Name: Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez une technique d'hybridation in situ pour détecter des séquences ARN courtes et des mutations ponctuelles au niveau cellulaire dans des tissus cérébraux et tumoraux. Cette méthode offre une sensibilité élevée pour l'étude de l'expression génique.

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Les échantillons de tumeur humaine utilisés dans cette étude ont été dépersonnalisées et acquis auprès de sources commerciales conformément aux directives éthiques pour la recherche locales.
1. l’échantillon, l’équipement et préparation du réactif
<ol><li>
Préparation des échantillons FFPE
	<ol>
<li>Tissus<ol>
<li>Immédiatement après dissection, fixer le tissu (divisée en blocs de 3 à 4 mm d’épaisseur) dans 10 % de formol tamponné neutre (FBN) pour 16 – 32 h à température ambiante (RT). NOTE : Temps de Fixation variera selon la taille et le type de tissu.</li>
			<li>Laver l’échantillon avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et mettre en attente à l’aide d’une série standard éthanol (EtOH) (70 % EtOH durant 30 à 60 min, 80 % EtOH durant 30 à 60 min, 90 % EtOH durant 30 à 60 min, 95 % EtOH durant 30 à 60 min, 3 x 100 % pour EtOH 30 – 60 min) suivie de xylène.</li>
			<li>Incorporer l’échantillon dans la paraffine à l’aide de procédures standard6 et découper les blocs de paraffine comme nécessaires pour éliminer les excès paraffine. Remarque : Taille de bloc variera selon la taille de l’échantillon de tissu, mais une taille typique est de 0,75 x 0,75 pouces2 ou plus petit.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lignées cellulaires<ol>
<li>Recueillir et granules des cellules selon les méthodes recommandées pour la lignée cellulaire spécifique.</li>
			<li>Fixer les cellules dans 10 % de formaldéhyde à ta pendant 24 h sur un rotateur.</li>
			<li>Préparer les cellules comme une pastille en gel traitement préchauffée (e.g., Histogel). Permettre le culot à se solidifier en plaçant le gel-culot sur un morceau de parafilm sur la glace et laisser reposer pendant 2 à 3 min. Submerge le culot de gel électrolyte dans du PBS 1 x.</li>
			<li>Déshydrater et incorporer les boulettes de cellule comme indiqué au point 1.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Section Préparation<ol>
<li>Couper les tissus/cellules embarqués en 5 sections de ± 1 μm à l’aide d’un microtome, monter les sections sur lames de verre adhésive électrostatiquement et les sécher toute la nuit à température ambiante. Remarque : Les diapositives peuvent être stockés à RT sous la dessiccation pendant 3 mois.</li>
			<li>Déposer les lames dans une grille coulissante et cuire les lames de tissu monté dans un four à circulation d’air à 60 ° C pendant 1 h avant d’effectuer le test. Remarque : Utilisez les diapositives immédiatement ou stockez-les à RT avec gel de silice pendant 1 semaine. Dégradation de l’ARN peut entraîner un stockage prolongé.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de matériel
	<ol>
<li>Régler le four de l’hybridation à 40 ° C. Bien mouiller le papier humidification supprimer toute résiduelle dH2O. Insérez le papier dans le bac de contrôle d’humidité et insérez le plateau dans le four de l’hybridation à Préchauffer pendant au moins 30 min avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation du réactif
	<ol>
<li>Remplir deux compensation agent plats avec 200 mL de xylène et de remplir les deux plats de coloration avec 200 mL de 100 % EtOH, qui sera utilisé pour le déparaffinage des sections.</li>
		<li>Préparer, 200 mL de réactif de récupération disponibles dans le commerce 1 x cible en ajoutant 180 mL de dH2O à 20 mL de réactif de récupération 10 x cible. Placer les deux titulaires de glisser dans un cuit-vapeur. Remplir un porte-lames avec 200 mL de 1 x réactif de récupération cible et remplir les autres porte-lames avec 200 mL de dH2O. chaleur les deux solutions à ébullition avec le cuit-vapeur.</li>
		<li>Préchauffé de chaud 50 x tampon de lavage à 40 ° C pendant 10 à 20 min. préparer 3 L 1 x tampon de lavage par dilution de 60 mL de tampon de lavage 50 x avec L 2,94 de dH2O.</li>
		<li>Sous une hotte, préparer hématoxyline de 50 % Gill contre-coloration solution en ajoutant 100 mL de l’hématoxyline Gill dans 100 mL de dH2O. Sous la hotte, préparer le réactif de bleuissement (0,02 % (p/v) d’eau ammoniaque) en ajoutant 1,43 mL d’hydroxyde d’ammonium 28 – 30 % à 250 mL de dH2O.</li>
		<li>Réchauffer au préalable les sondes de la cible à 40 ° C pendant 10 min avant l’hybridation de la sonde et apporter les réactifs d’amplification (0 – 6 AMP) RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ARN essai In Situ hybridation avec
<ol><li>
Déparaffinage et déshydratation
	<ol>
<li>Après la cuisson comme indiqué au point 1.1.3.2 (point d’arrêt facultatif 1), Déparaffiner les sections dans le xylène pendant 5 min avec agitation. Déparaffiner à nouveau dans le xylène frais pendant 5 min Dehydrate dans 100 % EtOH pendant 2 min avec agitation et répéter encore une fois au frais 100 % EtOH pendant 2 min.</li>
		<li>Air sec les diapositives pendant 5 min à 60 ° C dans un four à circulation d’air ou à ta jusqu'à ce qu’ils soient complètement secs (point d’arrêt facultatif 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prétraitement de l’échantillon
	<ol>
<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes de prêt-à-l’emploi de peroxyde d’hydrogène pendant 10 min à RT pour étancher l’activité peroxydase endogène. Décanter la solution de la glisse et les rincer deux fois avec dH2O.</li>
		<li>Incuber les sections avec 200 mL de réactif récupération cible pour 15 à 30 min à 100 ° C dans un cuit-vapeur. Remarque : Le temps d’Incubation peut varier selon le type de tissu. Dans ce protocole, récupération de cible a été effectuée pendant 15 min pour les échantillons de tumeur et boulettes de cellule.</li>
