Luminescence Lifetime Imaging of O₂ avec un système de caméra basé sur le domaine de fréquence

Nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle caméra à vie de luminescence de domaine de fréquence pour cartographier les distributions 2D O₂ avec des feuilles de capteur optique. Le système de caméra et les procédures d'analyse d'image sont décrits avec la préparation, l'étalonnage et l'application des foils de capteur pour visualiser le microenvironnement O₂ dans la rhizosphère des plantes aquatiques.

En tant que meilleur accepteur d’électrons, l’oxygène joue un rôle crucial dans les systèmes biologiques. Avec ce protocole, vous pouvez imager la distribution d’oxygène en 2D à l’aide d’un optode. En plus de sa haute résolution spatiale et temporelle, cette méthode ne nécessite pas un colorant de référence supplémentaire, est extrêmement robuste, et permet l’acquisition de l’image structurelle.

Cette méthode peut être appliquée à divers domaines de recherche dans lesquels l’oxygène joue un rôle clé, y compris l’écologie, la recherche médicale, la bioimpression et l’impression sensible à la pression. La fabrication optode peut être difficile que la quantité de cocktail ajouté à la feuille de soutien et la vitesse de traînée dispositif de revêtement couteau peut nécessiter l’optimisation et la pratique. Avec cette contribution vidéo, nous voulons rendre cette technique puissante accessible aux chercheurs d’autres domaines d’étude.

Pour préparer une optode d’oxygène planaire, utilisez d’abord un film d’eau ou 70 % d’éthanol pour fixer une feuille pet propre et exempte de poussière sur une plaque de verre propre. Placez un dispositif propre de revêtement de couteau de 120 micromètres sur le papier d’aluminium et utilisez une pipette en verre pour appliquer une ligne de cocktail de capteur devant l’appareil. Ensuite, faites glisser le dispositif de revêtement couteau lentement et uniformément sur la feuille PET pour étendre le cocktail uniformément.

Ensuite, séchez l’optode sensible à l’oxygène planaire fini dans l’air ambiant pendant une heure avant de sécher toute la nuit dans une armoire chauffée à 50 à 60 degrés Celsius. Le lendemain matin, une couche d’environ 12 micromètres d’épaisseur aura été obtenue. Conservez l’optode à l’abri de la lumière jusqu’à nouvel usage.

Pour préparer une chambre rhizo-sandwich, utilisez un adhésif instantané à base d’acrylique curable léger pour coller des diapositives au microscope le long des bords d’une plaque de verre laissant un long bord ouvert. Couper l’optode planaire dans la forme et la taille requises pour s’insérer dans l’espace entre les glissières de microscope collées et placer l’optode à l’intérieur de la plaque de verre avant avec le côté enduit vers le haut. Collez un bord de la feuille d’optode à la plaque de verre et ajoutez de l’eau du robinet entre la plaque de verre et le papier d’aluminium optode.

Abaissez lentement le papier d’aluminium sur les gouttelettes d’eau permettant à l’optode de se redresser sur la surface du verre et d’utiliser un tissu mou pour enlever soigneusement une bulle d’air coincée entre l’optode et la plaque. Essuyez ensuite la plaque de verre et collez les bords restants du papier d’aluminium à la plaque. Ensuite, utilisez une plaque de verre plate pour répartir uniformément les sédiments de 0,5 millimètre sur la plaque jusqu’à la même épaisseur que les entretoires à glissière du microscope.

Nettoyez soigneusement la surface supérieure de la glissière du microscope pour vous assurer que la deuxième plaque de verre scelle correctement la chambre et appliquez de la graisse de silicone sur la surface de la glissière du microscope. Couvrez ensuite le sédiment d’un mince film d’eau tout en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Avant de placer un échantillon sur les sédiments, lavez soigneusement une seule pousse de Littorella uniflora et placez la pousse sur un sédiment avec les feuilles qui sortent du côté supérieur ouvert.

Lorsque l’échantillon est en place, placez la plaque de verre avec l’optode sur le sédiment et appliquez une pression douce pour mettre l’optode en contact étroit avec les racines des plantes et les sédiments environnants. Utilisez des pinces pour attacher les plaques ensemble et sécher les bords extérieurs avec du papier de soie. Ajoutez à plusieurs reprises quelques gouttes d’eau aux feuilles pour garder la plante hydratée tout au long de l’assemblage du rhizo-sandwich et utilisez du ruban électrique en vinyle pour resserrer la chambre rhizo-sandwich.

