Name: La découpe et la méthode flottante pour tissus inclus en paraffine pour le sectionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Apprenez une méthode de sectionnement en paraffine améliorée combinant coupe et flottation dans une chambre thermostatique pour tissus de souris et zèbre. Cette technique élimine le transfert traditionnel et augmente significativement le rendement de coupes intactes.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 31400936, 31460260) et la Fondation sciences naturelles du Jiangxi Province de Chine (20171BAB215020). Nous remercions également le programme conjoint entre l’Université de Nanchang et Queen Mary University of London pour soutenir ce travail.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité emploi de l’Université de Nanchang et animalier.
1. Assemblez l’équipement et le Microtome
<ol><li>Concevoir le paramètre aux exigences (supplémentaire Figure 1).</li>
	<li>Envoyer le paramètre à une usine locale pour fabriquer les panneaux acryliques.</li>
	<li>Assembler toutes les pièces dans l’ordre : chloroforme permet de combiner les 7 planches acryliques commerciales dans un réservoir avec un bain section de canal et de l’eau (Figure 1). ATTENTION : Chloroforme produit des substances toxiques lorsqu’il rencontre la lumière et l’oxygène. Assembler l’appareil sous une hotte.</li>
	<li>Installez l’élément chauffant tubulaire dans le trou en acrylique Conseil #1 (Figure 2 a, , flèche).</li>
	<li>Pour installer le régulateur de température, créez un petit trou sur le plateau acrylique #2 à l’aide d’une perceuse électrique et installer le détecteur de température (Figure 2 a, , flèche). Installez un thermostat numérique sur le réservoir (Figure 2 a). Remarque : Le détecteur de température devrait être moins de 1 cm sous la surface de l’eau.</li>
	<li>Pour pouvoir accéder, ajuster la tension au-dessous de 24 V avant d’allumer l’appareil.</li>
	<li>Retirez le bac à déchets section le microtome.</li>
	<li>Lien vers le canal de sections avec le porte-lame microtome avec un scellant au silicone neutre (Figure 2 b). Remarque : Ne pas salir tout mastic silicone neutre au-dessus de la lame afin que la lame usagée est facilement remplaçable.</li>
	<li>Sécher toute la nuit pour permettre au chloroforme et le temps du mastic silicone neutre pour solidifier.</li>
	<li>Installer la lame dans le porte-lame. Versez l’eau dans le bain d’eau (Figure 2). La surface de l’eau doit juste toucher la partie supérieure de la lame (tête de flècheFigure 2D, ).</li>
</ol>2. sectionnement de paraffine
Remarque : Les débris s’accumulent souvent sur les bords supérieurs ou inférieurs de l’édifice de la cire et la surface de l’eau. Ces débris doivent être nettoyées régulièrement.
<ol><li>
Effectuer la paraffine conventionnelle la section10.
	<ol>
<li>Le spécimen de paraffine sur un microtome rotatif et l’insérer la lame dans un porte-pale.</li>
		<li>Tourner le volant et le modèle de l’article.</li>
		<li>Transférer le ruban de paraffine sectionné dans le bain d’eau chaude de 38,5 ° C.</li>
		<li>Ramasser que les sections sur le microscope glissent à la surface de l’eau après dépliage.</li>
		<li>Sécher les lames dans une étuve à 42 ° C pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paraffine améliorée de sectionnement (Figure 3)
	<ol>
<li>Allumez l’appareil.</li>
		<li>Ouvrir l’appareil de chauffage avec interrupteur de détection de température et régler la température ciblée entre 38,0 ° C à 40,0 ° C pendant 1 h à l’avance réchauffer l’eau.</li>
		<li>Modifier le bloc de paraffine acquis par enrobage de paraffine ; Ensuite, placez le bloc de paraffine sur cassette de serrage du microtome et verrouillez-la. Remarque : Les bordures supérieures et inférieures du bloc de paraffine doivent être modifiés horizontalement afin d’éviter le ruban section formant un arc de cercle et de leur incapacité à s’écouler par le canal de sections étroites.</li>
		<li>Se rapprocher rapidement l’échantillon par la coupe des sections plus épaisses.</li>
		<li>S’adapter à une épaisseur de coupe approprié (10 µm pour les cerveaux de souris adultes, les reins de souris adultes et cerveau de souris embryon, 4 µm pour les yeux de poisson zèbre). Tourner le volant et les sections entrera automatiquement le canal de sections et de bain.</li>
		<li>L’article le spécimen dans une course lente et uniforme (Figure 3 a). Remarque : Thethickness de la première section sera modifiée après que le volant a été arrêté pendant quelques minutes. Les lames jetables doivent être remplacés lorsque les sections ont des rayures consécutives.</li>
		<li>Guidez les sections dans la chambre de bain à flotter en ligne (Figure 3 b, 3C). Remarque : Si la section head adhère à la paroi de la chambre, utiliser un guide de la brosse pour le garder flottant.</li>
		<li>Respecter les sections sur lames de microscope. Après les sections se déroulent entièrement dans le bain d’eau, séparé de plusieurs sections avec des pincettes. Ensuite, ramasser de l’eau du bain sur les lames de microscope (Figure 3D). NOTE : Sections doivent être ramassées de la partie postérieure de la baignoire d’eau, comme ceux de la manche de sections et la partie antérieure de l’eau du bain ne sera pas encore entièrement dépliés.</li>
		<li>Sécher les lames en les plaçant dans un four à 42 ° C pendant la nuit. Les lames peuvent ensuite être stockés à température ambiante indéfiniment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser la coloration hématoxyline-éosine (HE) dans un souci de l’évaluation de la méthode améliorée de8.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li>
<li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li>
<li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid-Cut%3A+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).</li>
<li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).</li>
</ol>

