Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

La sepsi può portare all'insufficienza multiorgano e alla morte. L'endotossina è un componente fondamentale dei batteri gram-negativi. Elevati livelli circolanti di endotossina potrebbero identificare il paziente a più alto rischio di sviluppare una malattia più grave.

Il saggio di attività dell'endotossina può essere utilizzato come biomarcatore semplice, rapido e affidabile dell'endotossiemia sistemica. La diagnosi precoce di questa tossina potrebbe aiutare i medici a trattare i pazienti con shock settico. Nel paziente con shock settico, l'identificazione precoce di una condizione in rapida evoluzione potrebbe richiedere una terapia di supporto alla vita più rapida e intensiva, potenzialmente portando a risultati migliori.

A dimostrare questa procedura sarà Lisa Mathiasen, biologa molecolare che collabora con il nostro gruppo di ricerca. Per iniziare questa procedura, impostare un kit di prova EA e disimballare i cinque diversi tipi di tubi. Utilizzare il tubo numero uno, il tubo di controllo, per misurare l'attività basale dello scoppio ossidativo non specifico dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.

Utilizzare il tubo numero due, il tubo campione, per misurare l'esplosione ossidativa in risposta al complesso anticorpale LPS. Utilizzare il tubo numero tre, il tubo Max, per misurare l'esplosione ossidativa massima dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina. Utilizzare il tubo numero quattro, il tubo LPS, come fonte di endotossine esogene.

E usa il tubo numero cinque, il tubo Aliquot, per la conservazione del sangue. Raccogliere campioni di sangue del paziente in tubi sterili contenenti anticoagulante EDTA e conservarli a temperatura ambiente prima di eseguire il test EA. Prima di iniziare il test, accendere il chemiluminometro e lo shaker dell'incubatore e riscaldare l'incubatore a 37 gradi Celsius.

In primo luogo, posizionare i tubi EA da utilizzare nei rack dei tubi e rimuovere i tappi. Utilizzare una combipipette per trasferire un millilitro del reagente EA dalla bottiglia in tubi numero uno, numero due e numero tre tubazioni lungo il lato dei tubi. Invertire delicatamente il tubo di raccolta del sangue 20 volte per mescolare il campione di sangue del paziente.

Quindi, pipetta 0,5 millilitri di sangue paziente nel tubo numero quattro e nel tubo numero cinque. Tubo vortice numero quattro per 10 secondi. Posizionare i rack dei tubi con tutte le provette EA nello shaker dell'incubatore.

Chiudere il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, aprire il coperchio dell'incubatore e rimuovere i rack del tubo dallo shaker. Tubo vortice numero cinque.

Utilizzando una punta sterile, pipettare 40 microlitri di sangue in tubi numero uno e numero due, in duplicato. Tubo vortice numero quattro. Utilizzando la stessa punta della pipetta, trasferire 40 microlitri di sangue dal tubo numero quattro nel tubo numero tre, in duplice copia.

Vortice le sei provette finali una per una. Riposizionare le rastrelliere del tubo nello shaker di incubazione e chiudere il coperchio. Impostare lo shaker su 100 giri/min e avviare il movimento per 14 minuti.

Inserire la chipcard con etichetta EA nel chemiluminometro e premere Start. Dopo l'incubazione di 14 minuti, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro. Vortice delicato per ogni tubo per 10 secondi prima di posizionarlo sul supporto del campione del chemiluminometro.

Aprire il cassetto del campione e posizionare il tubo numero uno nel portacampioni. Quindi, chiudere il cassetto del campione e attendere la lettura relativa dell'unità luminosa. Ripetere questo processo di lettura per i tubi due e tre e tutti i duplicati, come indicato nel protocollo di testo.

Dopo che tutti i tubi sono stati lavorati, i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. Ripetere l'intero processo di dosaggio per ogni campione di sangue che deve essere testato. Conservare il kit EA Assay e i suoi componenti nella confezione sigillata originale a una temperatura compresa tra i due e i 25 gradi Celsius.

In questo studio, viene eseguito un test di attività dell'endotossina per rilevare l'endotossiemia del sangue intero in pazienti gravemente malati. Un valore EA inferiore a 0,40 unità EA indica un basso livello di attività dell'endotossina, pari a una bassa concentrazione di LPS circolante, che rappresenta un basso rischio di progressione verso uno stato di malattia grave. Un risultato compreso tra 0,40 e 0,59 unità EA indica un livello intermedio di attività dell'endotossina, che rappresenta un rischio intermedio per lo sviluppo di sepsi grave e shock settico.

Risultati pari o superiori a 0,60 unità EA indicano un alto livello di attività dell'endotossina, che rappresenta un alto rischio di shock settico e scarsi risultati del paziente. Il sangue dei tubi numero quattro e cinque deve essere miscelato con la provetta corretta. Occorre prestare particolare attenzione a seguire l'ordine corretto indicato nel protocollo.

Ogni tubo viene eseguito in duplicati, portando potenzialmente a errori in questa fase. Dopo la sua introduzione, il saggio EA è stato proposto come biomarcatore per la stratificazione del rischio del paziente con ipoperfusione sistemica. Inoltre, è stato studiato come test di screening per selezionare i pazienti per strategie avanzate di trattamento dell'emopurificazione.