Construction de plasmides CRISPR et détection de l’efficacité des knockouts dans les cellules mammifères grâce à un système de double luciferase reporter

Ce protocole décrit les étapes clés de la génération et de l’optimisation des vecteurs sgRNA efficaces. Notre préacceleration du candidat sgRNA cible le temps relatif et l’inférence. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet d’analyser les impressions de codage de l’ADN pour chacun des SGARN sans modifier les gènes endogènes.

Cette méthode de présélection peut également être appliquée à d’autres mesures d’édition génétique par des ruptures à double brin. Commencez par diluer les oligonucléotides lyophilisés à une concentration finale de 10 micromolaires dans de l’eau distillée double. Mélangez les oligonucléotides avant et inversés dans un tube PCR à paroi mince à un rapport un pour un sans ajouter de tampon supplémentaire.

Incuber le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis descendre la température à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le mélange d’oligonucléotide de la machine PCR et laissez-le refroidir à température ambiante. Pour digérer le vecteur pX330-xCas9, avec Bbs1, combinez le vecteur, l’enzyme et le tampon de digestion dans un volume de 50 microlitres et incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Après avoir effectué la transformation cellulaire, choisissez cinq à dix colonies bactériennes de la plaque LB et utilisez chacune d’entre elles pour inoculer un millilitre de média LB avec 60 milligrammes d’ampicilline dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, incuber les tubes sur un shaker rotatif pendant deux à trois heures. Effectuez pcr à l’écran pour les plasmides recombinants comme décrit dans le manuscrit de texte, puis exécutez les produits sur un gel de 2%Agarose sous 10 volts par centimètre.

Après avoir identifié les plasmides positifs, utilisez-les, avec un vecteur reporter, pour co-transfecter une lignée cellulaire appropriée. Pour lyse les cellules, enlever le milieu de croissance des cellules de culture. Lavez doucement la surface du récipient de culture avec PBS et distribuez 100 microlitres de PLB dans chaque puits de culture pour couvrir complètement la couche mono cellulaire.

Laissez la plaque couver à température ambiante pendant 20 minutes, puis transférez le lysate dans un tube ou un flacon pour une manipulation ou un stockage plus long. Pour effectuer le double test de luciferase, programmez les luminomètres pour fournir un délai de deux secondes avant la lecture suivi d’une période de mesure de 10 secondes. Ensuite, distribuez 100 microlitres de réaccérateurs d’analyse de luciferase dans le nombre approprié de tubes de luminomètre.

Ajouter délicatement 20 microlitres de lysate cellulaire dans le tube de luminomètre et mélanger en pipetting deux ou trois fois. Placez le tube dans le luminomètre et initiez la lecture. Retirer le tube d’échantillon du luminomètre.

Ajouter 100 microlitres de réaccentage et vortex brièvement pour mélanger. Retourner l’échantillon au luminomètre et commencer la lecture. Enregistrez l’activité de Renilla Luciferase, normalisée à l’activité Firefly Luciferase, en particulier la réciprocité du rapport affiché à l’écran.

Jetez le tube de réaction une fois terminé. Cette méthode a été utilisée pour générer trois vecteurs sgRNA pour les moutons DKK2 Exon 1. sgRNA et xCas9 exprimant des vecteurs ont été construits en pré-digérant l’épine dorsale vectorielle suivie de ligating dans une série de courts fragments d’ADN à double brin à travers des paires oligo annealing.

Sept colonies bactériennes ont été examinées avec le PCR guidé de paire d’amorce spécifique et les colonies positives ont été détectées. Les capacités de ciblage génétique de pX330-xCas9 T1, T2 et T3 ont été simultanément détectées avec l’analyse de la luciferase double. Le dernier vecteur sgRNA affichait le signal de détection le plus élevé et a ensuite été utilisé pour la recherche sur l’édition de gènes ovins.

Suivant ce protocole, un test T7EI ou un test Ribonuclease peut être effectué. Ces mesures supplémentaires donnent des impressions plus précises de l’édition des gènes endogènes.