Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

L’objectif global de cette procédure est de quantifier et de comparer les distributions tridimensionnelles simultanées de trois composants du biofilm cellulaire et extracellulaire après un traitement avec des agents antibactériens. Ceci est accompli en fabriquant d’abord puis en polissant des échantillons composites en résine. Dans un deuxième temps, les biofilms d’intérêt sont cultivés sur les échantillons, puis traités avec des agents antibactériens.

Ensuite, les biofilms sont colorés avec des fluorochromes pour les substances polymères extracellulaires, les acides nucléiques et les protéines, puis imagés par microscopie confocale à balayage laser. Dans la dernière étape, des images tridimensionnelles des fluorochromes superposés sont reconstruites pour faciliter la visualisation simultanée des composants du biofilm et les paramètres structurels sont calculés à partir des images du biofilm. En fin de compte, une analyse statistique des paramètres structurels du biofilm tels que le volume biologique et l’épaisseur moyenne du biofilm peut être effectuée pour comparer les différences entre le groupe de traitement et le groupe témoin.

Le principal avantage de cette procédure par rapport aux méthodes existantes est qu’elle utilise des techniques distinctes mais interconnectées pour caractériser la distribution de plusieurs composants dans la structure de biofilms cultivés dans des conditions spécifiques, démontrant la procédure par le Dr Fernando Flores, chercheur postdoctoral, et Mme Kristen Smart, assistante de recherche de mon laboratoire. Pour créer les échantillons, commencez par placer un incrément de 0,4 ou de trois composites de résine dentaire TPH dans un Fabrication de moules en acier inoxydable. Ensuite, polymérisez le premier incrément avec une unité de photopolymérisation LED pendant 40 secondes. Après avoir répété la procédure pour le deuxième incrément, utilisez une meuleuse et une polisseuse semi-automatisées pour polir les échantillons durcis jusqu’à obtenir une finition de surface finale acceptable.

Enfin, stérilisez les échantillons pour faire pousser le biofilm. Tout d’abord, inoculez une seule colonie de S mutans dans quatre millilitres de milieu de culture pendant la nuit, puis incubez la culture à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures pour obtenir une densité optique d’au moins 0,9. Ensuite, diluez la culture dans un rapport de 1 à 100 dans 10 millilitres de croissance de biofilm.

Le milieu transfère aseptiquement les échantillons composites de résine stérile dans des plaques stériles à 12 puits, puis ajoute 2,5 millilitres de culture diluée dans chacun des puits. Pour le traitement par rince-bouche et les groupes témoins, ajoutez 2,5 millilitres de biofilm de croissance stérile non inoculé, milieu aux puits de contrôle de stérilité, puis faites pousser les biofilms à 37 degrés Celsius dans des conditions micro-paraphiliques sur un agitateur à 100 tr/min. Après 24 heures, aspirez aseptiquement le milieu de tous les puits et lavez chaque puits deux fois avec 2,5 millilitres de PBS stérile en aspirant la solution saline après chaque lavage, puis remplissez chaque puits avec 2,5 millilitres de milieu de croissance de biofilm frais et incubez la plaque pendant 24 heures supplémentaires, comme cela vient d’être démontré pour une croissance totale du biofilm. Durée de 48 heures après la fin de la croissance du biofilm, Aspirez le milieu de culture, puis versez 2,5 millilitres de rince-bouche dans chaque puits de groupe de traitement et 2,5 millilitres d’eau ultrapure stérile dans le groupe témoin.

Bien agiter les plaques sur un agitateur orbital à 150 tr/min, puis après 60 secondes, aspirer à la fois le rince-bouche et l’eau ultrapure des puits pour colorer le composant exo polysaccharide des biofilms. Incuber chaque biofilm avec 50 microlitres de conjugué LOR pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les échantillons deux fois avec 2,5 millilitres de tampon TC en aspirant après chaque lavage et colorez les acides nucléiques dans chaque biofilm avec une goutte de 50 microlitres de cyto nine pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.

