Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les régulateurs transcriptionnels de n’importe quel gène d’intérêt à l’aide d’un protocole de transfection simple à haut débit et d’un test maison de luciférase à double lueur. Ceci est accompli en concevant et en clonant d’abord un ensemble unique de plasmides rapporteurs de luciférase doubles. Ces plasmides sont transfectés en 2 9 3 lymphocytes T dans une microplaque avec des plasmides d’une bibliothèque d’expression d’ADN, de sorte que chaque puits est transfecté avec un seul plasmide de bibliothèque.

Après 48 heures, l’activité de la luciférase Firefly est dosée, suivie d’un dosage de l’activité de la luciférase à la vanille. La dernière étape consiste à calculer les rapports d’activité de la luciférase par rapport à la luciférase vanille. En fin de compte, l’induction relative du gène d’intérêt en réponse à chaque bibliothèque.

Le gène est déduit par le rapport entre l’activité de la luciférase de luciole et de la vanille dans chaque puits après normalisation basée sur la plaque. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles de dosage rapporteurs existants est sa capacité à générer rapidement des données fonctionnelles pour un grand nombre de gènes avec un minimum de main-d’œuvre et de coûts. Un jour avant la transfection désignée comme le premier jour de l’écran, 2 9 3 cellules T sont assises en 96.

Les cellules des plaques de puits sont dimensionnées, comptées et remises en suspension à une concentration de 1,5 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Dans le DMEM contenant 14 % de FBS, versez les cellules dans un réservoir stérile. Placez le réservoir à six plaques à fond transparent, à 96 puits et une boîte d’embouts de pipette filtrante sur le pont du robot de traitement automatisé des liquides.

Deux plaques de cellules doivent être placées pour chaque plaque de bibliothèque à cribler. Distribuez 100 microlitres de cellules dans chaque puits de chaque plaque pour une densité de 1,5 fois 10 à la quatrième cellule par puits. Trois plaques de bibliothèque seront projetées dans cette démonstration.

Par conséquent, six plaques de cellules sont préparées, centrifugent les plaques cellulaires à 50 fois G pendant deux minutes en utilisant de faibles vitesses de rampe pour assurer une densité cellulaire égale dans chaque puits. Cette image illustre à quoi devraient ressembler les cellules plaquées après la centrifugation. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Pour préparer les plasmides rapporteurs de luciole et de vanille, diluez chacun à cinq nanogrammes par microlitre dans de l’eau exempte d’endotoxines dans un tube conique de 15 millilitres. Combinez les dilutions dans un rapport de cinq à trois lucioles par rapport au plasmide de vanille en volume. Pipetez les plasmides combinés dans chaque puits d’une plaque de 96 puits distribuant 17 microlitres par plaque de bibliothèque, plus deux à 10 microlitres en excès dans chaque puits. Les cellules sont transfectées le deuxième jour de l’écran.

Pour commencer cette procédure, pour chaque plaque de bibliothèque, mélangez 107,5 microlitres de défaut à température ambiante avec 4,3 millilitres de milieu sans sérum, une dilution de un à 40 dans un tube de polystyrène, incubez pendant cinq minutes à température ambiante, distribuez 44 microlitres par plaque de bibliothèque dans chaque puits d’une plaque de polystyrène à fond en V de 96 puits. Placez la plaque d’ADN de la bibliothèque, la plaque d’effet d’option diluée, la plaque plasmidique rapporteure et une boîte d’embouts de pipette sur le pont du robot pour aspirer. 17 microlitres de plasmides rapporteurs, 43 microlitres d’effet opt dilué et 26 microlitres d’ADN de bibliothèque, en insérant un espace d’air de cinq microlitres entre chaque aspiration.

L’ADN de la banque doit être aspiré en dernier pour éviter la contamination croisée. Versez le contenu des pointes dans un nouveau couvercle de mélange de plaque de polystyrène à fond en V et laissez reposer pendant 20 minutes pour permettre la formation de complexes d’ADN lipidique. Si vous traversez plusieurs plaques de bibliothèque, remplacez les pointes de pipette et la plaque de bibliothèque et répétez l’opération après 20 minutes, découvrez la plaque de mélange d’ADN à effet opt et placez-la sur le pont du robot avec deux plaques de 2 9 3 cellules T à l’aide d’une seule boîte de pointes de pipette.

Aspirez 80 microlitres du mélange d’ADN opt effect et distribuez lentement 40 microlitres par puits pour chaque plaque de cellules. Couvrez les cellules après que le mélange d’ADN à effet opt a été ajouté aux cellules dans toutes les plaques. Centrifugez les plaques à 1 200 fois G pendant 30 minutes.

Remettez les plaques dans l’incubateur et incubez les cellules pendant quatre à six heures. Au cours de cette incubation, préparez un milieu frais en mélangeant 12 millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS et 10 microgrammes par millilitre de ciprofloxine. Pour chaque plaque de bibliothèque transfectée, versez du milieu frais dans un réservoir stérile.

Ensuite, placez deux boîtes d’embouts de robot, une seule plaque de cellules, le réservoir contenant des fluides frais et un réservoir de déchets sur le pont du robot. Ensuite, aspirez 100 microlitres de fluide des cellules et distribuez-les dans le réservoir à déchets, partiellement rempli d’éthanol à 70 %. À l’aide d’embouts frais, aspirez 100 microlitres de milieu frais et distribuez lentement sur les cellules.

