Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes
31 mai 2020
Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.
Ce protocole facilite l’identification et l’isolement des populations vivantes de cellules coralliennes à un niveau descriptionnel qui n’était pas possible auparavant. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’accès à un niveau de spécificité cellulaire jusqu’à présent pour la plupart inaccessible. La Dre Shannon Saigh, associée de recherche à la ressource partagée de cytométrie de débit au Sylvester Comprehensive Cancer Center, démontrera la procédure.
Pour configurer le cytomètre d’écoulement pour le tri vivant des cellules coralliennes, ouvrez un nouveau modèle de projet dans le logiciel de cytomètre à flux et sélectionnez les lasers appropriés pour l’analyse dans le panneau laser. Ensuite, créez une parcelle de dispersion latérale par rapport à une parcelle de dispersion vers l’avant dans les parcelles appropriées pour la mise en place de la stratégie de gating et d’analyse. Pour l’analyse cytométrique de flux et le tri des cellules coralliennes vivantes, chargez l’échantillon de cellules non tachées de contrôle dans la chambre d’échantillon du cytomètre et commencez le processus de lecture.
Comme les cellules coralliennes sont particulièrement fragiles, maintenez la pression du cytomètre basse pour prévenir la lyse cellulaire. Dans l’intrigue scatter, réglez la tension multiplicatrice photo pour centrer les points et commencer à enregistrer les événements. Dans la parcelle de dispersion avant contre côté, créez une porte autour des cellules autour de la 10 à la 4ème marque sur l’axe x de dispersion vers l’avant.
Remplacez l’échantillon de contrôle par le premier échantillon de cellules tachées et enregistrez environ 10 000 cellules avant de faire une pause. Ensuite, portez les événements qui sont uniques au groupe d’échantillons tachés. Pour trier les cellules coralliennes vivantes, après avoir sélectionné la population cellulaire d’intérêt pour le logiciel de cytomètre à flux, placez un tube de microcentrifugeuse contenant de 250 à 500 microlitres de la solution de collecte appropriée dans la chambre de collecte des cytomètres pour que chaque population trie.
Une fois qu’un temps approprié s’est écoulé pour éliminer les débris, commencez à trier la population désirée pour recueillir entre 10 000 et plusieurs millions de cellules. Chaque fois qu’une nouvelle tache, espèce ou trieur est utilisé, triez au moins 20 000 cellules d’intérêt en 500 microlitres de milieu de coloration pour permettre un contrôle de pureté sur la population d’intérêt et réanalysez les cellules triées pour confirmer que les événements sont lus à l’intérieur de la porte utilisée pour le tri initial. Pour les études in vitro, stockez les cellules triées sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient transférées dans un incubateur ou un environnement stérilisé.
Pour apporter d’autres particules non cellulaires qui ne partagent pas la même forme ou granularité que les cellules coralliennes peuvent être retirés de l’analyse en créant une sélection de porte sur une parcelle de dispersion avant et latérale. Les cellules mortes peuvent être exclues en comparant le signal DAPI des suspensions cellulaires non tachées et tachées à l’aide d’un histogramme et en tachant les cellules à haut taux d’expression dapi. En parallèle, les cellules hébergeant la symbioseasia d’autofluorescence peuvent être enlevées en gating contre des cellules avec le signal élevé dans le canal rouge lointain.
Après ce processus itératif de gating, les cellules restantes représentent les populations vivantes intactes de cellules coralliennes manquant de symbioseasia. Ces cellules peuvent ensuite être classées en différentes sous-populations cellulaires en soudant des caractéristiques telles que l’activité réactive des espèces d’oxygène et/ou la teneur en lysosome. Il est essentiel de se rappeler que certaines cellules sont plus fragiles que d’autres et d’exécuter ce processus aussi soigneusement que possible.
Une fois que des cellules spécifiques ont été isolées, elles peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles x-vivo telles que l’établissement de cultures cellulaires et la création de profils transcriptomiques.
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Aperçu
Cette étude répond au besoin d'une meilleure compréhension des cellules coralliennes, qui sont cruciales pour la biodiversité des écosystèmes marins. Les auteurs présentent un nouveau protocole pour l'isolement et le marquage des populations de cellules de coraux durs, atteignant un niveau de spécificité cellulaire sans précédent.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie corallienne
- Techniques d'isolement cellulaire
- Biodiversité des écosystèmes
Contexte
- Les coraux forment des écosystèmes essentiels pour la vie marine.
- Les connaissances actuelles sur les fonctions des cellules coralliennes sont limitées.
- L'isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes est vital pour la recherche ultérieure.
Méthodes utilisées
- Cytométrie en flux pour le tri des cellules vivantes
- Corail dur comme organisme modèle
- Stratégie de sélection pour identifier et isoler des types cellulaires spécifiques
Résultats principaux
- Le protocole permet l'identification et le tri des populations de cellules coralliennes vivantes.
- Assure la pureté et la viabilité des cellules triées pour les analyses futures.
- Facilite l'étude des sous-populations et de leurs fonctions.
Conclusions
- L'étude présente une méthode fiable pour isoler les cellules coralliennes, améliorant le potentiel de recherche.
- Les résultats apportent des informations précieuses sur la biologie corallienne et la santé de l'écosystème.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