		<li>Décanter la solution de la glisse, rincer deux fois avec dH2O, trempez-les dans 100 % EtOH pendant 3 min et sécher les lames à 60 ° C dans un four à circulation d’air ou à la droite jusqu'à ce que complètement à sec.</li>
		<li>Dessiner une barrière hydrophobe autour de la section à l’aide d’un stylo hydrophobe, environ 0,75 x 0,75 pouces2. Remarque : Il n’est pas recommandé pour dessiner une petite barrière. Pour les plus grandes sections, une plus grande barrière devront être tirées.</li>
		<li>Laissez la barrière sécher complètement pendant 1 min, ou laisser une nuit au RT (point d’arrêt en option 3).</li>
		<li>Déposer les lames dans un support Dia et placez le support de diapositive dans la barre de contrôle d’humidité. Ajouter 4 gouttes de protéase III à chaque diapositive et les incuber pendant 15 à 30 min à 40 ° C dans le four d’hybridation pour la digestion des protéines. Remarque : La période d’Incubation peut varier selon le type de tissu. Dans ce protocole, digestion protéasique a été réalisée pour 30 min pour des échantillons de tumeur et 15 min à pellets de la cellule.</li>
		<li>Décanter la solution de la glisse et les rincer deux fois avec dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hybridation de la sonde
	<ol>
<li>Ajouter 4 gouttes de la solution de sonde appropriée de prêt-à-utiliser pour couvrir la totalité de la section. Si vous utilisez de plus grandes sections, ajouter environ 5 à 6 gouttes.</li>
		<li>Hybrider les sondes pendant 2 h à 40 ° C dans le four de l’hybridation. Décanter la solution de la glisse et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répéter la procédure de lavage dans cette étape.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplification du signal
	<ol>
<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes d’AMP 0 par lame à 40 ° C au four pendant 30 min. décanter la solution hybridation et laver les diapositives dans 200 mL de tampon de lavage 1 x pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répéter la procédure de lavage dans cette étape.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes de AMP 1 par lame à 40 ° C au four pendant 15 min. décanter la solution hybridation et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes de AMP 2 par lame à 40 ° C au four pendant 30 min. décanter la solution hybridation et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes d’huile de 3 AMP par lame à 40 ° C au four pendant 30 min. décanter la solution hybridation et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes de 4 AMP par lame à 40 ° C au four pendant 15 min. décanter la solution hybridation et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes d’huile de 5 AMP par lame à ta pendant 30 min. décanter la solution et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
		<li>Incuber les sections avec ~ 4 gouttes de 6 AMP par lame à ta pendant 15 min. décanter la solution et laver les diapositives dans 200 mL de 1 x tampon de lavage pendant 2 min à ta avec agitation occasionnelle. Répétez la procédure de nettoyage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Détection de signal
	<ol>
<li>Préparer le colorant Fast Red, solution de travail. Pour une diapositive avec une barrière de2 0,75 x 0,75 pouces, ajouter 2 μL de la teinture rouge Fast-B à 120 μL de Fast Red-A dans un tube et bien mélanger. NOTE : Selon la taille de la barrière hydrophobe et le nombre de diapositives, volumes de la solution de travail Fast Red changeront.</li>
		<li>Décanter le liquide en excès de la glisse et ajouter le colorant rouge rapide solution aux diapositives de travail. Incuber les lames pendant 10 min à la droite dans la barre d’État avec un couvercle pour éviter l’exposition à la lumière. Remarque : Utilisez le Fast Red solution moins de 5 min de préparation de travail et ne l’exposez pas aux rayons directs du soleil ou lumière UV.</li>
		<li>Décanter la solution Fast Red et rincer les lames deux fois avec l’eau du robinet. Replacez les diapositives dans une grille coulissante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contre-coloration
	<ol>
<li>Contre-coloration les coupes de tissus avec une solution de 50 % Gill hématoxyline pendant 2 min à RT. Wash les lames avec l’eau du robinet et répétez cette opération plusieurs fois jusqu'à ce que les lames sont claires, alors que les sections restent pourpres. Tremper les lames dans l’eau ammoniaque 0,02 % pour bleuissement (tremper 2 à 3 fois). Remplacer l’eau de l’ammoniac avec l’eau du robinet et de laver les diapositives 3 à 5 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faites glisser le montage
	<ol>
<li>Sèche les diapositives dans un four à circulation d’air à 60 ° C pendant 15 min ou à la droite jusqu'à ce que complètement à sec. Placez 1 à 2 gouttes de réactif montage sur chaque diapositive et lieu lamelles couvre-objet sur chaque section. Éviter tout piégeage de bulles d’air. Sécher à l’air les diapositives pendant au moins 5 min. Remarque : Le substrat Fast Red est sensible à l’alcool. Ne pas déshydrater les diapositives de l’alcool.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Visualisation
	<ol>
<li>Observer les diapositives sous un microscope à fond clair standard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs%3A+Biogenesis%2C+Function%2C+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353(2017).</li>
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<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , Epub ahead of print (2017).</li>
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<li>An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+and+EGFRvIII+in+glioblastoma%3A+signaling+pathways+and+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies.</a> Oncogene. , Epub ahead of print (2018).</li>
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</ol>

Tous les auteurs sont employés par Advanced Cell Diagnostics, Inc.

