Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

Il s’agit du premier protocole à purifier et à la culture simultanément et efficacement les neurones moteurs oculaires et rachidiens primaires des souris embryonnaires. Il permet l’étude des mécanismes sous-jacents à la maladie des motoneurones. Ce protocole ajoute une nouvelle composante de culture oculomotrice in vitro aux systèmes existants et fournit des espèces pures et des cultures de neurones moteurs rachidiens assorties à l’âge à des fins de comparaison.

Dans la sclérose latérale amyotrophique, les neurones moteurs rachidiens dégénèrent tandis que les neurones oculomotor sont relativement épargnés. La comparaison de ces cultures pourrait fournir un aperçu du mécanisme et de la thérapie de la maladie. Cette méthode facilitera les études des mécanismes sous-jacents au développement des motoneurones, à la maladie et à la vulnérabilité sélective.

Notre système culturel permet la caractérisation de la morphologie des motoneurones, de la biologie moléculaire et de l’électrophysiologie. Pour ceux qui sont nouveaux à cette technique, nous recommandons beaucoup de pratique. La dissection peut être techniquement difficile et de multiplesissectors peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de neurones pour la culture primaire.

Commencez par récolter des embryons positifs du FEM de l’îlot1 d’une souris enceinte environ 11,5 jours après la fécondation. Vaporiser abondamment l’abdomen d’éthanol et retirer l’utérus à l’aide de ciseaux de microdissection stériles et de forceps de pansement du pouce. Lavez brièvement l’utérus dans le PBS stérile.

Ensuite, transférez-le à la plaque de dissection remplie de PBS stérile pré-refroidi. Sous la lumière vive du microscope, retirez soigneusement les embryons de l’utérus à l’aide de ciseaux de microdissection, de pinces à épiler et de pinces Dumont 5. Ensuite, utilisez une mini cuillère perforée Moria stérile pour transférer chaque embryon dans un puits séparé d’une plaque de 24 puits remplie d’un milieu pré-réfrigéré hibernation E faible fluorescence complété par 1X V27.

Tout en gardant la plaque sur la glace, transférez un embryon dans une plaque de dissection stérile et couvrez-le complètement avec la solution de sel équilibré stérile de Hank ou HBSS stérile de glace. Utilisez des pinces à épiler pour enlever le visage de l’embryon et la queue sans endommager le midbrain. Ensuite, placez l’embryon sujette avec des membres chevauchés et la queue pointant vers l’avant du microscope.

Utilisez des pinces à épiler pour ouvrir le toit du quatrième ventricule afin de générer une petite ouverture. Utilisez cette ouverture pour accrocher des pincettes dans l’espace créé entre le quatrième ventricule et son toit. Disséquer le long de la surface dorsale de l’embryon rostral vers le cortex et latéralement à la plaque de plancher et colonne motrice.

Ouvrez ensuite le tissu disséqué d’une manière ouverte pour révéler les noyaux positifs du GFP CN3 et CN4. Séparez soigneusement le midbrain ventral de l’embryon et enlevez le tissu méningé avec des pinces à épiler et un couteau de microdissection. Disséquer les noyaux bilatéraux GFP positifs CN3 et CN4 loin de la plaque de plancher et d’autres tissus environnants positifs GFP en prenant soin d’éviter de toucher ou d’endommager les neurones.

Si vous collectez des noyaux distincts du CN3 et du CN4, coupez le long du midbrain de ces deux noyaux et utilisez une pipette P1000 pour recueillir le tissu ventral disséqué de midbrain avec un minimum de HBSS. Placez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre étiqueté rempli de milieu de dissection et rangez le tube sur la glace jusqu’à la dissociation. Continuer à tirer les midbrains ventraux d’embryons supplémentaires dans le même tube jusqu’à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales.

Pour disséquer la moelle épinière ventrale, gardez l’embryon sujet à la tête face à l’avant du microscope. Tenez-le avec une paire de pinces et insérez la pointe de l’autre paire dans la partie caudale non ouverte du quatrième ventricule. Ouvrez le reste de l’arrière-cerveau et de la moelle épinière dorsalement sur toute l’étendue rostrocaudal de l’embryon.