Ensuite, sceller les bords avec de l’argile de modélisation et du ruban électrique supplémentaire. Pour se préparer à l’imagerie, retirer le papier d’aluminium de couverture de la zone optode après l’incubation et positionner la chambre rhizo-sandwich avec le mur de verre avec l’optode droit contre le mur de l’aquarium. Utilisez un espaceur pour appuyer sur la chambre rhizo-sandwich contre le mur.

Placez la caméra à vie de luminescence basée sur le domaine de fréquence équipée d’un objectif devant l’aquarium et la zone d’intérêt. Fixez un filtre d’émission approprié pour l’imagerie du colorant indicateur à l’objectif de la caméra et fixez le guide lumineux dans la source d’excitation LED. Ensuite, placez le guide de sorte qu’il illuminera uniformément la feuille d’optode planaire couvrant la zone d’intérêt.

Dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez la caméra et sélectionnez la LED dans le logiciel de contrôle LED. Réglez l’intensité led au besoin et cocher analogique et synchroniser pour confirmer que la LED est déclenchée par la logique transistor-transistor externe. Concentrez manuellement la caméra et ajustez l’ouverture objective et réglez la source de modulation interne, l’onde sinusoïdale pour la forme d’onde de sortie, l’échantillonnage de phase supplémentaire, les échantillons en huit phases, l’ordre de phase opposé, appuyez sur la lecture A B et la fréquence de modulation de cinq kilohertz.

Ajustez le temps d’exposition jusqu’à ce que la lecture des statistiques de la région d’intérêt pour l’image normalisée de l’intensité de luminescence soit de l’intervalle de 0,68 à 0,72. Cliquez ensuite sur la référence de capture pour commencer l’acquisition d’une série de mesure de référence. Pour calibrer l’optode, utilisez un dispositif de mélange de gaz pour rincer l’eau dans un aquarium d’étalonnage avec un mélange de gaz azoté de l’air ambiant avec une concentration connue d’oxygène surveillant la concentration d’oxygène avec une sonde externe avec un capteur d’oxygène.

Ensuite, acquérir une série d’images à différentes concentrations d’oxygène dans la chambre d’étalonnage pour obtenir une courbe appropriée adaptée aux données d’étalonnage acquises. Lorsque le système a été calibré, éteignez les lumières appliquant l’irradiation à la plante et à toutes les autres sources de lumière et ajustez le temps d’acquisition en fonction de l’intensité de l’image pour vous assurer que le signal n’est ni sursaturé ni trop faible pour un bon rapport signal-bruit dans la détermination de la durée de vie. Lorsque toutes les images de durée de vie de l’oxygène ont été acquises, allumez les lumières pour obtenir une image structurelle et obtenir une image avec une règle dans le champ de vision pour permettre la mise à l’échelle ultérieure des images acquises.

Avant d’imaginer l’échantillon, l’optode doit être calibré. À la suite d’une décomposition quasi exponentielle, la durée de vie mesurée de la luminescence diminue à mesure que la concentration d’oxygène augmente. Cette relation peut également être décrite à l’aide du modèle simplifié à deux sites.

Une fois que l’optode a été calibré, il est possible de déterminer la concentration d’oxygène en imagerie de la durée de vie de la luminescence observée dans ces images dans lesquelles la distribution de la concentration d’oxygène dans la rhizosphère de Littorella uniflora a été photographiée après une exposition lumineuse à 500 photons de micromole par mètre carré par seconde pendant 12 heures et après 12 heures dans l’obscurité. En plus des images à vie, des images structurelles peuvent également être acquises sous illumination externe tout en maintenant la géométrie d’imagerie fixe pour permettre à l’imagerie par oxygène d’être précisément corrélée à l’image structurale. Les profils de concentration d’oxygène sur une seule racine, par exemple, peuvent ensuite être extraits des images acquises dans l’obscurité et la lumière.

Il est essentiel d’avoir un bon contact entre la matrice de l’échantillon et l’optode pour éviter les artefacts inutiles. Si vous avez des doutes, refaitez le sandwich. L’acquisition instantanée d’une image d’une manière non constructive permet de surveiller l’environnement de l’oxygène.

La méthode pourrait aussi bien être combinée avec d’autres optodes pour le pH ou d’autres analytes. Assurez-vous d’effectuer la fabrication optode dans une hotte de fumée que le cocktail capteur contient du chloroforme. Les optodes planaires peuvent être utilisés pour identifier les communautés microbiennes dans les sédiments.

Et après l’imagerie, le sandwich peut être ouvert pour échantillonner ces points chauds pour l’analyse de la communauté microbienne.