnelle, et ont de la classe des différences spécifiques dans le contrôle génétique de leur différenciation 2-10. Le DA système sensoriel est un modèle pratique pour étudier les mécanismes moléculaires derrière le contrôle de la morphologie dendritique 11-13 parce que: 1) il peut profiter de l&#39;puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile, 2) le neurone DA dendrite tonnelle se propage en seulement deux dimensions sous un article optiquementar des larves cuticule rendant facile à visualiser en haute résolution in vivo, 3) la diversité des classes spécifiques de morphologie dendritique facilite une analyse comparative de trouver des éléments clés contrôlant la formation de simples vs très ramifiées arbres dendritiques, et 4) dendritiques tonnelle stéréotypées formes de neurones DA différents de faciliter les analyses statistiques morphométriques. DA neurone modifie l&#39;activité de la sortie d&#39;un générateur de pattern de locomotion des larves centrale 14-16. Les différentes classes de neurones DA ont des modalités sensorielles distinctes, et leur activation provoque différentes réactions comportementales 14,16-20. Par ailleurs des classes différentes envoyer des projections axonales stéréotypée dans le système central de la drosophile larvaires nerveux dans la corde nerveuse ventrale (VNC) 21. Ces projections se terminent par des représentations topographiques de deux neurones DA modalité sensorielle et la position dans la paroi du corps du champ dendritique 7,22, 23. Ainsi l&#39;examen des projections axonales DA peut être utilisée pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la cartographie topographique 7,22,23, ainsi que le câblage d&#39;un circuit simple de locomotion des larves modulant 14-17. Nous présentons ici un guide pratique pour générer et analyser les mosaïques génétiques marquant 24 neurones DA via MARCM (Analyse mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible) 1,10,25 et FLP-out 22,26,27 techniques (résumées dans la Fig. 1).

Les neurones sensoriels de l&#39;arborisation dendritique des<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires système nerveux périphérique sont des modèles utiles pour élucider la fois générales et spécifiques à chaque classe neurone mécanismes de la différenciation neuronale. Nous présentons un guide pratique pour générer et analyser dendritiques arborisation neurone mosaïques génétique.

Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

Le développement du système nerveux nécessite une spécification correcte de la position et de l'identité des neurones, suivie d'une croissance dendritique précise et spécifique à chaque classe de neurones...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la morphologie détaillée des neurones larvaires d'arborisation dendritique de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en collectant des embryons, en les faisant vieillir, puis en générant des clones génétiques marqués par la GFP grâce à une expression induite par choc thermique de la lipase. La deuxième étape consiste à sélectionner des larves possédant des clones neuronaux fluorescents et à acquérir une image de leurs arborisations dendritiques.Après l’imagerie des larves, celles-ci sont disséquées, fixées et soumises à une coloration immunohistochimique afin d’être montées et de permettre la visualisation de la morphologie de leurs arborisations dendritiques et de leurs terminaisons axonales par microscopie confocale en immunofluorescence. Aujourd’hui, je vais démontrer un protocole d’analyse morphologique des neurosensils périphériques postérieurs sula et des exons à l’aide de mosaïques génétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine du développement neuronal, telles que quelles sont les programmes génétiques qui contrôlent l’identité neuronale, la forme des arborisations dendritiques et les connexions externes ?Commencez ce protocole en collectant des embryons sur des plaques contenant du jus de pomme. Le choc thermique est appliqué dans un bain-marie à 38 degrés Celsius, et sa durée varie selon la génétique des embryons et la taille des clones souhaitée. Pour ce protocole, générez des clones markum à partir d'embryons portant un marqueur avec un promoteur spécifique aux neurones d'arborisation dendritique pand. Avant le choc thermique, maintenez les embryons marqueurs à 25 degrés Celsius, entourés de tissu humide, pendant deux heures.Préparez les plaques de collecte pour le choc thermique en les rendant immergeables à l’aide de plaques vides et de paraflin. Ensuite, soumettez les embryons marqueurs à un choc thermique d’une heure pour générer de petits clones ou un marquage de neurones uniques. Pour augmenter le nombre de clones, appliquez un choc thermique prolongé en incubant pendant 45 minutes dans le bain, puis pendant 30 minutes à température ambiante, et enfin à nouveau pendant 30 minutes dans le bain.Pour générer des clones flipout, collectez les embryons pendant 24 heures consécutives. Ce protocole utilise un activateur spécifique de classe quatre. Soumettez les embryons flipout à un choc thermique pendant une heure après le choc thermique.Placer les plaques de collecte dans une boîte de Pétri de 10 centimètres entourée de tissus humides et de milieu de culture. Les embryons sont maintenus à 25 degrés Celsius pendant la culture embryonnaire ; surveiller et reconstituer la pâte de levure selon les besoins, car la nutrition affecte de manière critique le développement neuronal.Conserver la culture jusqu'à ce que des larves de troisième stade errantes puissent être collectées, rincer brièvement et délicatement les larves de troisième stade à l'eau du robinet, puis les transférer sur une boîte de gélose. Observer ensuite les larves à l'aide d'un microscope stéréoscopique à fluorescence puissant et de pinces à insectes. Identifier les larves présentant des neurones positifs pour la GFP dans la paroi corporelle et les transférer sur une lame creuse contenant une goutte de glycérol à 80 %.Placez une lame couvre-objet sur la préparation pour immobiliser la larve. Veillez à ce qu'aucun air ne subsiste entre la larve et la lame couvre-objet. Utilisez une microscopie confocale standard pour visualiser les neurones d'intérêt à travers la cuticule de la larve.Pour modifier la position de la lave afin d'obtenir un meilleur angle de vision, poussez délicatement sur la lamelle pour faire rouler la lave. Commencez ce protocole en transférant une lave sur la plaque de protection SIL à l'aide de pinces à insectes. Ensuite, fixez-la aux extrémités antérieure et postérieure.Ensuite, ajoutez du tampon HL 3.1 sans calcium. Coupez maintenant partiellement les deux extrémités de la larve perpendiculairement à l'axe antéro-postérieur. Puis effectuez une incision le long de la ligne médiane entre les deux trachées.Coupez soigneusement chaque connexion trachéenne individuelle avec la paroi corporelle avant de retirer délicatement l'intestin. Cela permet de maintenir intacts les nerfs segmentaires qui cheminent entre le SNA et le SNC. Tandis que la larve reste fixée à la plaque de protection, fixez-la dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif doux, en effectuant chaque dissection en moins de cinq minutes.Autrement, les arborisations des neurones autorisés dendritiques commenceront à se dégrader. Après la fixation, éliminer les tissus larvaires en excès. Puis laver les filets trois fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage.Après les lavages, incuber les larves pendant 20 minutes à température ambiante dans la solution de blocage avec agitation douce. Une fois le blocage terminé, remplacer la solution de blocage par la solution d'anticorps primaire. Placer l'échantillon dans un petit récipient en plastique entouré de papier absorbant humide et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, poursuivre l'incubation pendant une heure supplémentaire à température ambiante.Ensuite, lavez le filet de lave six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Ajoutez maintenant l'anticorps secondaire et placez les filets dans un récipient sombre pour éviter la photodégradation du fluorochrome. Incubez les filets pendant plusieurs heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius, suivies d'une heure à température ambiante.Enfin, laver les lambeaux six fois dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Les tissus sont alors prêts à être montés. Pour visualiser les terminaisons axonales, monter simplement la cuticule du lambeau larvaire, côté cuticule vers le bas, dans du glycérol à 80 % sur une lame creuse.Pour obtenir des images plus nettes des dendrites, réalisez une monture permanente avec des lamelles revêtues de PLL. Pour marquer les lamelles, ajoutez un aliquot de PLL, portez à 10 millilitres d'eau doublement distillée et ajoutez 20 microlitres de Kodak photo flow.Immergez les lamelles pendant 30 minutes dans la solution de PLL et laissez-les sécher à l'air après retrait. Rincez-les ensuite brièvement à l'eau et à l'air. Séchez-les à nouveau.Répétez ce processus deux fois. À compter du bain de PLL, les lamelles traitées resteront utilisables environ un mois. Placez maintenant un muscle de larve disséqué, côté muscle vers le bas, dans une goutte de PBS sur une lamelle de PLL.Le filet adhérera rapidement à la lame en utilisant un morceau de papier-mouchoir. Éliminez autant de liquide que possible, toutefois, ne laissez pas complètement sécher. Ensuite, déshydratez les filets larvaires à l’aide d’une série de bains d’éthanol de 10 minutes, en commençant par de l’éthanol à 35 %, suivi par du 50 %, puis du 70 %, puis du 95 %, puis du 100 %, et enfin d’un second bain d’éthanol à 100 %.Suivez les bains d'éthanol par deux ou trois bains de 10 minutes dans le xylène. Ensuite, déposez une goutte de DPX sur une lame propre et placez délicatement la lamelle dans le DPX, en la remplissant côté vers le bas. Conservez la lame à l'abri de la lumière et attendez un jour pour que le DPX durcisse.Avant l’imagerie du tissu par microscopie in vivo et focale, il est possible de capturer des images de ce type. L’arborisation complète d’un neurone d’arborisation dendritique de classe quatre. Il s’agit d’un agrandissement d’une arborisation dendritique provenant d’un neurone de classe trois marqué par IHC, correctement fixé afin de préserver la morphologie.L'encart montre la dégradation pouvant survenir après une dissection et une fixation infructueuses. Cette superposition montre un seul terminus axonal de classe quatre dans le SNC. L'axone est marqué avec un anticorps anti-GFP en vert et tous les terminaux de classe quatre sont co-marqués avec un anticorps anti-CD2 en magenta. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer et de fixer rapidement les échantillons en traçant les axones depuis la périphérie jusqu'au SNC. Il est utile de garder à l'esprit que les neurones du SNP de chaque segment corporel projettent vers le segment correspondant du cordon nerveux ventral. En outre, si vous souhaitez uniquement visualiser les dendrites, retirez les CNAs pendant la dissection, et la coloration peut être effectuée en tube plutôt que sur des plaques.Lors du montage de ces filets pour l'imagerie des dendrites, commencez par couper la tête avec les crochets buccaux et l'extrémité postérieure avec les étincelles. Pour une préparation optimale.

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Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques (Vidéo) | JoVE Journal

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