Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Cette méthode peut aider à comprendre des questions importantes dans le domaine des cellules bêta. Comme la fonction hétérogène IT parmi les cellules bêta individuelles d’un îlot. Le principal avantage de cette technique est la résolution spatiale et temporelle fournie par l’imagerie en direct des cellules bêta.

Nous pouvons capturer les oscillations calciques dans les cellules bêta individuelles. Après avoir euthanasié un poisson selon le protocole textuel, transférez-le dans une boîte de Pétrie contenant une solution HBSS avec du calcium et du magnésium. Ensuite, sous un stéréomicroscope équipé d’une lampe à fluorescence et d’un cube de filtre rouge, utilisez des pinces tranchantes pour couper la peau de la bouche à la nageoire anale.

Retirez la peau coupée du côté droit pour exposer l’abdomen, ce qui exposera les organes internes. Ensuite, en utilisant la fluorescence rouge pour identifier l’expression de mKO2 dans les cellules bêta, localisez les îlots. Nettoyez l’îlot primaire en enlevant soigneusement les tissus environnants, tels que le foie et les adipocytes.

Prenez des précautions pour ne pas blesser ou piquer l’îlot. Ensuite, pipetez une goutte de 30 microlitres de HBSS au centre d’un plat à fond de verre. Transférez ensuite l’îlot disséqué dans la goutte.

Avec HBSS, lavez soigneusement l’îlot une fois puis utilisez 30 microlitres de solution de travail de fibrinogène pour le laver une fois. Évitez de sécher l’îlot pendant les étapes de lavage, ce qui pourrait entraîner la mort cellulaire. Ajoutez lentement et doucement 10 microlitres de 10 unités par millilitre de solution de thrombine dans l’îlot.

Laissez l’îlot et le plat intacts pendant 15 à 20 minutes. Observez que la goutte de thrombine de fibrinogène deviendra visqueuse et stable. Il faut laisser suffisamment de temps à la thrombine pour polymériser dans la solution de fibrinogène.

Sinon, le moule n’assurera pas de stabilité pendant la séance d’imagerie. Pour réaliser une imagerie en direct ex vivo de la fluorescence GCaMP, ajoutez 200 microlitres de HBSS sur le dessus du moule et placez soigneusement la parabole sur le support de plaque du microscope confocal. Ensuite, avec un objectif d’erreur 20X 0,8 NA et l’option de champ clair, localisez l’îlot.

L’utilisation du filtre de fluorescence rouge pour visualiser la fluorescence nucléaire de mKO2 dans les cellules bêta se concentre sur l’îlot. Les noyaux individuels doivent être clairement visibles. Localisez un plan d’imagerie clair en vous déplaçant manuellement sur l’épaisseur de l’îlot le long de son axe Z.

Assurez-vous que le plan d’imagerie contient 50 à 100 cellules bêta pour l’imagerie et que la luminosité de la fluorescence nucléaire mKO2 est uniforme, en particulier au centre de l’îlot. Ensuite, dans le menu de configuration intelligente, configurez une acquisition séquentielle pour la fluorescence GCaMP6 et mKO2 à l’aide des paramètres suivants. Pour GCaMP6, choisissez une excitation de 488 nanomètres et une émission approximative de 500 à 555 nanomètres.

Sous false color, sélectionnez GFP. Pour mKO2, choisissez une excitation de 561 nanomètres et une émission de 570 à 630 nanomètres. Pour la couleur false, sélectionnez mCherry.

En mode acquisition, réglez la résolution de l’image sur 1 024 x 1 024 pixels, la vitesse sur 10 et la moyenne sur un. Lancez un enregistrement continu en sélectionnant l’option Séries chronologiques et en réglant la durée sur 500 cycles avec un temps d’acquisition d’environ deux secondes par image. Gardez un œil sur le cycle d’imagerie.

Après les 50 premières images, sans perturber l’acquisition de l’image, pipetez doucement cinq microlitres de solution de D-glucose de 200 millimolaires sur le gel qui maintient l’îlot. Ensuite, acquérez 150 images à 10 millimolaires de glucose. Les 50 premières images de la série chronologique correspondent à l’activité des cellules bêta à cinq millimolaires de glucose.

C’est l’activité de base. Une cellule bêta répondante montrera une croissance et une diminution de la fluorescence verte avec le temps. À 200 images, augmentez la concentration de glucose à 20 millimolaires en ajoutant doucement 10 microlitres de D-glucose à 200 millimolaires.

Ensuite, acquérez 150 images à la concentration de 20 millimolaires. Pour ouvrir le fichier image dans FIJI, sélectionnez Plugin, LSM Toolbox, afficher LSM Toolbox. Dans la boîte à outils LSM, cliquez sur Ouvrir LSM et sélectionnez le fichier image.

Sous Outils dans le menu Analyser, ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement. Avec l’outil de sélection de polygones situé dans la barre d’outils, dessinez manuellement le retour sur investissement. Dessinez le ROI dans le canal rouge de manière à ce qu’il couvre une zone plus grande qu’un noyau pour inclure une partie du cytoplasme de la cellule.

Assurez-vous que la position du retour sur investissement est cohérente entre les cadres et ajustez la position si nécessaire. Ajoutez les retours sur investissement sélectionnés au gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur le bouton Ajouter. Sélectionnez et ajoutez plusieurs zones d’intérêt pour obtenir des données sur plusieurs cellules.

Ensuite, dans le menu Analyser, sélectionnez Définir les mesures. Sélectionnez ensuite Densité intégrée pour spécifier l’extraction de l’intensité totale de fluorescence dans la zone. Passez au canal vert contenant la fluorescence GCaMP et, dans le gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez Multi Mesure.

Cela fournira les mesures d’intensité pour les cellules tout au long de la série chronologique. Enregistrez la sortie FIJI sous la forme d’un fichier texte séparé par des virgules. Depuis la boîte à outils LSM, obtenez les horodatages des images d’images.

Utilisez Appliquer les tampons, Appliquer les tampons T, Nom de fichier, Vider dans le fichier texte, pour obtenir les horodatages. Enregistrez les horodatages à l’aide de l’option Enregistrer sous ou copiez-les dans la feuille de calcul. Après avoir compilé les valeurs d’intensité de toutes les cellules, effectuez l’analyse une cellule à la fois ou automatiquement.

Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte. Dans cette expérience, des cellules bêta primaires d’îlots de Langerhans de la lignée transgénique 45 DPF exprimant mKO2 et GCaMP6 nucléaires spécifiquement dans les cellules bêta, ont été stimulées avec une rampe de glucose, puis dépolarisées avec du chlorure de potassium. L’activité des cellules a été analysée.

À l’aide de FIJI et d’un logiciel d’analyse de données, l’intensité de fluorescence GCaMP6 des cellules bêta individuelles a été extraite et normalisée. Comme le montre cette trace d’intensité de fluorescence, les cellules bêta individuelles présentent des oscillations en fluorescence GCaMP6 lorsqu’elles sont stimulées avec du glucose, et l’ajout de chlorure de potassium stabilise la fluorescence. La technique fournit une résolution cellulaire de la réponse au glucose des cellules bêta et une fenêtre sur leur fonctionnalité.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de vérifier la viabilité des cellules bêta. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme des manipulations génétiques, peuvent être effectuées pour comprendre le rôle de gènes spécifiques sur la fonction des cellules bêta.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la réponse glycémique dans les cellules bêta individuelles.