Dans ce rapport, le nouveau protocole d’essai ISH et ses demandes ont été examinées en détail. Le dosage permet la visualisation directe des jonctions exon, séquences courtes-cible et hautement homologues et des mutations ponctuelles dans le cadre de tissu. Le test est basé sur la technologie de RNAscope5 et est donc capable de détection de molécules simples. Toutefois, en raison d’un système d’amplification avancé, le signal peut être détecté avec des sondes contenant aussi peu qu’une paire de double-Z ou d’une longueur de modèle cible de seulement 50 nucléotides. Parce que les sondes peuvent être aussi courts qu’une seule double-Z dans la longueur, cela permet la détection des jonctions exon, séquences courtes-cible et hautement homologues et mutations ponctuelles (tableau 1).
Pour les bons résultats de l’essai, il y a plusieurs recommandations techniques. Tout d’abord, les tissus doivent être fixés dans du formol tamponné neutre en 10 % frais (NBF) à température ambiante pendant 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) ou overfixation (> 32 h) empêchera la performance du test et peut nécessiter une optimisation supplémentaire. En second lieu, afin d’assurer un contrôle optimal de la température et l’humidité, qui sont nécessaires pour l’amplification de l’hybridation et signal sonde robuste, la diapositive du système et l’hybridation four de traitement doit être utilisée pour obtenir la procédure protocole 2,3 à 5 (sonde de prétraitement, protéase l’hybridation, amplification du signal et détection de signal). Troisième, l’excès de tampons résiduelles doivent être convenablement décanté avant chaque étape tout au long du protocole (mais pas tellement que les coupes de tissus dessèchent). Si les diapositives s’assèchent, signal non spécifique important se développe. Quatrièmement, selon le type de tissu, optimisation de prétraitement peut être nécessaire. À l’aide de la protéase tort ou d’effectuer une durée sous-optimale peut entraîner en sous - ou over - digestion et affectera négativement le signal. Enfin, il est important de toujours exécuter les contrôles positifs et négatifs avec les sondes de test. Sondes de contrôle négatif s’assurer qu’il n’y a aucun signal de fond, et des sondes de contrôle positif, s’assurer que le test a été fait correctement et que la qualité du RNA dans l’échantillon est optimale pour l’interprétation des résultats de la sonde. S’il n’a pas de signal avec la sonde de contrôle positif, alors la qualité RNA dans l’échantillon est probable sous-optimal et un signal ne peut pas s’afficher avec la sonde de test.
En plus de l’analyse manuelle, la possibilité d’effectuer le test sur des automates a été également démontrée (Figure 6). Ce dosage automatisé de ISH donne un ratio signal-bruit élevé et est applicable pour les mêmes applications, comme le montre le tableau 1; Toutefois, les avantages d’un test automatisé incluent la normalisation des conditions expérimentales, minimisation de la variabilité inter-utilisateur et de temps de pratique et provision pour le criblage à haut débit d’échantillons de tissus de manière fiable.
Alors que l’immunohistochimie (IHC) et qRT-PCR permettent pour la détection de variants d’épissage (particulièrement EGFRvIII), dans les échantillons cliniques FFIP, ces techniques peuvent manquer la spécificité nécessaire et n’offrent pas d’aperçu de la résolution spatiale de l’épissure expression de type Variant, respectivement11,12. Un avantage majeur du test dans le présent protocole est sa visualisation très sensible et spécifique des jonctions d’épissure tout en préservant le cadre tissu morphologiques. Ici, capacité de l’essai de cibler précisément les jonctions exon unique pour plusieurs variants d’épissage, y compris l’EGFRvIII et METΔ14, a été démontrée (Figures 3 et 6). En outre, le test s’est avéré de détecter la variante d’épissure AR-V7 dans le cancer de la prostate, plusieurs isoformes de ErbB4 dans le cerveau et la confirmation de la débouchure de Cdr1as d’ARN circulaire dans les souris cerveau3,13,14.
Détection de la cible courte séquence de ce dosage ISH permet pour la visualisation de séquences d’ARN aussi courtes que 50 nucléotides de long, comme en témoigne la détection de séquences CDR3 dérivées de cellules Jurkat (Figure 3). Le test permet aussi de détecter des séquences de gènes qui sont hautement homologues aux autres membres de la famille ou des espèces, comme indiqué par Revêchon et al., qui ont utilisé le test court cible pour détecter les progerin humain exprimé dans la souris blanche du tissu adipeux sous-cutané15. En outre, petits ARN nucléolaire (ARNpno), la modification de gènes CRISPR et précurseur-micro-ARN peuvent être détecté in situ avec le test court cible. Plus récemment, Fu al associé ce dosage ISH IHC pour identifier les cellules précises dans la rétine exprimant le pré-miARN mir125b16.
Mutation de profilage dans les tumeurs est essentielle pour l’étude de la progression des tumeurs et pour le développement de thérapies ciblées. Alors que la mutation de profilage peut être atteint par l’intermédiaire de séquençage haut-débit, cette technologie ne peuvent pas résoudre totalement intratumorale des altérations génétiques hétérogénéité ou un lien avec la morphologie cellulaire17,18. La détection des mutations ponctuelles à l’aide de ce test ISH permet la distinction de séquences d’ARN cible à une résolution de base unique, tel qu’il est validé par la détection des variations de nucléotide de EGFR L858R et G12A KRAS dans les lignées cellulaires (Figure 5). En outre, Baker et al utilisé l’essai de mutation ponctuelle pour cibler plusieurs mutations dans les oncogènes BRAF, KRAS et PIK3CA dans le cancer colorectal,18. Ils ont pu identifier et dans l’espace carte rares sous-clones mutants des cellules tumorales, en fin de compte montrant la manière dont ils contribuent à l’hétérogénéité intra-tumeur.
