Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment mettre en œuvre la microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence à échantillonnage temporel, ou FLIM, dans un flux de travail automatisé sur plaque multi-puits en utilisant des logiciels libres et un équipement de base. Cette méthodologie peut être appliquée à des mesures basées sur la FLIM sur une série de cellules fixes ou vivantes. Elle est particulièrement utile pour analyser le traitement des signaux cellulaires ou les interactions protéiques.

Les principaux avantages de cette technique sont que l’imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM) fournit des résultats quantitatifs robustes et peut donner la fraction de population en interaction lors d’une seule mesure. L’application de techniques d’analyse globale à des milliers de cellules sur des centaines de champs permet d’utiliser les résultats de transfert d’énergie par résonance de type Förster, ou FRET, et de tirer parti, par exemple, de changements de durée de vie allant jusqu’à environ 20 picosecondes.

Sunil Kumar, notre chercheur associé, et Ian Munro, notre développeur logiciel, démontreront la procédure avec Frederik Gorlitz. Commencez par démarrer MicroManager et ouvrez le plugin openFLIM-HCA. Dans l'onglet de contrôle FLIM, sélectionnez le fichier de calibration de la boîte à retard et ouvrez les fichiers de calibration.

Sélectionnez le fichier de calibration pour la combinaison spécifique de l'unité de générateur de retard et de la fréquence de répétition du laser concernée. Dans le menu Fichier, sélectionnez Définir le dossier de base et choisissez le dossier dans lequel les données seront enregistrées. Après avoir confirmé que tous les paramètres appropriés ont été configurés, réglez manuellement une largeur de porte de quatre nanosecondes sur la boîte de commande de l'amplificateur optique à porte pour l'ensemble de l'expérience.

Pour acquérir les données d'image de la fonction de réponse de l'instrument, placez manuellement un bloqueur de faisceau dans la cassette du cube de filtres avant l'objectif afin d'empêcher toute fuite de lumière laser, et orientez le bloqueur de faisceau de manière à minimiser toute réflexion vers le bâti du microscope. Dans l'onglet de contrôle du trajet lumineux, réglez les filtres d'excitation, dichroïque et d'émission dans l'unité à disque tournant de sorte que la fraction de lumière d'excitation diffusée par le disque de Nipkow tournant puisse être imagée sans saturer le système pendant un temps d'intégration caméra minimal de 200 millisecondes. Dans l'onglet de contrôle FLIM, utilisez la fonction de recherche du point maximum sur toute la plage de retards couverte par la boîte de retard rapide programmable.

Ensuite, vérifiez le tracé de sortie affiché. Réglez les délais de parcours de manière à ce que le profil complet de la fonction de réponse de l'instrument se trouve dans la plage de balayage de la boîte de délai rapide. Ajustez les paramètres de densité neutre et de temps d'exposition.

En plus de l'accumulation d'images, veillez à ce que la caméra ne soit pas saturée dans la fenêtre temporelle de luminosité et que le temps d'intégration effectif ne soit pas inférieur à 200 millisecondes. Dans le menu de contrôle FLIM, sélectionnez la case de retard rapide et réglez des pas de retard de 25 picosecondes sur toute la plage de retard. Ensuite, sélectionnez l'option de remplissage des retards et cliquez sur capturer l'image FLIM pour acquérir une image de la fonction de réponse de l'instrument.

Et attendez jusqu'à ce que l'acquisition soit terminée. Dans le menu de contrôle du trajet lumineux, sélectionnez la densité neutre et cliquez sur « bloqué » pour bloquer le laser. Ouvrez le menu de contrôle de la microscopie de durée de vie en fluorescence (FLIM) et sélectionnez la case de retard rapide afin de réduire le nombre d'étapes de retard en augmentant la valeur dans la case d'incrément.

Ensuite, cliquez sur capturer l'image FLIM pour acquérir une image de fond de la caméra. Pour acquérir les données de référence du dé, accédez à l'onglet de contrôle XYZ et saisissez le puits H4 dans la boîte de dialogue « aller au puits ». Ensuite, rendez-vous dans l'onglet de contrôle du trajet lumineux et sélectionnez les filtres d'excitation, dichroïque et d'émission appropriés pour l'imagerie de la protéine fluorescente M turquoise à l'aide de la fonction de recherche du point maximum sur toute la plage de la boîte de retard rapide.

Ensuite, réglez les paramètres appropriés pour acquérir les données de référence du die et une image d'arrière-plan correspondante, comme vient de l'être démontré. Pour acquérir les données FLIM à partir d'un échantillon en plaque multi-puits, accédez au menu de configuration d'acquisition séquencée HCA. Sélectionnez l'onglet positions XYZ et définissez quels puits doivent être imagés ainsi que le nombre de champs de vision à acquérir par puits.