Remettez les plaques dans l’incubateur pendant 48 heures. Les dosages de luciférase Firefly et Vanilla sont effectués. 48 heures après le transfect le quatrième jour de l’écran pour chaque plaque de bibliothèque, préparez huit millilitres de trois tampons de test de luciole et 12 millilitres de trois tampons de test de vanille à partir de leurs solutions mères respectives Distribuez 82 microlitres de tampon de test de luciole dans chaque puits d’une plaque à fond en V de 96 puits pour chaque plaque de banque à analyser.

De même, distribuez 122 microlitres de tampon de dosage à la vanille dans chaque puits d’une autre plaque à fond en V de 96 puits. Pour chaque plaque à analyser, mettez de côté les deux tampons de dosage. Placez une boîte d’embouts de pipette, un réservoir de déchets et deux plaques de cellules transfectées à partir de la même plaque de bibliothèque sur le pont du robot, aspirez 60 microlitres de fluide de chaque plaque et jetez-les dans le réservoir de déchets partiellement rempli de plaques de recouvrement à 70 % d’éthanol et mettez-les de côté.

Ensuite, placez deux boîtes de pointes de pipette. La plaque de trois tampons de test de luciole et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot. Aspirez 40 microlitres de trois tampons de dosage de lucioles et ajoutez-les à la première plaque de cellules, en mélangeant soigneusement.

Passage à de nouvelles pointes de pipette. Répétez l’opération pour la deuxième plaque cellulaire. Placez les cellules à température ambiante pendant 10 minutes pour terminer la lyse.

Enregistrez la luminescence de chaque puits de chaque plaque cellulaire sur le luminomètre pendant une seconde par puits. Remettez les plaques sur le pont du robot. Placez deux boîtes de pointes de pipette, la plaque de trois tampons de dosage et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot.

Aspirez 60 microlitres de trois tampons de dosage à la vanille et ajoutez-les à la première plaque de cellules. Bien mélanger. Passage à une nouvelle boîte de pointes de pipette.

Répétez l’opération pour la deuxième plaque cellulaire. Enregistrez la luminescence de toutes les plaques sur un luminomètre. Enregistrement de chaque puits pendant une seconde.

Les valeurs typiques de la luciférase pour une seule demi-plaque sont indiquées dans ces tableaux. Le rapport de luminescence des lucioles à renouvellement ou rapport F deux R pour chaque puits est calculé en divisant le nombre de signaux de luciole par le nombre de signaux de renouvellement exécutés et les résultats sont présentés dans le panneau C.Le panneau D montre la valeur d’induction pour chaque puits calculée en divisant le rapport F deux R du puits par le rapport moyen F deux R de la plaque, à l’exclusion des 25 % des puits les plus hauts et les plus bas. Les valeurs d’induction doivent être moyennées sur l’ensemble des répétitions pour une seule plaque de bibliothèque transfectée.

Et les gènes induisant ou réprimant plus de trois fois l’alpha-synucléine sont considérés comme des succès. Notez l’inducteur 32 fois dans le puits H deux dans ce résultat représentatif : le présent exemple est une représentation graphique des valeurs d’induction pour la plaque unique avec le puits H deux surligné en bleu. Hi.H two est un facteur de transcription neuronale qui n’était pas auparavant associé à l’expression de l’alpha-synucléine.

Il est important de vérifier que le criblage est effectué dans la plage linéaire des tests rapporteurs afin que les clones qui provoquent une expression accrue soient mesurés lorsque l’activité accrue de la luciférase vers cette extrémité a été transfectée avec des quantités croissantes de plasmides de luciférase de luciole et de vanille sous le contrôle du promoteur et du test H-C-M-V-I-E one. Avec ce protocole, il a été observé que l’activité des lucioles reste linéaire à travers une large gamme de valeurs. Alors que la courbe de l’activité de la vanille s’aplatit au-dessus de 15 nanogrammes par puits.

Il est également important d’effectuer les tests rapidement après l’étape d’incubation pour éviter la non-linéarité due à l’épuisement du substrat. Un signal de décomposition temporelle pour le test de luciférase de luciole a révélé une activité significative de la luciférase jusqu’à une heure après l’ajout de réactifs utilisant ce protocole, 7 670 gènes humains ont été criblés et 68 nouveaux régulateurs de l’alpha-synucléine ont finalement été identifiés dans les résultats représentatifs présentés ici. Chaque ligne horizontale représente le rapport d’induction d’un seul gène touché par rapport à un inducteur neutre GFP contrôlé.

Les lignes bleues représentent les inducteurs positifs tandis que la seule ligne rouge représente un suppresseur Les valeurs sont calculées comme le rapport entre le promoteur de l’alpha synucléine à l’origine de l’activité de la luciférase de la luciférase et le promoteur CMV entraînant l’activité de la luciférase exécutée de chaque coup normalisé à la même construction de luciférase à l’aide d’un inducteur de GFP suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que la PCR quantitative en conjonction avec d’autres tests de surexpression et de knockdown peuvent être effectuées afin de s’assurer que les résultats identifiés régulent la cible endogène.