En résumé, un dosage de RNA ISH spécialisé a été développé. Cette méthodologie permet une détection de variants d’épissage, de courtes séquences et mutations in situ. Il est sensible, précis, quantifiables et adaptables à la performance par des méthodes manuelles et sur des automates.

Technologies haut débit transcriptomique tels que les puces à ADN et le séquençage de RNA de génération (RNAseq) améliorent exponentiellement la découverte de biomarqueurs RNA avec valeur clinique diagnostique, pronostique et prédictif de maladies diverses, y compris le cancer1,2. Pour faire progresser l’utilisation de ces biomarqueurs dans la médecine de précision, il y a une grande nécessité de technologies normalisées et robustes qui peut mesurer des biomarqueurs RNA dans le contexte de tissu d’échantillons cliniques. Bien que largement établie grind-lier et dosages comme RNAseq et RT-PCR quantitative activez Mensurations d’expression de gène hautement sensible, l’homogénéisation des tissus requis et ARN impliquent la perte de in vivo la spécificité cellulaire de type et l’information morphologique3. Méthodologies de détection conventionnels en situ ARN n’ont pas la sensibilité et la spécificité nécessaire pour mesurer de manière fiable rares ou peu exprimant des biomarqueurs RNA dans le contexte de tissu4.
Un commercial essai in situ hybridation (ISH) avec (e.g., le test de RNAscope) est une technologie qui a relevé ces défis et permet également la visualisation très sensible et spécifique des molécules d’ARN unique supérieures à 300 nucléotides dans le contexte morphologique de tissu. Ce type de test utilise un oligonucléotide unique sonde d’environ 6 à 20 paires de double-Z sonde combinée avec une amplification de signal avancé basé sur l’hybridation5.
Cette étude décrit une analyse de RNA ISH spécialisée, BaseScope, complémentaires à la technologie commerciale précédemment conçue pouvant détecter des séquences de l’ARN cible aussi courte que 50 nucléotides à une résolution de nucléotide. Ce test aborde la complexité complexe de la transcriptomique et est applicable pour la détection précise des jonctions exon, séquences cibles courte et des mutations ponctuelles dans le cadre de tissu (tableau 1), en utilisant aussi peu qu’une paire de sonde double-Z. Ce rapport montre le protocole d’essai complet et son utilisation dans la détection de variants d’épissage, CDR3 séquences des clones de lymphocytes de récepteurs, et des mutations mononucléotidiques FFIP cell lines et tissus tumoraux.

<table><tbody><tr><td>Four HybEZ (110 ou 220 VAC) ou Four HybEZ II (110 ou 220V)</td><td>ACD</td><td>310010 ou 310013 (HybEZ&trade ;), 321710 ou 321720 (HybEZ&trade ; II)</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de contrôle de l’humidité HybEZ (avec couvercle)</td>Rack de diapositives <td>ACD</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>ACD EZ-Batch (capacité de 20 diapositives) 1 rack 310017</td><td></td><td>Papier humidificateur ACD</td> 310017 <td></td></tr><tr><td>HybEZ Stylo</td> barrière hydrophobe <td>ACD</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge (requis)&nbsp ;</td><td>Laboratoire Vectoriel&nbsp ;</td><td>Glissières H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus (obligatoires)</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Formol à tampon neutre à 10 %</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>MLS</td> <td>/</td> <td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Gill' s Hématoxyline I&nbsp ;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td> HXGHE1LT</td><td>principal fournisseur de laboratoires MLS en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific/MLS</td><td>X3P-1GAL</td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&nbsp ;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWSRA24</td><td>principal fournisseur de laboratoires MLS en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Boîtes de coloration Tissue-Tek&nbsp ;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWT4457EA</td><td>principal fournisseur de laboratoire MLS en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Agent nettoyant Vaisselle, résistant au xylène&nbsp ;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWT4456EA</td><td>principal fournisseur de laboratoire MLS en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>100 % d’alcool (EtOH)&nbsp ;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>ALREACS</td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Support de montage permanent VectaMount (requis)</td><td>Vector Labs&nbsp ;</td>Verre <td>de protection H-5000</td><td></td></tr><tr><td>, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific/MLS&nbsp ;</td><td>12-545-F</td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>hydroxyde d’ammonium, 28 po ; 30 %</td><td>Sigma-Aldrich/MLS</td><td>320145-500mL</td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Carboy (>3L)</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Oster Steamer modèle 5712, Black and Decker Steamer HS3000, ou le Braun Multiquick FS 20 Steamer</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Bain-marie ou incubateur, capable de maintenir la température à 40 +/&ndash ; 1 &deg ; C</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Important fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Pipettors et pointes, 1&ndash ; 1 000 &mu ; L</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Tubes (différentes tailles)</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Hotte MLS</td><td>/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Cylindre gradué</td><td>MLS/MLS</td><td></td> <td>Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Essuie-tout ou papier absorbant</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Microscope et accessoires</td><td>MLS/MLS</td><td></td> <td>Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Four de séchage, capable de maintenir la température à 60 +/&ndash ; 1 &deg ; C</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Important fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal fournisseur de laboratoire en Amérique du Nord. Pour les autres régions, veuillez vérifier les numéros de catalogue auprès de votre fournisseur de laboratoire local.