Les auteurs ont un brevet sur ce dispositif et ne déclarent aucun intérêts opposés.

Pour améliorer la paraffine section morphologie et résoudre le problème de perte de temps au cours de la paraffine conventionnelle de sectionnement, nous avons créé une paraffine meilleure méthode qui combine la coupe et du dépliage de sectionnement. Cette méthode améliorée s’appuie sur des équipements simples qui comprend un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Le ruban de la section entre le bain d’eau à travers le canal de la section et se déploi...

Étude morphologique est importante dans la recherche biologique. Bien que la nouvelle technologie a permis aux chercheurs d’observer leurs cibles directement du tissu entier ou organismes1,2,3, coupant le spécimen en lames minces, suivie d’une coloration, reste le principal la morphologie tissulaire seule méthode fornot mais aussi protéine ciblant directement dans le tissu. Microscopie optique utilise trois types de section : paraffine, congelé et semi-fines. Bien que cryosectioning est commun pour protéger l’antigénicité des tissus, et la préparation des échantillons est simple, la morphologie des tissus conservés est pauvre et impropres à être mince séparation4,5. Sectionnement de paraffine est la méthode le plus souvent utilisée pour qui présentent une morphologie bien conservée. Comme les spécimens sont déshydratées complètement et incorporés dans la cire, les blocs de paraffine peuvent être conservés indéfiniment. En outre, paraffine sectionnement produit des coupes minces qu’améliorer l’accès de la sonde biologique dans d’autres expériences et réduisent la superposition de couche de cellule dans la direction Z.
Cependant, paraffine conventionnelle de sectionnement est fastidieux et exige des compétences de l’opérateur. Sections de paraffine subissent une fixation, déshydratation, enrobage, découpage et flottant. Ce qui est important, rubans section proviennent du porte-couteau à l’eau du bain est nécessaire mais difficile pour les opérateurs juniors. Surtout dans l’air sec, les rubans de section seront tordre à cause de l’électricité statique et sont difficiles à se dérouler sur la surface de l’eau tiède. Afin d’améliorer la section qualité, humidifier la surface du tissu exposé entre les passages de lame microtome, refroidissement des blocs de cire en l’immergeant dans l’eau glacée, ou le relèvement de l’humidité avec un humidificateur près du microtome est recommandée6,7 . Des méthodes plus récentes pour améliorer le sectionnement de la paraffine incluent hybride enrobage de paraffine, cryosectioning8et section commerciale transfert système assistance9. Bien que ces méthodes améliorent partiellement paraffine sectionnant la rapidité et la qualité, ils font la section beaucoup plus encombrante, et systèmes de transfert de la section commerciale sont chers.
Dans ce protocole, nous montrent comment créer des équipements simples, bon marché et flexible étape par étape, qui peuvent être reliée au détenteur d’un microtome à lame. Cet équipement se compose d’un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Après la découpe, des dizaines de sections se jettent dans le canal de section et entrer dans le bain d’eau directement, donc qui se déroulent automatiquement. Cela améliore l’efficacité de sectionnement de la paraffine et rend cette technologie plus commode. En utilisant cette méthode, plus adulte souris hippocampe sections, sections de rein de souris adultes, embryonnaires 15,5 sections jour-vieux (E15.5) souris cerveau et œil de poisson-zèbre adulte sections ont été récoltées en moins de temps et est restées intact plus morphologiquement. Cette méthode peut également être utilisée pour d’autres échantillons de tissus qui requièrent le sectionnement de paraffine accéléré tout en évitant la perte de distinction de la section.

