Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Cette méthode peut répondre à des questions de recherche clés en neurosciences, en oncologie et au-delà, telles que l’expression spécifique au type de cellule et la cartographie spatiale des variantes d’épissage dans les microenvironnements cérébraux et tumoraux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter des jonctions d’exons, des séquences courtes et des mutations ponctuelles dans le contexte tissulaire avec une sensibilité et une spécificité très élevées dans des cellules uniques. La démonstration de la procédure sera assurée par Hell Pimentel, un scientifique associé de notre laboratoire.

Pour préparer le tissu, fixez-le immédiatement après la dissection dans du formol tamponné neutre à 10 % à température ambiante pendant 16 à 32 heures. Ensuite, l’échantillon est traité et incorporé dans de la paraffine selon des procédures standard. Coupez le tissu incrusté en cinq sections de plus ou moins un micron à l’aide d’un microtome.

Montez les sections sur des lames de verre électrostatiquement adhésives et faites-les sécher à l’air libre à température ambiante pendant la nuit. Une heure avant d’effectuer le test d’hybridation de l’ARN NC2, placez les lames de tissu montées dans une grille à lames et faites-les cuire dans un four à air circulant à 60 degrés Celsius. Avant de commencer l’essai d’hybridation de l’ARN NC2, assurez-vous que le four d’hybridation est réglé à 40 degrés Celsius.

Mouillez soigneusement le papier humidificateur, retirez toute eau résiduelle et placez le couvercle sur le plateau de contrôle de l’humidité. Préparez 200 millilitres de réactif de récupération de cible 1X disponible dans le commerce en ajoutant 20 millilitres de réactif de récupération de cible 10X à 180 millilitres d’eau. Placez deux supports de glissières dans un cuiseur vapeur.

Remplissez un porte-lames avec 200 millilitres de réactif de récupération de cible 1X et l’autre avec 200 millilitres d’eau. À l’aide du cuiseur vapeur, chauffer les deux solutions à ébullition. Réchauffez le tampon de lavage 50X à 40 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.

Préparez ensuite trois litres de tampon de lavage 1X en diluant 60 millilitres de tampon de lavage 50X préchauffé avec 2,94 litres d’eau. Dans une hotte, préparez 50 % de la solution de contre-coloration à l’hématoxyline de Gill en ajoutant 100 millilitres d’hématoxyline de Gill à 100 millilitres d’eau. Préparez le réactif de bleuissement en ajoutant 1,43 millilitre de 20 à 30 % d’hydroxyde d’ammonium à 250 millilitres d’eau.

Préchauffez les sondes cibles à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes avant l’hybridation de la sonde. Amenez les sept réactifs amplificateurs, ampères 0 à 6, à température ambiante. Commencez la dépariffinisation de l’échantillon en sortant les sections du four et en immergeant les lames de tissu montées dans du xylène en agitant pendant cinq minutes.

Dépariffiniser à nouveau dans du xylène frais pendant cinq minutes. Déshydrater dans de l’éthanol à 100 % avec agitation pendant deux minutes. Et répétez à nouveau dans 100 % éthanol frais pendant deux minutes.

Faites sécher les lames à l’air libre à 60 degrés Celsius dans un four à air circulant pendant cinq minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Ensuite, incubez les sections avec environ quatre gouttes de peroxyde d’hydrogène prêt à l’emploi à température ambiante pendant 10 minutes pour éteindre l’activité de la peroxydase endogène. Décantez la solution des lames et rincez-les deux fois à l’eau.

Trempez brièvement les sections dans l’eau préchauffée, puis placez les sections dans 200 millilitres du réactif de récupération cible à 100 degrés Celsius dans le cuiseur vapeur pendant 15 à 30 minutes. Retirez les lames de la récupération de la cible et rincez-les deux fois à l’eau. Trempez-le dans de l’éthanol à 100 % pendant trois minutes.

Ensuite, séchez les lames à 60 degrés Celsius dans un four à air circulant jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Une fois que les lames sont sèches, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner une barrière hydrophobe d’environ 0,75 pouce sur 0,75 pouce autour de la section. Laissez la barrière sécher complètement à température ambiante pendant une minute.

Placez les diapositives dans un support de diapositives et placez le support de diapositives dans le plateau préchauffé à humidité contrôlée. Ajoutez environ quatre gouttes de protéase 3 sur chaque lame et incubez à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant 15 à 30 minutes. Décantez la solution des lames et rincez-les deux fois à l’eau.

