Évaluation de l’innocuité microbienne des laiteries à l’aide du profilage protéomique bactérien via l’approche MALDI

Nous avons développé un protocole pour préparer et isoler les communautés microbiennes à partir de divers produits quotidiens, tels que le lait, la crème, le beurre et le fromage. Une fois isolé, ce micro-organisme peut être rapidement et précisément identifié à l’aide de la MALDI-TOF MS. L’optimisation des conditions de culture reste un défi majeur, tout comme les lacunes dans les bases de données et l’extraction exigeante des bactéries à gram positif et formatrices de spores. Pour commencer, obtenez un échantillon représentatif du produit laitier et mélangez soigneusement pour garantir l’uniformité.

De façon aseptique, transférez un millilitre ou un gramme d’échantillons solides dans un tube centrifugeuse conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de milieu liquide stérile. Faites un vortex vigoureux sur le tube pendant 30 à 60 secondes pour homogénéiser l’échantillon. Ensuite, préparez une série de dilutions dix fois plus nombreuses en transférant un millilitre de la suspension homogénéisée dans des tubes successifs, chacun contenant neuf millilitres de solution stérile.

Mélangez chaque dilution soigneusement en vortexant ou en secouant. Ensuite, prenez 0,1 millilitre de l’échantillon original, ou l’une des dilutions préparées, et transférez-les sur la surface d’une boîte de Petri préparée contenant le milieu d’agar approprié. À l’aide d’un étaleur stérile, répartissez uniformément l’inoculum sur la surface de la plaque d’agar.

Pour l’incubation aérobie, inoculez les plaques agar APT, M17, CBL, MPCA et TSA avec les échantillons préparés. Incubez les plaques en conditions aérobies à 37 degrés Celsius et 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour l’incubation anaérobie, placez les plaques agar de MRS inoculées dans une chambre anaérobie et éclovez à 37 degrés Celsius et 30 degrés Celsius pendant 24 à 72 heures.

Retirez les plaques de l’incubateur et examinez-les quotidiennement pour surveiller la croissance microbienne. À l’aide d’une boucle microbienne d’un microlitre, tracez les colonies sélectionnées sur le même milieu d’agar pour les sous-culturer. Incuber dans les mêmes conditions qu’auparavant.

Pour l’analyse par spectrométrie de masse, commencez par préparer la solution matricielle MALDI. Préparez le mélange de solvants avec 50 % d’acétoninitrile, 47,5 % d’eau de qualité HPLC et 2,5 % d’acide trichloroacétique. Dissoudre le composé matriciel dans le mélange de solvant jusqu’à une concentration finale d’environ 10 milligrammes par millilitre.

Pour l’identification des bactéries en SEP par la méthode de transfert direct de colonie, utilisez une boucle stérile pour transférer un microlitre d’une colonie bactérienne adulte sur un point de la plaque cible MALDI. Étalez la matière bactérienne pour créer une couche fine et uniforme sur la plaque. Une fois séché, ajoutez un microlitre de solution de matrice HCCA par-dessus et laissez sécher à l’air à température ambiante.

Pour la méthode d’extraction de l’acide formique ciblée, utilisez une boucle microbienne jetable ou un cure-dent stérile pour prélever une petite quantité de biomasse bactérienne d’une seule colonie. Étalez le matériau directement sur un point de la plaque cible MALDI pour créer une couche fine et uniforme. Ajoutez un microlitre de solution d’acide formique à 70 % sur la zone étalée.

Une fois la tache sèche, superposez-la d’un microlitre de solution matrice HCCA et laissez-la sécher à l’air à température ambiante. Pour la méthode d’extraction des protéines en tube, transférez une à trois colonies complètes d’une plaque de culture d’agar dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 300 microlitres d’eau stérile. Ajoutez 900 microlitres d’éthanol absolu pour obtenir une concentration finale d’environ 75 %. Après avoir brièvement mélangé le contenu, centrifugez le tube pendant deux minutes à 15 000 g à température ambiante.

Ensuite, jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. Ensuite, ajoutez 20 à 50 microlitres d’acide formique à 70 % à la granule de cellules séchées. Mélangez le contenu en pipettant ou en vortexant jusqu’à ce que la pellete soit complètement resuspendue.

Ajoutez maintenant un volume égal d’acétonitrule à la suspension d’acide formique et mélangez soigneusement. Centrifugez le tube à 15 000 g pendant deux minutes. Transférez un microlitre du surnageant résultant à un endroit désigné sur une plaque cible MALDI et laissez-le sécher.

Ensuite, superposez la zone séchée d’un microlitre de solution matrice HCCA. Pipeter un microlitre soit de l’étalon bactérien contenant un extrait d’Escherichia coli DH5 alpha, soit du calibrateur microbiologique contenant l’extrait protéique d’E.coli ATCC 25922, la ribonucléase et la myoglobine. Pour l’acquisition de spectres et l’identification microbienne, préparez des points d’étalonnage sur la plaque cible MALDI.

Chargez la plaque cible MALDI avec les points d’échantillonnage préparés et les points de calibration dans l’instrument de spectrométrie de masse. Effectuez l’analyse d’étalonnage en mode étalonnage pour calibrer le système. Faire fonctionner le spectromètre de masse en mode ion positif linéaire pour l’acquisition générale du spectre.

Ensuite, réglez la plage de détection de masse du spectromètre de masse pour couvrir un rapport masse/charge de 2 000 à 20 000. Acquérir des spectres en double pour chaque point afin de générer au moins quatre réplications techniques par échantillon. Maintenant, appliquez la méthode de Savitzky-Golay comme un algorithme de lissage.

Utilisez l’algorithme TopHat pour la correction de la ligne de base afin d’éliminer le bruit de fond. Ensuite, détectez les pics en mode centroïde. Téléchargez les spectres de masse traités des isolats bactériens inconnus sur la plateforme d’identification microbienne du logiciel MALDI et exécutez l’identification.

Évaluer les scores d’identification selon les normes seuil du fabricant. Les spectres de spectrométrie de masse présentaient des profils protéiques spécifiques à chaque espèce, permettant l’identification au niveau du genre ou de l’espèce. Le dendrogramme a révélé une forte similarité observée entre souches de la même espèce et une différenciation claire entre les espèces.

Un temps d’incubation plus court de 12 heures pour Bacillus licheniformis a produit une valeur de score DI plus élevée de 2,38, tandis qu’une incubation plus longue de 18 à 24 heures a conduit à une valeur de score DI plus basse de 1,85 en raison de la domination des signaux sporiques. Parmi les méthodes de préparation de l’échantillon, l’extraction protéique en tube a donné la valeur de score DI la plus élevée de 2,23, suivie de l’extraction d’acide formique sur cible à 1,97, et le transfert direct de colonie, qui a donné le score le plus bas de 1,61. En combinant la culturomique avec une préparation d’échantillon sur mesure, MALDI permet une analyse du microbiome plus précise et plus rapide à moindre coût, produisant des résultats comparables aux méthodes de référence 16S rRNA.

Ce protocole permet une surveillance régulière et à haut débit des micro-organismes dans les produits laitiers, améliorant la rapidité et la précision de la détection, renforçant ainsi les systèmes de qualité et de sécurité alimentaires. L’expansion des bases de données MALDI et l’automatisation des flux de travail dans les laboratoires industriels amélioreront l’identification microbienne, augmenteront le débit, réduisent les erreurs et accélèrent la surveillance du microbiote.