Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment mettre en œuvre la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence à déclenchement temporel, ou FLIM, dans un flux de travail automatisé à plusieurs puits à l’aide d’un logiciel open source et d’une instrumentation de base. Cette méthodologie peut être appliquée à des lectures basées sur FLIM dans une série de cellules fixes ou actives. Et il est particulièrement utile pour lire le traitement du signal cellulaire ou les interactions protéiques.

Les principaux avantages de cette technique sont que FLIM fournit des lectures quantitatives robustes et peut fournir une fraction de population d’interaction en une seule mesure. L’application de techniques d’analyse globale à des milliers de cellules sur des centaines de champs de vision nous permet d’utiliser le transfert d’énergie de la résine, ou lectures FRET. Et en profitant, par exemple, des changements de durée de vie jusqu’à environ 20 picosecondes.

Sunil Kumar, notre associé de recherche, et Ian Munro, notre développeur de logiciels, feront la démonstration de la procédure avec Frederik Görlitz. Commencez par démarrer le microgestionnaire et ouvrez le plugin openFLIM-HCA. Sous l’onglet de contrôle FLIM, sélectionnez Fichier d’étalonnage de la boîte de retard et ouvrez les fichiers d’étalonnage.

Sélectionnez le fichier d’étalonnage pour la combinaison spécifique de l’unité de génération de retard et du taux de répétition laser qui vous intéresse. Dans le menu Fichier, sélectionnez définir le dossier de base et sélectionnez le dossier dans lequel les données seront enregistrées. Après avoir vérifié que tous les paramètres appropriés ont été réglés, réglez manuellement une largeur de porte de quatre nanosecondes au niveau du boîtier de commande de l’intensificateur optique à grille pour l’ensemble de l’expérience.

Pour acquérir les données d’image de la fonction de réponse de l’instrument, placez manuellement un bloc de faisceau dans la cassette du cube de filtre avant l’objectif pour empêcher toute lumière laser de s’échapper et inclinez le bloc de faisceau pour minimiser toute réflexion dans le cadre du microscope. Sous l’onglet de contrôle du trajet lumineux, réglez les filtres d’excitation, dichroïque et d’émission dans l’unité de disque en rotation, de sorte que la fraction de la lumière d’excitation diffusée par le disque de Nipkow en rotation puisse être imagée sans saturer le système pendant un minimum de 200 millisecondes de temps d’intégration de la caméra. Sous l’onglet de contrôle FLIM, utilisez la fonction de recherche du point maximal sur toute la plage des retards couverts par la boîte de retard rapide programmable.

Vérifiez ensuite la trace de sortie affichée. Et réglez les temps de retard de course, de sorte que le profil de fonction de réponse complet de l’instrument se trouve dans la plage de balayage de la boîte de retard rapide. Ajustez les paramètres de densité neutre et de temps d’exposition.

Ainsi que l’accumulation d’images, de sorte que la caméra n’est pas saturée dans le portique de temps de luminosité et que le temps d’intégration effectif n’est pas inférieur à 200 millisecondes. Dans le menu de contrôle FLIM, sélectionnez la case de retard rapide et réglez des pas de retard de 25 picosecondes sur toute la plage de retard. Ensuite, sélectionnez Remplir les délais et cliquez sur Snap FLIM image pour acquérir une image de fonction de réponse de l’instrument.

Et attendez que l’acquisition soit finalisée. Dans le menu de contrôle du trajet lumineux, sélectionnez densité neutre et cliquez sur bloqué pour bloquer le laser. Ouvrez le menu de contrôle FLIM et sélectionnez la case de retard rapide pour réduire le nombre d’étapes de retard en augmentant la valeur dans la zone d’incrément

Cliquez ensuite sur Snap FLIM image pour acquérir une image d’arrière-plan de l’appareil photo. Pour acquérir les données de matrice de référence, allez dans l’onglet de contrôle XYZ et entrez le puits H4 dans la boîte de dialogue Aller au puits. Ensuite, allez dans l’onglet de contrôle du trajet de la lumière et sélectionnez les filtres d’excitation, dichroïque et d’émission appropriés pour l’imagerie de la protéine fluorescente turquoise M à l’aide de la fonction de recherche du point maximal sur toute la plage de la boîte de retard rapide.

Définissez ensuite les paramètres appropriés pour l’acquisition des données de matrice de référence et d’une image d’arrière-plan correspondante, comme cela vient d’être démontré. Pour acquérir les données FLIM à partir d’un échantillon de plaque multipuits, accédez au menu d’acquisition séquencée HCA de configuration. Sélectionnez l’onglet Positions XYZ et définissez les puits qui doivent être imagés et le nombre de champs de vision à acquérir par puits.