Sélectionnez un champ de vision représentatif contenant l'échantillon à imager et réglez le filtre neutre optimal pour le temps d'intégration de la caméra afin d'atteindre 75 % de la plage dynamique de la caméra de lecture. Sous l'onglet de contrôle XYZ, sélectionnez le retour du contrôle de mise au point dans la boîte de dialogue de mise au point automatique et effectuez manuellement la mise au point du microscope sur les cellules ou structures d'intérêt. Réglez la plage de recherche de la mise au point automatique sur 2000 micromètres et appuyez sur Entrée.

Cliquez ensuite sur AF maintenant pour lancer la procédure de mise au point automatique. Une valeur de décalage s'affichera dans le champ de mise au point automatique du décalage de focalisation. Saisissez cette valeur de décalage dans la fenêtre de décalage AF, puis cliquez deux fois sur AF maintenant pour répéter la procédure de mise au point automatique.

Les valeurs de décalage doivent maintenant être réglées à zéro, indiquant un fonctionnement correct du système de mise au point automatique. Ensuite, sous l'onglet de contrôle FLIM, sélectionnez la fonction de synchronisation automatique afin d'assurer un échantillonnage logarithmique des points de délai. Réglez le nombre d'images accumulées sur une valeur permettant d'obtenir le temps total souhaité d'acquisition des données.

Ensuite, dans la boîte de dialogue d'acquisition FLIM, cliquez sur le bouton démarrer la séquence HCA pour lancer l'acquisition FLIM sur la plaque multi-puits et acquérir une image de fond avec la caméra, comme vient de l'être démontré. Ici, un exemple représentatif de test FLIM FRET utilisant le système modèle FRET exprimé dans des cocultures et une plaque multi-puits est présenté, avec des exemples d'images de durée de vie de fluorescence acquises automatiquement, montrant des champs typiques visibles dans chaque puits. Dans cette expérience, les puits témoins négatifs présentaient les durées de vie les plus longues, et les durées de vie du donneur montraient les constructions FRET les plus faibles avec les longueurs d'espacer les plus courtes.

En général, la durée de vie moyenne, calculée sur l'ensemble des champs observés dans chaque puits, variait selon les puits de la plaque multipuits. La moyenne du profil de décroissance de l'intensité de fluorescence du donneur sur toutes les cellules imagées dans le puits A1, combinée à l'ajustement à un modèle de décroissance mono-exponentielle et à la fonction de réponse de l'appareil, montre que le modèle d'ajustement est valide. Une analyse supplémentaire de la durée de vie moyenne de fluorescence pour chaque colonne de la plaque multipuits, obtenue à partir d'un ajustement mono-exponentiel effectué pixel par pixel, démontre que la durée de vie diminue dans les constructions FRET comportant des linkers plus courts, simulant ainsi une expérience avec différentes efficacités FRET.

Dans cette expérience, les données FLIM d'un test FRET sur l'action de différents inhibiteurs sur l'oligomérisation des protéines ont été ajustées à l'aide d'un modèle de décroissance exponentielle simple. La carte de la durée de vie par puits illustre la durée de vie moyenne par puits, moyennée sur huit champs observés. Un petit jeu de données, avec l'acquisition de quatre champs par puits, tandis que notre test FLIM peut être réalisé en environ deux heures et demie, incluant le temps nécessaire à l'acquisition de la fonction de réponse de l'instrument, des données de référence du dié et à l'exécution de l'analyse dans FLIM fit.

Lors de la réalisation d'un test FLIM, il est important de se souvenir d'acquérir la fonction de réponse de l'instrument et les données de référence dièdre, ainsi que leurs images de fond, afin de disposer de toutes les informations nécessaires à l'analyse des données FLIM. À l'aide de notre logiciel libre FLIM fit, il est également possible d'ajuster ces données à des modèles de décroissance plus complexes. Par exemple, cela permet de déterminer la fraction de la population FRET.

Notre technologie FLIM HCA aide les chercheurs de la communauté de la découverte de médicaments à effectuer des mesures fiables du transfert d'énergie par résonance (fret). À l'avenir, nous espérons que cette technologie permettra de mesurer les constantes de dissociation dans des tests cellulaires. Nous espérons également que cet article vidéo ainsi que les informations disponibles sur notre Wiki aideront d'autres chercheurs à concevoir leurs propres instruments FLIM HCA et à les appliquer au fret ainsi qu'à d'autres tests.

N'oubliez pas que le travail avec des lasers peut être dangereux et que des précautions, telles que l'enclosure de tous les faisceaux laser, doivent toujours être prises lors de l'utilisation de tels instruments.