Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la façon dont le flux de fluide modifie la croissance et le développement fongiques des biofilms. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’évaluer quantitativement les effets du flux sur la croissance et le développement des biofilms en temps réel. Commencez cette expérience avec l’assemblage de l’appareil d’écoulement, tel que décrit dans le protocole de texte.

Le jour de l’expérience, fixez le piège à bulles, la sonde de température et tous les composants à usage unique. Pour assembler le filtre, retirez le piston d’une seringue d’un millilitre pour en faire un adaptateur. Forcer le tube de la bouteille de filtre à cette extrémité et attacher un filtre de 2 microns à la tuyauterie menant à la fiole de croissance.

Appliquez de la graisse sous vide en silicone autour de la barbe de l’adaptateur de glissière avant de la connecter, car cela aide à prévenir les fuites d’air dans le système. Remplissez le flacon de fixation avec 100 millilitres de YPD, et remplissez le flacon de croissance avec 200 millilitres de YPD. Assurez-vous que le tube latéral vert atteint le média dans chaque flacon.

Assurez-vous que toutes les vannes sont ouvertes. Fixez le piège à bulles à un vide et connectez la pompe au tube latéral vert en aval du piège à bulles. Pompez le fluide à un débit de 3,3 millilitres par minute pour remplir complètement le côté vert.

Ensuite, distribuez et jetez environ un à deux millilitres des médias, parce que les deux premiers millilitres contiennent souvent des cellules mortes ou des débris aléatoires. Assurez-vous que le côté vert du tube est rempli de supports et n’a pas de bulles en aval du piège à bulles avant de procéder. Remplissez la glissière du canal et le réservoir avec YPD, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.

Connectez la diapositive à l’appareil d’écoulement. Puis pomper plus de liquide pour créer un tampon d’environ 5 mètres sur le côté orange. Il s’agit d’éviter de piéger accidentellement l’air dans la glissière en cas de retour.

Maintenant, préparez l’appareil d’écoulement pour le transport au microscope en plantant d’abord l’entrée et la sortie du piège à bulles fermé. Serrez ensuite les vannes de fiole latérales vertes et oranges fermées. Assurez-vous que les bouchons de vis pour l’amortisseur de pulsation et la bouteille de filtre sont serrés, car ils peuvent se desserrer pendant le placage automatique.

Déconnectez la pompe du tube pour faciliter le transport. Déplacez ensuite tous les composants, y compris l’agitateur de plaque chaude, dans un récipient secondaire près du microscope. Attachez la sonde de température à l’agitateur de plaque chaude, et commencez à chauffer le flacon de fixation à 37 degrés Celsius.

Remuer les médias à 300 RPM, et de maintenir cela pour l’ensemble de l’expérience. Montez la lame sur le microscope et utilisez du ruban adhésif si nécessaire pour la fixer étroitement. Attachez ensuite le piège à bulles à un vide.

Maintenant, connectez la pompe à l’appareil d’écoulement. Démarrez la pompe à une vitesse d’écoulement de 3,3 millilitres par minute et laissez-la fonctionner pendant environ cinq à dix secondes. Ensuite, retirez le piège à bulles dans le clan de couvercle de let-out.

Laissez la pompe continuer à fonctionner pendant que le flacon de fixation se réchauffe. Une fois que le flacon d’attachement et la chambre d’incubation sont tous deux à 37 degrés Celsius, ajoutez suffisamment de culture nocturne des cellules fongiques au flacon d’attachement pour atteindre un million de cellules par millilitre. Attendez 15 minutes pour permettre aux cellules de s’acclimater.

Ouvrez les valves de flacon de fixation latérale verte et orange tout en fermant les deux valves de flacon de croissance pour commencer l’écoulement des cellules. Attendez environ cinq minutes pour permettre aux cellules d’atteindre la glissière. Pendant ce temps, concentrez le microscope et ajustez-le aux mêmes paramètres d’imagerie utilisés dans les expériences précédentes.

Commencez l’acquisition d’images pour la phase de pièce jointe. Revenez après environ cinq et dix minutes pour vous assurer que la mise au point a été maintenue. Si ce n’est pas le cas, essayez d’ajuster la mise au point immédiatement après l’acquisition de l’image suivante.

Immédiatement après la fin de la phase de saisie, enregistrez le fichier. Ouvrez ensuite les vannes de flacon côté vert et orange tout en fermant les deux vannes de flacon de fixation. Prenez soin de ne pas cogner la scène si des valves se trouvent à l’intérieur de la chambre d’incubation.

Débranchez la sonde thermomètre et remplacez le flacon d’attache par le flacon de croissance. Maintenant, configurez le logiciel pour acquérir une image toutes les 15 minutes sur 22 heures, et commencer l’acquisition d’image pour la phase de croissance. Une fois l’acquisition de la phase de croissance terminée et que le fichier a été enregistré, ouvrez les vannes de fiole latérales vertes et oranges, ce qui peut faire du bruit à mesure que la pression se relâche du côté orange.

Tirez vers le haut sur le tube vert de côté venant des deux flacons de médias, jusqu’à ce qu’ils soient au moins plusieurs centimètres au-dessus des médias. Ensuite, faire fonctionner la pompe à grande vitesse pour enlever tous les supports du tube, ce qui rend le nettoyage beaucoup plus facile. Enfin, quantifier les vidéos décrites dans le protocole texte.

Cette vidéo de microscopie en champ sombre montre l’attachement des cellules candida albicanes de type sauvage au sous-débit du substrat pendant la phase d’attachement, suivie de la croissance et du développement subséquents pendant la phase de croissance menant à la formation de biofilms. Les données de ces vidéos peuvent être analysées pour les taux d’attachement cellulaire et de détachement et de biomasse au fil du temps, montré ici est la biomasse totale dans la région d’imagerie tel que déterminé par l’analyse de densitométrie. Le taux cumulatif d’attachement cellulaire et le pourcentage de détachement de biomasse au fil du temps sont également indiqués.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser les mêmes conditions d’imagerie à travers toutes les expériences, car cela permet de faire des comparaisons quantitatives entre eux.