Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

IDBac couples données spec de masse de protéines et de régions métabolites spécialisées d’isolats bactériens inconnus pour discriminer rapidement entre les isolats en fonction de leur identité et leur fonction environnementale potentielle. Notre logiciel de source de bureau étend l’utilité des stratégies existantes d’identification microbienne basées sur MALDI TOF. Cette extension comprend l’analyse du métabolisme spécialisé comme un moyen supplémentaire de différencier les colonies avec des phénotypes similaires.

Un défi majeur dans la caractérisation des micro-organismes inconnus consiste à distinguer les isolats étroitement apparentés. IDBac offre aux chercheurs un moyen facile et rapide de caractériser les isolats par le profilage des protéines et des petites molécules. IDBac fournit une comparaison visuelle de la production spécialisée de métabolites au sein d’un échantillon bactérien et peut fournir un aperçu d’un large éventail de sujets de recherche, des études écologiques à la découverte de plomb médicamenteuse.

Il existe de nombreuses façons d’économiser les données MALDI entre et entre les instruments. Si vous avez de la difficulté à obtenir des fichiers pour travailler avec IDBac, soumettez un problème à GitHub d’IDBac. À l’aide d’un cure-dent stérile, transférer une petite partie d’une colonie bactérienne à l’endroit approprié sur une plaque MALDI propre.

Répartir uniformément la colonie bactérienne sur place afin que l’endroit semble aussi plat que possible. Superposer un microlitre de 70 % d’acide formic de qualité spectrométrie de masse sur l’échantillon et les taches de contrôle matricielle et permettre à l’acide de sécher à l’air dans un capot chimique. Ensuite, ajoutez un microlitre de solution matricielle MALDI précédemment préparée aux taches de contrôle des médias de l’échantillon et de la matrice et laissez sécher complètement l’air.

Après avoir mis en place le spectromètre de masse MALDI TOF, acquérir les spectres. Enregistrez les spectres protéiques dans un dossier et les spectres métabolites spécialisés dans un deuxième dossier distinct. Pour commencer cette procédure, téléchargez le logiciel IDBac.

Double-cliquez sur le install_idbac pour lancer l’installateur. Ensuite, cliquez deux fois sur le raccourci de bureau IDBac pour lancer IDBac qui s’ouvrira sur l’onglet d’introduction par défaut. Cliquez sur l’onglet Démarrer avec des données brutes et choisissez parmi le menu d’expérience IDBac le type de données à utiliser avec IDBac.

Lors de la configuration de la conversion et du traitement des fichiers de données, entrez un nom descriptif pour l’expérience lorsque cela est motivé et cliquez sur le dossier de données brutes et sélectionnez le dossier approprié. Cliquez ensuite sur Les données de processus. Après avoir converti les fichiers et les avoir traités avec IDBac, accédez au travail avec la page d’expériences précédentes et sélectionnez une expérience avec qui travailler.

Ajoutez des informations sur les échantillons à l’aide du menu cliquez ici pour modifier l’expérience sélectionnée. Entrez des informations dans la feuille de calcul autopopulée et appuyez sur Enregistrer. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’analyse, assurez-vous que l’expérience avec qui travailler est sélectionnée.

Sélectionnez ensuite l’analyse des données protéiques. Dans la page d’analyse des données protéiques, choisissez les paramètres de pointe et évaluez les spectres protéiques des échantillons via les parcelles miroir affichées. Ajuster le pourcentage de répliques dans lesquelles un pic doit être présent pour qu’il soit inclus pour analyse.

En utilisant les parcelles miroir comme guidage visuel, réglez le signal à la coupure de bruit qui conserve les pics les plus authentiques et le moins de bruit notant que plus de répliques dans un pourcentage plus élevé de la valeur de présence maximale permettra la sélection d’un signal inférieur à la coupure de bruit. Par la suite, spécifiez la masse inférieure et supérieure pour charger les seuils dictant la gamme de valeurs de masse dans chaque spectre à utiliser dans une analyse plus approfondie par IDBac. Dans la page d’analyse des données protéiques, sélectionnez l’onglet Dendrogram pour permettre de regrouper les échantillons dans un dendrogram en fonction des mesures de distance sélectionnées par l’utilisateur et des algorithmes de clustering.

Cliquez sur sélectionner des échantillons sur le menu et suivez les instructions pour sélectionner les échantillons à inclure dans l’analyse. Seuls les échantillons contenant des spectres protéiques seront affichés dans la boîte d’échantillons disponible. Utilisez les valeurs par défaut pour les algorithmes de distance et de clustering et sélectionnez les intensités comme entrée.