Sélectionnez un champ de vision représentatif contenant l’échantillon à imager et réglez le filtre de densité neutre optimal dans le temps d’intégration de la caméra pour atteindre 75 % de la plage dynamique de la caméra de lecture. Sous l’onglet Contrôle XYZ, sélectionnez Retourner le contrôle de mise au point dans la boîte de dialogue Mise au point automatique et faites la mise au point manuelle du microscope sur les cellules ou les structures d’intérêt. Réglez la plage de recherche de mise au point automatique sur 2000 micromètres et appuyez sur Entrée.

Cliquez ensuite sur AF maintenant pour lancer la procédure de mise au point automatique. Une valeur de décalage apparaîtra dans le champ de mise au point automatique du décalage de mise au point. Entrez cette valeur de décalage dans la fenêtre de décalage AF, puis cliquez deux fois sur AF maintenant pour répéter la procédure de mise au point automatique.

Les valeurs de décalage doivent maintenant être mises à zéro, ce qui indique un bon fonctionnement du système de mise au point automatique. Ensuite, sous l’onglet de contrôle FLIM, sélectionnez la fonction d’autogating pour assurer un échantillonnage logarithmique des points de retard. Définissez l’accumulation des trames sur une valeur qui donne le temps total d’acquisition de données souhaité.

Ensuite, dans la boîte de dialogue d’acquisition FLIM, cliquez sur le bouton Démarrer la séquence HCA pour exécuter l’acquisition de plaques multipuits FLIM et acquérir une image de caméra d’arrière-plan comme cela vient d’être démontré. Ici, un test de frette FLIM représentatif utilisant le système de frette modèle exprimé en cocellules et une plaque multi-puits est présenté, avec des exemples d’images de durée de vie de fluorescence acquises automatiquement de champs de vision typiques apparents dans chaque puits. Dans cette expérience, les puits de contrôle négatifs présentaient les durées de vie les plus longues, et les durées de vie des donneurs présentaient les constructions de frettes les plus basses avec les longueurs de liaison les plus courtes.

Dans l’ensemble, la durée de vie moyenne sur tous les champs de vision de chaque puits variait entre les plaques multipuits. La moyenne du profil de décroissance de l’intensité de fluorescence du donneur sur toutes les cellules imagées dans le puits A1, ainsi que l’ajustement à un modèle de décroissance exponentielle mono et la fonction de réponse de l’instrument, montrent que le modèle d’ajustement est valide. Une analyse plus poussée de la durée de vie moyenne de la fluorescence pour chaque colonne de la plaque multipuits, obtenue à partir d’un ajustement exponentiel mono au pixel près, démontre les diminutions de durée de vie dans les constructions de frettes avec des longueurs de liant plus courtes, simulant une expérience avec différentes efficacités de frette.

Dans cette expérience, les données FLIM d’un test de frette de l’action de différents inhibiteurs sur l’oligomérisation des protéines ont été ajustées avec un seul modèle de décroissance exponentielle. La carte de la durée de vie de la fluorescence de la plaque illustre la durée de vie moyenne par puits, calculée en moyenne sur huit champs de vision. Un petit ensemble, imageant quatre champs de vision par puits, tandis que notre test FLIM peut être réalisé en environ deux heures et demie, y compris le temps d’acquérir la fonction de réponse de l’instrument, les données de la matrice de référence et d’exécuter l’analyse en ajustement FLIM.

Lors de l’exécution d’un test FLIM, il est important de ne pas oublier d’acquérir les données de réponse de l’instrument, de fonction et de référence, ainsi que leurs images d’arrière-plan, afin d’avoir toutes les informations nécessaires à l’analyse des données FLIM. À l’aide de notre logiciel open source, FLIM fit, il est également possible d’intégrer ces données dans des modèles de décomposition plus complexes. Par exemple, permettre la détermination de la fraction de population de frettes.

Notre technologie FLIM HCA aide les chercheurs de la communauté de la découverte de médicaments à effectuer des mesures robustes de l’arbre frettique. À l’avenir, nous espérons que cette technologie permettra de mesurer les constantes de dissociation dans des tests cellulaires. Nous espérons que cet article vidéo, ainsi que les informations contenues dans notre wiki, aideront d’autres chercheurs à construire leur propre instrumentation FLIM HCA et à l’appliquer à Fret et à d’autres tests.

N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être dangereux et que des précautions telles que l’enfermement de tous les faisceaux laser doivent toujours être prises lors de l’utilisation de tels instruments.