Après avoir lavé les échantillons deux fois, colorez les composants protéiques de chaque biofilm avec 50 microlitres de rouge Cipro pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les échantillons trois fois, transférez-les dans des puits individuels d’une plaque de six puits contenant six millilitres d’eau ultrapure stérile par puits pour faciliter leur visualisation par microscopie confocale afin d’acquérir des images de chacune des taches des composants dans les biofilms des groupes de traitement et de contrôle. Réglez les lasers d’un microscope confocal à balayage laser sur les paramètres suivants pour la détection des exopolysaccharides par coloration conjuguée Exor, utilisez un laser de 633 nanomètres et une bande d’émission de 659 à 749 nanomètres pour la détection des acides nucléiques par coloration cyto nine.

Utilisez un laser de 488 nanomètres et une bande d’émission de 495 à 500 nanomètres, et pour la détection des protéines par coloration rouge Cipro, utilisez un laser de 543 nanomètres et une bande d’émission de 615 à 651 nanomètres. Ensuite, à l’aide d’un objectif plongeur 63x avec une ouverture numérique de 0,9 et une distance de travail de 2,2 millimètres. Collectez des images de microscopie confocale à balayage laser à 400 hertz à l’aide d’un balayage séquentiel en mode entre les piles pour optimiser la capture d’images de plusieurs colorants au sein d’un même biofilm.

Après avoir analysé les images de microscopie confocale à balayage laser, utilisez l’option de menu Moteur de rendu 3D du logiciel d’analyse d’images de vitesse pour créer une image 3D reconstruite des colorations des composants superposés dans chaque biofilm. Ensuite, faites pivoter l’image 3D pour obtenir une vue optimale du biofilm. Capturez ensuite un instantané de la reconstruction du biofilm et exportez-le dans un format de fichier image approprié.

Enfin, effectuez une analyse visuelle de la distribution simultanée des composants de l’acide nucléique et des protéines exopolysaccharidiques dans les biofilms. Dans les images reconstruites, calculez les paramètres structurels du biofilm tels que le volume biologique et l’épaisseur moyenne du biofilm à l’aide du logiciel ISA 3D. Dans ce tableau, les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels du biofilm calculées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique sont affichées. Les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels des biofilms traités au bain de bouche qui différaient significativement de celles des biofilms du groupe témoin sont mises en évidence dans les modèles mixtes rouges.

Les analyses statistiques ont démontré que le rince-bouche PBF Biotène produisait des structures de biofilm significativement différentes de celles du groupe témoin sur les deux composites de résine, tandis que le rince-bouche Listerine total care n’a pas produit de différences significatives sur l’un ou l’autre des composites de résine, indiquant clairement des différences dans les composants du biofilm cellulaire et extracellulaire restant après les deux traitements de rince-bouche. La distribution simultanée des exopolysaccharides, des acides nucléiques et des protéines dans les biofilms peut être visualisée via des reconstructions 3D générées à l’aide d’un logiciel de vitesse. Dans cette figure, une reconstruction représentative des biofilms du groupe témoin cultivés sur 0,4 montre que la couleur bleue a été attribuée à l’exo polysaccharide.

Dans les biofilms de S mutans, la couleur verte a été attribuée aux acides nucléiques et la couleur rouge aux protéines. L’espace intermédiaire peut être occupé par de l’eau ou d’autres composants du biofilm qui n’ont pas été marqués par fluorescence. Dans cette figure, une reconstruction représentative des biofilms du groupe témoin cultivés sur trois composites de résine TPH avec les couleurs représentant les mêmes composants que la figure précédente est montrée.

Cette procédure a été appliquée dans diverses disciplines telles que la médecine, les sciences dentaires, la géologie et les sciences marines. Étant donné que de nombreux substrats et biofilms peuvent être substitués à ceux utilisés ici.