Pour afficher les valeurs bootstrap sur le dendrogram, entrez un nombre entre deux et 1000 sous bootstraps. Pour commencer à personnaliser le dendrogram, ouvrez le menu de déndrogram. Pour colorier les lignes du dendrogram, sélectionnez cliquez pour modifier les lignes et sélectionner les options souhaitées.

Pour tracer les informations de la feuille de calcul à côté du dendrogram, sélectionnez le bouton incorporer des informations sur les échantillons. Cela ouvrira un panel où une catégorie s’auto-peuplera en fonction des valeurs saisies. Pour insérer des échantillons d’une autre expérience, sélectionnez le bouton menu insérer des échantillons d’une autre expérience et suivez les instructions dans le panneau nouvellement ouvert.

Passez à la page d’analyse des données des petites molécules pour permettre la visualisation des données par l’analyse des composants principaux et les réseaux d’associations métaboliques qui utilisent des réseaux bipartites pour afficher la corrélation de la masse des petites molécules pour charger les valeurs avec des échantillons. Cliquez et faites glisser sur le dendrogram pour mettre en évidence certains échantillons d’intérêt à analyser. Si aucun échantillon n’est mis en évidence ou si aucun dendrogram protéique n’a été créé, un réseau d’association de métabolites d’un sous-ensemble aléatoire ou de tous les échantillons apparaîtra respectivement.

Pour soustraire un média matriciel vide dans le réseau d’associations de métabolites, ouvrez le menu sélectionnez un échantillon pour soustraire et choisissez l’échantillon approprié à utiliser comme blanc. Ouvrez le menu afficher/masquer les paramètres MAN pour sélectionner les valeurs désirées pour un pourcentage de présence maximale et répliquer, signaler au bruit et les coupures de masse supérieures et inférieures. Utilisez les petites parcelles miroir molécule pour guider la sélection de ces paramètres.

Pour la communication des résultats, copiez le texte dans les suggestions de rapport man analyse paragraphe pour fournir les paramètres définis par l’utilisateur utilisés pour générer créé réseau d’association métabolique. Six souches de Micromonospora chokoriensis et deux taches de Bacillus subtilis ont été analysées à l’aide de données dans le logiciel IDBac. Suivant les instructions dans le démarrage avec l’onglet données brutes, l’option cliquez ici pour convertir les fichiers Bruker a été sélectionnée et l’IDBac a fourni des instructions ont été suivies pour chaque ensemble de données.

Aux étapes de pointe de conversion et de pré-traitement automatisées, une expérience IDBac combinée a été créée en transférant des échantillons bacillus et micromonospora des deux expériences en une seule expérience. L’analyse qui en a résulté consistait à comparer les spectres protéiques à l’aide de parcelles miroirs qui étaient utiles pour évaluer la qualité des spectres et ajuster les paramètres de pointe. Une capture d’écran des résultats de clustering protéique avec les paramètres par défaut sélectionnés est affichée ici.

Le dendrogram a été coloré en ajustant le seuil sur la parcelle. Il convient de noter la séparation claire entre les genres avec les isolats M.chokoriensis et B.subtilis regroupés séparément. En cliquant et en faisant glisser à travers le dendrogram protéique, il a été possible de créer rapidement des réseaux d’associations métaboliques pour comparer uniquement les souches B.subtilis, seules les souches M.chokoriensis, et toutes les souches simultanément.

La fonction principale de ces réseaux est de fournir aux chercheurs un large aperçu du degré de chevauchement spécialisé des métabolites entre les bactéries. Lorsque vous travaillez avec de nouvelles données, utilisez les parcelles miroir d’IDBac pour vous assurer que vos données sont logiques et que les spectres sont de haute qualité. Évaluez de façon critique votre conception expérimentale et vos résultats à chaque étape.

IDBac permet aux chercheurs de construire des bibliothèques petites et diversifiées de micro-organismes pour une étude plus approfondie. Cela réduit considérablement les coûts associés aux bibliothèques microbiennes traditionnellement grandes et redondantes. Étant donné qu’IDBac vous permet de visualiser le chevauchement des métabolites spécialisés au sein de groupes phylogénétiques très similaires, il peut être utilisé pour générer des questions de recherche et des hypothèses qui relient deux champs généralement déconnectés.

L’acide formique est caustique et doit être manipulé dans une hotte chimique de fumée. Certains isolats environnementaux peuvent présenter des risques potentiels pour la santé et toutes les souches devraient être traitées comme de niveau de biosécurité deux.