</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Fisher Scientific/MLS</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs BaseScope - RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322900</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701701</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>701711</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701721</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701731</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-MET-E14E15</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701811</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-MET-E13E15</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701801</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-KRAS-G12A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>705491</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>705531</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-L858R</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>705451</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>705461</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Control Probe Pack</td> Human <td>Advanced Cell</td><td>Diagnostics 322975</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des variants génétiques, quelques cibles et des mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un arn essai in situ hybridation avec

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Parce que la médecine de précision dépend fortement de la détection précise des biomarqueurs, il y a un besoin croissant de technologies normalisées et robustes qui mesurent RNA biomarqueurs in situ dans les échantillons cliniques. Tandis qu’essais de mouture-et-bind comme RNAseq et RT-PCR quantitative permettent des mesures d’expression de gène très sensibles, ils exigent également l’extraction de l’ARN et prévenir ainsi les analyse de l’expression précieuse dans le cadre de tissu morphologiques. L’essai in situ hybridation (ISH) avec décrite ici permet de détecter des séquences de l’ARN cible aussi courte que 50 nucléotides à une résolution de simple-nucléotide et au niveau de single-cell. Ce test est complémentaire à l’essai commercial développé précédemment et permet la sensible et spécifique le in situ détection de variants d’épissage, quelques cibles et des mutations ponctuelles dans les tissus. Dans ce protocole, sondes ont été conçus pour cibler les jonctions exon unique pour deux variants d’épissage cliniquement importants, EGFRvIII et METΔ14. La détection de séquences cibles courte a été démontrée par la détection spécifique des séquences CDR3 de T-cellule récepteurs α et β dans la ligne de cellules T Jurkat. Également montré est l’utilité de ce test ISH pour la distinction de séquences d’ARN cible à résolution mononucléotidiques (mutations ponctuelles) par le biais de la visualisation des variations mononucléotidiques EGFR L858R et KRAS G12A lignées cellulaires à l’aide de coloration automatisé plates-formes. En résumé, le protocole montre un essai d’ARN ISH spécialisé qui permet la détection de variants d’épissage, de courtes séquences et mutations in situ pour une performance manuelle et sur des automates.

In situ hybridation dosage workflow : Le flux de travail est représenté dans la Figure 1 et se compose de quatre parties : perméabilisation de cellules ou tissus avec récupération de la cible et protéase solutions, hybridation des sondes d’ARN, de la cible du signal amplification et visualisation du signal. Le signal peut aussi être quantifié à l’aide de systèmes de logiciels d’imagerie numérique ou d’une manière semiquantitative basée sur le nombre de points par cellule. La procédure manuelle décrite à la Figure 2 a également été entièrement automatisée dans les systèmes commerciaux de coloration à l’auto.
Représentant de coloration pour la détection de jonction exon (variante d’épissure de EGFRvIII) : EGFRvIII est une variante du récepteur de facteur de croissance épidermique, qui résulte d’une suppression de génomique dans le cadre des exons 2 à 7, conduisant à la signalisation d’oncogènes constitutivement actif7 . Le test servait à identifier le statut de EGFRvIII dans des échantillons de tumeur FFIP glioblastome (GBM). Seul double-Z sondes ont été conçus pour enjamber les jonctions exon pour détecter soit WT, mutant, ou les deux transcriptions (Figure 3 a). Les sondes WT EGFR couvrent les jonctions des exons 1 et 2 (E1/E2) ou des exons 7 et 8 (E7/E8), alors que les sondes de EGFRvIII spécifiques couvrent la jonction des exons 1 et 8 (E1/E8). Une sonde commune qui s’étend sur la jonction des exons 8 et 9 (E8/E9) était également utilisée pour détecter EGFR total (les deux versions WT et EGFRvIII transcriptions). Toutes les sondes servent ensuite à déterminer le statut EGFR dans les échantillons FFPE GBM. Les deux exemples représentatifs, illustrés à la Figure 3 b ont été tirées d’une étude plus vaste. EGF a été confirmée par une méthode indépendante, RT-PCR. Les deux sondes WT détecté le signal dans les deux échantillons, ce qui indique que les deux échantillons exprimant l’EGFR WT (Figure 3 b). Cependant, la sonde mutante ne montrait de détection de signal dans l’EGFRvIII + échantillon, confirmant que cet échantillon est en effet positif pour la variante de EGFRvIII (Figure 3 b, panneaux de gauche). À l’inverse, la sonde mutante ne détecte pas de signal dans l’EGFRvIII-l’échantillon (Figure 3 b, panneaux de droite). Globalement, ces résultats démontrent que le dosage de jonction exon peut identifier EGFRvIII statut dans des échantillons de tumeur GBM FFPE.
Représentant une coloration pour quelques cibles : Le CDR3, ou la région déterminante complémentaire 3, est un domaine très variable dans les récepteurs des lymphocytes T. En règle générale, la séquence CDR3 sont assez courts ; par exemple, les séquences de CDR3 α et β de la lignée de cellules T Jurkat sont respectivement de 51 et 48 nucléotides de long (Figure 4 a). Pour identifier les séquences spécifiques de la CDR exprimés dans les cellules Jurkat, sondes antisens pour CDR3 α et β qui sont exprimées dans la lignée de cellules T Jurkat ont été générés, en plus des sondes de sens pour CDR3 α et β pour servir de témoin négatif des sondes. Toutes les sondes ont ensuite été testées dans les cellules Jurkat FFIP préparés avec le test. Une coloration robuste a été observée avec des sondes pour les deux CDR3 anti-sens α et β dans les cellules Jurkat, tandis que le sens des sondes ne détectées peu à aucun signal (Figure 4 b). Ces résultats démontrent la capacité du test objectif court de discerner entre les séquences de CDR très variables, mais courts pour les clones de T-cell receptor.
