Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans les domaines de la toxicologie des insectes et de la physiologie des insectes en mesurant l’électrogenèse du système nerveux central de Drosophila melanogaster. Cela permet de tester un large éventail d’hypothèses scientifiques et d’aider à la découverte de nouveaux modes d’action insecticides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un système simple, reproductible et relativement élevé avec un apport financier minimal pour étudier le système nerveux de la drosophile.

Pour commencer, ouvrez le logiciel d’acquisition/analyse. Cliquez sur Configuration dans la barre d’outils principale et sélectionnez Paramètres de canal, qui ouvrira une boîte de dialogue. Réduisez le nombre total de canaux à trois.

Le canal 1 enregistrera le signal brut de l’amplificateur avec une portée de 100 millivolts. Le canal deux sera utilisé pour compter le nombre d’événements du canal un qui sont au-dessus d’un seuil donné. Pour cela, cliquez sur l’onglet Calcul pour ouvrir un menu drop-down pour le canal deux.

Sélectionnez Mesures cycliques, qui ouvriront une deuxième boîte de dialogue. Sélectionnez le canal un comme source. Ensuite, sur la mesure du menu drop-down, sélectionnez Spike unitaire lors des événements.

Enfin, dans la zone paramètres de détection, à partir du menu drop-down, sélectionnez Seuil simple. Le niveau de seuil est l’entrée sur la fenêtre d’ajustement de détection à définir au-dessus du bruit de fond. Pour convertir l’activité électrique en une parcelle de taux exprimée en hertz, sélectionnez Arithmétique sur le troisième canal.

Sur la nouvelle fenêtre, entrée 1000 fois smoothsec, parenthèses canal deux virgule deux. Ensuite, sélectionnez au menu de drop-down des unités l’unité de fréquence hertz. Fermez les boîtes de dialogue pour revenir à l’écran principal.

L’axe y du canal trois doit être exprimé dans hertz et l’axe x dans le temps. Disséquer la larvaire Drosophila CNS en identifiant et en extrayant d’abord un troisième stade errant Drosophila melanogaster du flacon de culture et en le plaçant dans 200 microlitres de solution saline. Ensuite, saisissez les crochets de la bouche avec une paire de forceps fins, et prenez l’abdomen de l’asticot avec une deuxième paire de forceps, avec une légère pression, pour éviter de déchirer la mince couche cuticulaire.

Tirez doucement les crochets de la bouche et l’abdomen dans différentes directions pour séparer l’extrémité caudale de l’asticot de la région de la tête et exposer les viscères de l’asticot. Le SNC sera étroitement lié à la trachée et au tube digestif. Taquiner le SNC hors du tube digestif et de la trachée avec des forceps.

La dissection du système nerveux central de Drosophila de l’asticot est une étape critique pour le succès. Les ganglions disséqués doivent être intacts, sans dommages significatifs aux nerfs moteurs descendants. Un plus grand nombre de nerfs moteurs attachés aux ganglions augmenteront les fréquences de tir de base.

Si nécessaire, perturber la barrière céphalo-encéphalique en transectant manuellement le postérieur du SNC aux lobes cérébraux avec des ciseaux à ressort Vannas. La transection doit être effectuée en fonction des propriétés physiochimiques du produit chimique utilisé. La ligne rouge est le point de transection suggéré et le SNC transected avec les troncs périphériques intacts de nerf descendant montrés ici.

Pour commencer, tirez d’abord l’électrode de pipette en verre des capillaires en verre borosilicate à une résistance de cinq à 15 mégaohms. Insérez le SNC transecté dans une chambre de cire contenant 200 microlitres de solution saline. Serrez une épingle à insectes non cintrée avec un clip alligator soudé au fil de terre, et insérez la broche dans la solution saline pour compléter le circuit.

À l’aide des micromanipulateurs, orientez l’électrode vers l’extrémité caudale du SNC transecté. Éliminez le bruit de fond en ajustant le seuil dans le logiciel d’acquisition/analyse avant de connecter les troncs nerveux périphériques. Appliquez une légère pression négative sur la seringue pour attirer les nerfs périphériques dans l’électrode d’aspiration.

Démarrez l’enregistrement sur le logiciel d’acquisition de données et le taux de tir de base pour l’équilibrer pendant cinq minutes avant de recueillir des données de taux de tir de base. Après cinq minutes, ajouter 200 microlitres de solution saline et de véhicule pour porter le volume total de la chambre à 400 microlitres pour commencer à enregistrer les taux de tir de commande. Jetez la préparation et l’enregistrement si le modèle de cuisson du traitement de contrôle n’est pas similaire à l’exemple montré ici.

Lorsque la ligne de base a été établie après trois à cinq minutes d’enregistrement, retirez 200 microlitres de solution saline et ajoutez 200 microlitres de l’agent expérimental solubilisé en solution saline. Étiquetez ce point de temps d’application de médicaments dans le logiciel d’acquisition/analyse en incluant un commentaire qui inclut le médicament et la concentration finale. Il est indiqué ici qu’il y a une trace représentative de décharge nerveuse avant et après l’exposition au DMSO.

La flèche indique l’heure d’application. On voit une réponse limitée au DMSO. L’augmentation des doses de propoxur a amplifié la fréquence de décharge de pointe du CNS transected de Drosophila d’une manière concentration-dépendante, alors que le neurodepresseur GABA a réduit la fréquence de décharge de pointe d’une manière concentration-dépendante.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’une expérience ex vivo, et donc les conditions de la solution saline, comme le pH et la température, est critique pour l’activité prolongée de la préparation du système nerveux central. De même, le manque d’activité électrique extraneous, une cage efficace de Faraday, et une réduction du bruit de 60-hertz sont critiques pour le succès de cet essai. Les données recueillies grâce à cet essai peuvent aider à identifier le mode d’action spécifique des insecticides.

La validation ultérieure de ces données par d’autres méthodes telles que l’électrophysiologie tension-pince, les analyses biochimiques, et les essais pharmacologiques additionnels peut être exécutée.