Couper le tissu dorsal à partir du quatrième ventricule et travailler vers le canal central de la moelle épinière caudale en utilisant les forceps comme ciseaux. Ensuite, tenez l’embryon avec un ensemble de pincettes et pincez le rabat du tissu dorsal de chaque côté avec l’autre paire. Retirez la moelle épinière ventrale en utilisant le couteau de microdissection pour percer directement au-dessous du SMN positif de GFP soulevant la moelle épinière ventrale avec des mouvements saw-like des deux côtés.

Couper la moelle épinière transversalement à la limite supérieure du membre inférieur et enlever la partie lombaire cervicale. Coupez transversalement directement au-dessus de C1 où le premier GFP positive projets de corne antérieure. Placez le côté dorsal ventral de moelle épinière vers le haut et maintenez-le en appuyant sur le tissu négatif de GFP entre les colonnes positives de SMN de GFP avec une paire de pinces à épiler.

Enlevez le mesenchyme attaché restant, drgs, et moelle épinière dorsale en coupant les deux côtés de la colonne positive de SMN de GFP avec le couteau de microdissection. Utilisez une pipette P1000 pour recueillir le tissu ventral disséqué de la moelle épinière avec un minimum de HBSS et placez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre étiqueté rempli d’un milieu de dissection. Conservez-le sur la glace jusqu’à la dissociation et continuez à tirer les moelles épinières ventrales d’embryons supplémentaires dans le même tube.

Ajoutez le volume approprié de solution de papain à chacun des tubes de microcentrifugeuse avec les échantillons disséqués de tissu. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en agitant les tubes toutes les 10 minutes en faisant claquer les doigts. Après l’incubation, triturer délicatement chaque suspension huit fois avec une pipette P200 et la centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes.

Resuspendez les granulés cellulaires avec le volume approprié de solution d’inhibiteur ovomucoïde d’albumine en pipetting doucement de haut en bas. Répétez la centrifugation. Ensuite, retirez soigneusement le supernatant avec une pipette P1000.

Résuspendez les cellules dans le volume approprié du milieu de dissection. Filtrer les suspensions à l’aide d’une passoire à cellules de 70 micromètres. Ensuite, utilisez le tri FACS pour isoler les cellules positives GFP disséquées du CN3/CN4 et du SMN.

Diluer les suspensions cellulaires isolées avec le milieu de culture des motoneurones préchauffé à 37 degrés Celsius aux densités appropriées et ajouter 200 microlitres de la suspension à un puits d’une plaque de 96 puits recouverte de laminine PDL. Culture des neurones dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone en s’assurant de rafraîchir le milieu de culture des motoneurones tous les cinq jours. Quand les neurones isolés avec succès ont été cultivés dans la culture, les cultures primaires presque pures de CN3/CN4 et de SMN ont été obtenues et maintenues pendant 14 jours in vitro.

Les puretés des cultures à deux jours in vitro étaient 93.5%pour CN3/CN4 et 86.7%pour SMN une fois évaluées par immunocytochimie avec le marqueur de neurone moteur Islet1 et marqueur neuronal TUJ1. Les puretés reposaient fortement sur l’âge des embryons et sur l’établissement des seuils appropriés pour les portes GFP pendant facs. La pureté des neurones isolés des embryons E10.5 était comparable à celle des embryons E11.5.

Cependant, la pureté a diminué de manière significative quand E13.5 embryons ont été utilisés. Pour déterminer si les CN3/CN4 primaires et les SMN ont montré des réponses différentielles aux facteurs de stress endoplasmiques de réticulum, les cellules ont été traitées avec des concentrations variables d’acide cyclopiazonique ou de CPA à deux jours in vitro et fixées trois jours plus tard pour l’immunocytochimie pour évaluer des rapports de survie. Le nombre de neurones viables dans chaque échantillon a été compté et les ratios de survie ont été calculés.

Les monocultures CN3/CN4 étaient significativement plus résistantes au traitement cpa que les monocultures SMN. Suite à cette procédure, de nombreuses méthodes supplémentaires peuvent être effectuées pour examiner les neurones moteurs. Quelques exemples incluent des études de l’électrophysiologie, de la biologie cellulaire, de la transcription, ou de l’accessibilité de chromatine.