<table><tbody><tr><td>Incubateur</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp ;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Couvercle</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Couvercle</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Module d’enrobage de paraffine chauffée</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carte</td><td></td><td></td><td></td>acrylique commerciale</tr><tr><td>Trichlorométhane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Couvercle</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Élément chauffant électrique tubulaire (12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température (12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif</td>Mastic silicone neutre <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Reliez le canal d’eau avec le porte-couteau microtome</td>Transformateur de tension Dearll S-250-12 Lame jetable Accu-Edge 4689 Hématoxyline Baso Diagnostics Inc.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp ;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Marque</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Baume neutre</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Couvercle</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&nbsp ;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie pour coupes de paraffine</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&nbsp ;- Plaque froide</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spray répulsif pour paraffine&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

la découpe et la méthode flottante pour tissus inclus en paraffine pour le sectionnement

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Découpe des tissus inclus en paraffine est largement utilisé en histologie et pathologie. Toutefois, il est fastidieux. Pour améliorer cette méthode, plusieurs sociétés commerciales ont mis au point des systèmes de transfert de section complexe à l’aide de l’eau liquide. Pour simplifier cette technologie, nous avons créé une méthode simple à l’aide de matériel fait maison qui combine coupe et flottant dans une enceinte thermostatique simple ; par conséquent, les sections automatiquement dans le bain d’eau à la surface de l’eau. L’hippocampe du cerveau de souris adultes, reins de souris adulte, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre adulte ont été coupés à l’aide de paraffine conventionnelle de sectionnement et de la méthode présentée aux fins de comparaison. L’analyse statistique montre que notre méthode améliorée enregistrés fois et produit des Articles de qualité supérieures. En outre, il est facile pour les opérateurs juniors de paraffine sectionnement d’un spécimen entier en peu de temps.

La méthode améliorée a augmenté le nombre de sections de paraffine intact. Nous avons testé cette nouvelle méthode sur souris adulte tissu hippocampique, reins de souris adultes, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre. L’eau a été ajoutée au réservoir, et la température de l’eau a été maintenue entre 38,0 ° C à 40,0 ° C. Après une série de préparation les échantillons de tissus, ils étaient sectionnés et par rapport aux coupes classiques. La nouvelle méthode évité la pe...

Nous présentons ici un protocole visant à améliorer le sectionnement de la paraffine. Cette méthode combine coupe et flottant à l’aide d’une simple chambre thermostatique pour éviter le processus de transfert requis par la méthode conventionnelle. En conséquence, l’efficacité et le nombre de sections de paraffine intacts ont été grandement améliorées.

La découpe et la méthode flottante pour tissus inclus en paraffine pour le sectionnement

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine morphologique, telles que la coupe en paraffine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle culmine la procédure de coupe et de pliage et évite le processus de transfert requis par la méthode conventionnelle. Pour commencer, rassemblez toutes les pièces préfabriquées dans une hotte.Utilisez du chloroforme pour combiner les sept panneaux acryliques, comme illustré ici. Le produit final sera un réservoir équipé d’un canal de section et d’un bain-marie. Installez l’élément chauffant électrique tubulaire à travers le trou du panneau acrylique numéro deux.À l’aide d’une perceuse électrique, faites un petit trou dans le panneau acrylique numéro sept et installez un thermostat numérique sur le réservoir, en vous assurant qu’il se trouve au moins un centimètre en dessous du niveau de la surface d’eau prévue, qui est indiquée par le point noir sur le réservoir. Ajustez la tension de manière à ce qu’elle soit inférieure à 24 volts avant d’allumer l’équipement. Retirez le bac à déchets de section du microtome.Ensuite, utilisez un mastic silicone neutre pour relier le canal des sections au porte-lame du microtom

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