Représentant une coloration pour point mutation EGFR L858R : Mutation ponctuelle sondes ont été développées pour détecter les variations de nucléotide et petites insertions ou délétions (INDELs) dans le cadre de la tumeur. Figure 5 a démontre des aptitudes pour la détection in situ de la mutation ponctuelle EGFR L858R (2573T &gt; G). Deux sondes ont été conçus : un pour détecter les L858R muté séquence EGFR et un autre pour détecter la séquence de l’EGFR L858 WT. Les deux sondes ont été testés dans deux lignées cellulaires préparés FFIP : H2229, qui exprime seulement EGFR L858 WT ; et H1975, qui est hétérozygote pour la mutation de l’EGFR L858R. La sonde de mutant L858R détecté le signal que dans la lignée de cellules H1975, mais pas dans la lignée de cellules H2229. Cependant, la sonde WT détecté le signal dans les deux lignées cellulaires. De même, Figure 5 b visualise in situ la détection de la mutation ponctuelle KRAS G12A (35 G &gt; C). Deux sondes ont été conçus pour détecter les séquences KRAS G12A MT et KRAS G12 WT et puis testés sur la lignée cellulaire de HuT78 (qui seulement se déclare KRAS G12 WT) et la lignée de cellules de SW116 (qui est hétérozygote pour la mutation KRAS G12A). Alors que la sonde de KRAS G12 WT détecté le signal dans les deux lignées cellulaires, la sonde KRAS G12A détecté seulement le signal dans la lignée de cellules SW116. Pris ensemble, ces résultats démontrent la capacité technique de l’essai de mutation ponctuelle dans la détection de polymorphismes dans le contexte de cellules et de tissus.
Représentant de coloration pour le test automatisé in situ : Tests automatisés permettent un plus grand nombre d’échantillons à exécuter de façon plus fiable, minimisant la variabilité inter-utilisateur et temps pratique et générer des résultats reproductibles constamment. Par conséquent, une version automatisée de l’essai a été développée. Pour illustrer la coloration automatisé avec ce dosage, détection de la variante d’épissure METΔ14 a été étudiée. Cette variante est le résultat de 14 d’exon du gène MET étant ignorées pendant le pré-ARNm épissage, qui conduit à l’activation constitutive et transformation oncogénique du récepteur MET8,9. Pour détecter spécifiquement la variante METΔ14, visaient deux sondes de jonction exon : une qui s’étend sur la jonction des exons 13 et 15 (E13/E15) pour détecter la transcription variante de METΔ14 et l’autre qui s’étend sur la jonction des exons 14 et 15 (E14/E15) pour détecter le WT TME transcription (Figure 6 a). Les deux sondes ont ensuite été testées en 2 lignées de cellules FFIP préparés : H596, qui exprime la variante METΔ14, et A549, qui exprime le gène WT a rencontré. Les deux sondes ont montré des modèles d’expressions mutuellement exclusives, avec la sonde E13/E15 seulement détecter de signal dans les cellules de la H596 et la sonde E14/E15 seulement détecter de signal dans les cellules A549 (Figures 6 b et 6C). Enfin, la sonde pour dapB a montré aucun signal n’indiquant aucun signal de fond (Figures 6 b et 6C). Dans l’ensemble, ces données montrent une détection spécifique du MET variant METΔ14 in situ utilisant le test automatisé de BaseScope.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> Figure 1 : Le flux de travail test. Le workflow se compose de 4 grandes étapes : prétraitement pour permeabilize des cellules ou tissus, hybridation de la sonde à l’ARN, cible l’amplification du signal et détection de signal par visualisation sous microscope fond clair ou fluorescent. Les points individuels peuvent être quantifiées à l’aide d’une plateforme d’analyse image numérique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> Figure 2 : Illustration du protocole de dosage manuel. Le test complet peut être complété en 9 h. prétraitement, la durée peut varier selon le type de tissu, il est donc conseillé de consulter annexe A du manuel de recommandations de prétraitement de tissu au sujet de la période d’incubation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> Figure 3 : Des images représentatives de détection de jonction exon. (A) montré ici sont l’organisation exon transcriptions EGFR WT et EGFRvIII et un schéma illustrant les sondes de jonction exon double-Z qui chevauchent la jonction pour détecter EGFR WT ou EGFRvIII. (B) l’exon jonction test a été réalisé sur deux échantillons de glioblastome FFIP utilisant les sondes énumérés au point A, ainsi que d’un dapB sonde de contrôle, POLR2A et la sonde de contrôle négatif, positif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> Figure 4 : Détection de séquences images représentatives de cible court. (A) montré ici sont des séquences de CDR3 dans les cellules Jurkat. La séquence en noir est une séquence commune flanquante et la séquence en rouge est unique à CDR3α ou à CDR3β. Sondes de séquence cible court unique double-Z ont été conçus contre ces séquences. (B) le test court cible a été réalisée sur les cellules Jurkat préparés comme un culot cellulaire FFPE en utilisant des sondes anti-sens ou sens ciblant les séquences en (A), et dapB a été utilisé comme contrôle négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> Figure 5 : Des images représentatives de détection de mutation ponctuelle. (A) l’analyse a été réalisée sur H2229 cellules (homozygotes pour L858 EGFR) et H1975 (hétérozygote pour la mutation de l’EGFR L858R) préparé comme un culot à l’aide de sondes de mutation ponctuelle double-Z ciblant la séquence de l’EGFR L858 WT ou EGFR L858R FFIP séquence mutée. (B), l’essai de mutation ponctuelle a été réalisée sur les cellules HuT78 (homozygotes pour KRAS G12A) et les cellules SW116 (hétérozygotes pour la mutation KRAS G12A) préparés comme un culot cellulaire FFIP à l’aide de sondes de mutation ponctuelle double-Z ciblant la séquence KRAS G12 WT ou Séquence G12A KRAS muté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> Figure 6 : Des images représentatives de coloration automatisé avec le test de jonction exon. (A) il est décrit ici est l’organisation exon transcriptions rencontré WT et METΔ14 et un schéma illustrant les sondes de jonction unique double-Z exon qui chevauchent la jonction pour détecter rencontré WT ou METΔ14. (B) et (C), le dosage de jonction exon automatisé a été réalisée sur les cellules de H596 (exprimant METΔ14) et les cellules A549 (exprimant rencontré WT) préparés comme un culot cellulaire FFIP utilisant les sondes énumérés au point A, ainsi que de la dapB de sonde de contrôle négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Jonction exon</td>