Pour commencer la procédure d’hybridation de la sonde, ajoutez environ quatre gouttes de la solution de sonde prête à l’emploi appropriée pour couvrir toute la section. Hybridez les sondes à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant deux heures. Décantez la solution des lames et lavez les lames dans 200 millilitres de tampon de lavage 1X à température ambiante avec une agitation occasionnelle pendant deux minutes.

Répétez la procédure de lavage. L’étape suivante consiste à amplifier le signal en incubant les sections dans une série de réactifs amplificateurs. Ajoutez environ quatre gouttes d’Amp 0 pour couvrir toute la section de chaque lame et incubez à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant 30 minutes.

Ensuite, décantez la solution et lavez les lames dans 200 millilitres de tampon de lavage 1X à température ambiante avec une agitation occasionnelle pendant deux minutes. Répétez la procédure de lavage. De la même manière, incubez les sections de l’ampli 1 à l’ampli 6 à la température et pendant la durée indiquées dans ce schéma.

Une fois que les lames ont été traitées avec la série de réactifs d’amplification, préparez une solution de travail de colorant Fast Red. Ajoutez le volume approprié de colorant Fast Red-B et de colorant Fast Red-A dans un tube et mélangez bien. Décantez l’excès de liquide des lames et ajoutez la solution de travail du colorant Fast Red aux lames.

Incuber les lames dans un plateau avec un couvercle à température ambiante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, décantez la solution Fast Red et rincez les lames deux fois en les trempant de haut en bas avec de l’eau du robinet. Pour contre-colorer les sections de tissu, plongez les lames dans la solution d’hématoxyline à 50 % de Gill à température ambiante pendant deux minutes.

Lavez les lames à l’eau du robinet, en répétant cette opération plusieurs fois jusqu’à ce que les lames soient claires tandis que les sections restent violettes. Trempez les lames dans de l’eau ammoniacale à 02 % deux à trois fois pour bleuir. Remplacez l’eau ammoniacale par de l’eau du robinet et lavez les lames trois à cinq fois.

Faites sécher les lames dans un four à air circulant à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Placez une à deux gouttes de réactif de montage sur une lamelle et placez la glissière sur la lamelle tout en évitant tout piégeage de bulles d’air. Faites sécher les lames à l’air libre pendant au moins cinq minutes.

Enfin, observez les lames sous un microscope à champ clair standard. Les sondes à jonction d’exon Double-Z ont été conçues pour déterminer le statut EGFRvIII dans deux échantillons de glioblastome fixé à la paraffine ou FFPE. Les deux sondes de type sauvage ont détecté un signal dans les deux échantillons, indiquant que les deux échantillons expriment un EGFR de type sauvage.

Cependant, la sonde mutante n’a détecté le signal que dans l’échantillon positif EGFRvIII et non dans l’échantillon négatif EGFRvIII. Des sondes de contrôle positives et négatives ont été incluses dans l’essai. Lorsqu’un test sur cible courte a été effectué sur des cellules Jurkat, préparées sous forme de pastille de cellule FFPE à l’aide de sondes antisens ou sensorielles, ciblant les séquences en rouge, une coloration robuste a été observée avec des sondes antisens pour CDR3-alpha et CDR3-bêta, tandis que les sondes sensorielles ont détecté peu ou pas de signal.

dapB a été utilisé comme témoin négatif. Le test est également capable de détecter des mutations ponctuelles. Dans cet exemple, deux sondes ont été conçues, l’une pour détecter la séquence EGFR mutée L858R et l’autre pour détecter la séquence de type sauvage EGFR L858.

La sonde mutante a détecté un signal dans la lignée cellulaire H1975, qui est hétérozygote pour la mutation EGFR L858R, mais n’a pas détecté de signal dans la lignée cellulaire H2229, qui n’exprime que le type sauvage EGFR L858. La sonde de type sauvage a détecté un signal dans les deux lignées cellulaires. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de fixer correctement vos tissus, d’exécuter des sondes de contrôle positives et négatives et d’utiliser le système de traitement des lames dans le four d’hybridation.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’IHC avec des marqueurs cellulaires peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de l’expression spécifique du type cellulaire des variantes d’épissage ou des séquences cibles courtes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences, en oncologie et au-delà pour explorer des événements d’épissage alternatifs dans le contexte tissulaire, en identifiant des mutations ponctuelles spatialement cartographiées et en visualisant des séquences très homologues et courtes in situ. N’oubliez pas que travailler avec du formol et du xylène tamponnés neutres peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte et le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.