			<td>Courte séquence</td>
			<td>Mutation ponctuelle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variante/isoforme d’épissure</td>
			<td>Séquences entre 50 et 300 nt</td>
			<td>Mutation ponctuelle</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA circulaire (circRNA)</td>
			<td>Séquences très homologues</td>
			<td>Indel court</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fusion de gènes</td>
			<td>CDR3 séquence des clones TCR</td>
			<td>Gène d’édition</td>
		</tr>
<tr>
<td>Knockout (KO) de la gène</td>
			<td>Pré-miARN</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Petits ARN nucléolaire (ARNpno)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gène d’édition</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : demandes de la in situ dosage. Il existe 3 grandes catégories pour les applications de ce test : jonction exon, séquence cible court et mutation ponctuelle. Chaque colonne sont quelques exemples d’application spécifiques pour chaque catégorie.

Nous décrivons ici une analyse de l’hybridation in situ qui permet la détection sensible et spécifique des séquences aussi courtes que 50 nucléotides avec résolution de simple-nucléotide au niveau unicellulaire. L’analyse, qui peut être réalisé manuellement ou automatiquement, pouvez activer la visualisation des variants d’épissage, courtes séquences et des mutations dans le cadre de tissu.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Cette méthode peut répondre à des questions de recherche clés en neurosciences, en oncologie et au-delà, telles que l’expression spécifique au type de cellule et la cartographie spatiale des variantes d’épissage dans les microenvironnements cérébraux et tumoraux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter des jonctions d’exons, des séquences courtes et des mutations ponctuelles dans le contexte tissulaire avec une sensibilité et une spécificité très élevées dans des cellules uniques. La démonstration de la procédure sera assurée par Hell Pimentel, un scientifique associé de notre laboratoire.Pour préparer le tissu, fixez-le immédiatement après la dissection dans du formol tamponné neutre à 10 % à température ambiante pendant 16 à 32 heures. Ensuite, l’échantillon est traité et incorporé dans de la paraffine selon des procédures standard. Coupez le tissu incrusté en cinq sections de plus ou moins un micron à l’aide d’un microtome.Montez les sections sur des lames de verre électrostatiquement adhésives et faites-les sécher à l’air libre à température ambiante pendant la nuit. Une heure avant d’effectuer le test d’hybridation de l’ARN NC2, placez les lames de tissu montées dans une grille à lames et faites-les cuire dans un four à air circulant à 60 degrés Celsius. Avant de commencer l’essai d’hybridation de l’ARN NC2, assurez-vous que le four d’hybridation est réglé à 40 degrés Celsius.Mouillez soigneusement le papier humidificateur, retirez toute eau résiduelle et placez le couvercle sur le plateau de contrôle de l’humidité. Préparez 200 millilitres de réactif de récupération de cible 1X disponible dans le commerce en ajoutant 20 millilitres de réactif de récupération de cible 10X à 180 millilitres d’eau. Placez deux supports de glissières dans un cuiseur vapeur.Remplissez un porte-lames avec 200 millilitres de réactif de récupération de cible 1X et l’autre avec 200 millilitres d’eau. À l’aide du cuiseur vapeur, chauffer les deux solutions à ébullition. Réchauffez le tampon de lavage 50X à 40 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.Préparez ensuite trois litres de tampon de lavage 1X en diluant 60 millilitres de tampon de lavage 50X préchauffé avec 2,94 litres d’eau. Dans une hotte, préparez 50 % de la solution de contre-coloration à l’hématoxyline de Gill en ajoutant 100 millilitres d’hématoxyline de Gill à 100 millilitres d’eau. Préparez le réactif de bleuissement en ajoutant 1,43 millilitre de 20 à 30 % d’hydroxyde d’ammonium à 250 millilitres d’eau.Préchauffez les sondes cibles à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes avant l’hybridation de la sonde. Amenez les sept réactifs amplificateurs, ampères 0 à 6, à température ambiante. Commencez la dépariffinisation de l’échantillon en sortant les sections du four et en immergeant les lames de tissu montées dans du xylène en agitant pendant cinq minutes.Dépariffiniser à nouveau dans du xylène frais pendant cinq minutes. Déshydrater dans de l’éthanol à 100 % avec agitation pendant deux minutes. Et répétez à nouveau dans 100 % éthanol frais pendant deux minutes.Faites sécher les lames à l’air libre à 60 degrés Celsius dans un four à air circulant pendant cinq minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Ensuite, incubez les sections avec environ quatre gouttes de peroxyde d’hydrogène prêt à l’emploi à température ambiante pendant 10 minutes pour éteindre l’activité de la peroxydase endogène. Décantez la solution des lames et rincez-les deux fois à l’eau.Trempez brièvement les sections dans l’eau préchauffée, puis placez les sections dans 200 millilitres du réactif de récupération cible à 100 degrés Celsius dans le cuiseur vapeur pendant 15 à 30 minutes. Retirez les lames de la récupération de la cible et rincez-les deux fois à l’eau. Trempez-le dans de l’éthanol à 100 % pendant trois minutes.Ensuite, séchez les lames à 60 degrés Celsius dans un four à air circulant jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Une fois que les lames sont sèches, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner une barrière hydrophobe d’environ 0,75 pouce sur 0,75 pouce autour de la section. Laissez la barrière sécher complètement à température ambiante pendant une minute.Placez les diapositives dans un support de diapositives et placez le support de diapositives dans le plateau préchauffé à humidité contrôlée. Ajoutez environ quatre gouttes de protéase 3 sur chaque lame et incubez à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant 15 à 30 minutes. Décantez la solution des lames et rincez-les deux fois à l’eau.Pour commencer la procédure d’hybridation de la sonde, ajoutez environ quatre gouttes de la solution de sonde prête à l’emploi appropriée pour couvrir toute la section. Hybridez les sondes à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant deux heures. Décantez la solution des lames et lavez les lames dans 200 millilitres de tampon de lavage 1X à température ambiante avec une agitation occasionnelle pendant deux minutes.Répétez la procédure de lavage. L’étape suivante consiste à amplifier le signal en incubant les sections dans une série de réactifs amplificateurs. Ajoutez environ quatre gouttes d’Amp 0 pour couvrir toute la section de chaque lame et incubez à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation pendant 30 minutes.Ensuite, décantez la solution et lavez les lames dans 200 millilitres de tampon de lavage 1X à température ambiante avec une agitation occasionnelle pendant deux minutes. Répétez la procédure de lavage. De la même manière, incubez les sections de l’ampli 1 à l’ampli 6 à la température et pendant la durée indiquées dans ce schéma.Une fois que les lames ont été traitées avec la série de réactifs d’amplification, préparez une solution de travail de colorant Fast Red. Ajoutez le volume approprié de colorant Fast Red-B et de colorant Fast Red-A dans un tube et mélangez bien. Décantez l’excès de liquide des lames et ajoutez la solution de travail du colorant Fast Red aux lames.Incuber les lames dans un plateau avec un couvercle à température ambiante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, décantez la solution Fast Red et rincez les lames deux fois en les trempant de haut en bas avec de l’eau du robinet. Pour contre-colorer les sections de tissu, plongez les lames dans la solution d’hématoxyline à 50 % de Gill à température ambiante pendant deux minutes.Lavez les lames à l’eau du robinet, en répétant cette opération plusieurs fois jusqu’à ce que les lames soient claires tandis que les sections restent violettes. Trempez les lames dans de l’eau ammoniacale à 02 % deux à trois fois pour bleuir. Remplacez l’eau ammoniacale par de l’eau du robinet et lavez les lames trois à cinq fois.Faites sécher les lames dans un four à air circulant à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Placez une à deux gouttes de réactif de montage sur une lamelle et placez la glissière sur la lamelle tout en évitant tout piégeage de bulles d’air. Faites sécher les lames à l’air libre pendant au moins cinq minutes.Enfin, observez les lames sous un microscope à champ clair standard. Les sondes à jonction d’exon Double-Z ont été conçues pour déterminer le statut EGFRvIII dans deux échantillons de glioblastome fixé à la paraffine ou FFPE. Les deux sondes de type sauvage ont détecté un signal dans les deux échantillons, indiquant que les deux échantillons expriment un EGFR de type sauvage.Cependant, la sonde mutante n’a détecté le signal que dans l’échantillon positif EGFRvIII et non dans l’échantillon négatif EGFRvIII. Des sondes de contrôle positives et négatives ont été incluses dans l’essai. Lorsqu’un test sur cible courte a été effectué sur des cellules Jurkat, préparées sous forme de pastille de cellule FFPE à l’aide de sondes antisens ou sensorielles, ciblant les séquences en rouge, une coloration robuste a été observée avec des sondes antisens pour CDR3-alpha et CDR3-bêta, tandis que les sondes sensorielles ont détecté peu ou pas de signal.dapB a été utilisé comme témoin négatif. Le test est également capable de détecter des mutations ponctuelles. Dans cet exemple, deux sondes ont été conçues, l’une pour détecter la séquence EGFR mutée L858R et l’autre pour détecter la séquence de type sauvage EGFR L858.La sonde mutante a détecté un signal dans la lignée cellulaire H1975, qui est hétérozygote pour la mutation EGFR L858R, mais n’a pas détecté de signal dans la lignée cellulaire H2229, qui n’exprime que le type sauvage EGFR L858. La sonde de type sauvage a détecté un signal dans les deux lignées cellulaires. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de fixer correctement vos tissus, d’exécuter des sondes de contrôle positives et négatives et d’utiliser le système de traitement des lames dans le four d’hybridation.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’IHC avec des marqueurs cellulaires peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de l’expression spécifique du type cellulaire des variantes d’épissage ou des séquences cibles courtes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences, en oncologie et au-delà pour explorer des événements d’épissage alternatifs dans le contexte tissulaire, en identifiant des mutations ponctuelles spatialement cartographiées et en visualisant des séquences très homologues et courtes in situ. N’oubliez pas que travailler avec du formol et du xylène tamponnés neutres peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte et le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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