Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules endothéliales lymphatiques de haute pureté qui tapissent les vaisseaux lymphatiques des malformations lymphatiques humaines et des prépuces en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence. Ceci est accompli d’abord en digérant enzymatiquement un échantillon de tissu du patient. Dans un deuxième temps, la suspension unicellulaire est cultivée pour enrichir le nombre de cellules endothéliales lymphatiques.

Dans l’échantillon. Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt et triées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence multiparamètre. En fin de compte, le prépuce et la malformation lymphatique, les cellules endothéliales lymphatiques peuvent être élargies en culture cellulaire pour une analyse plus approfondie en aval.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que le tri cellulaire activé par fluorescence donne des cellules dont la pureté est supérieure à 99 %, évitant ainsi les problèmes associés à la perte de cellules endothéliales lymphatiques due à la prolifération par des cellules contaminantes. Commencez par peser un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de fluide, complété par une solution antimycosique antibiotique. Transférez ensuite la malformation lymphatique ou quatre échantillons de peau dans le tube et pesez à nouveau le tube pour déterminer le poids du tissu.

Ensuite, dans une enceinte de biosécurité de classe deux, utilisez des pinces stériles pour transférer le tissu et le milieu dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres à l’aide de ciseaux stériles. Enfin, coupez le tissu en morceaux d’un millimètre cube. Transférez ensuite les morceaux dans un tube de 50 millilitres avec 10 millilitres d’antibiotique antimycosique frais. Douleur moyenne.

Faites tourner le tube plusieurs fois pour remettre le tissu en suspension, puis faites pivoter l’échantillon. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de solution de digestion préchauffée pour 100 milligrammes de tissu haché et incubez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation constante à 200 tr/min pour un enrichissement réussi des cellules endothéliales lymphatiques. Il est essentiel de reconnaître quand les cellules ont été suffisamment exposées à la réaction de collagénase et de dys space pour qu’elles survivent à l’isolement.

Ceci est réalisé grâce à une surveillance attentive du processus de digestion des tissus et à l’arrêt de la réaction lorsque la plupart des tissus ont été digérés en fragments fins. À la fin de l’incubation, confirmez que presque tous les tissus ont été digérés en petits fragments et filtrez la boue tissulaire à travers une crépine de 70 microns dans un tube stérile de 50 millilitres. Utilisez maintenant un piston de seringue de trois millilitres avec un piston en caoutchouc pour broyer le tissu restant jusqu’à ce que seules de petites traces de matrice extracellulaire soient observées.

Ensuite, lavez la passoire cellulaire avec un volume de milieu cellulaire endothélial équivalent au volume du milieu enzymatique dissociant et faites tourner les cellules reus. Suspendez la pastille dans jusqu’à 20 millilitres de milieu de cellules endothéliales, en fonction de la taille de l’échantillon. Ensuite, après avoir compté les graines, deux fois 10 aux six cellules dans un flacon de 150 centimètres carrés précodé avec de la fibronectine dans un volume final de 20 millilitres de milieu cellulaire endothélial pour la culture pendant la nuit.

Le lendemain matin, lavez les cellules non liées avec trois rinçages de PBS complété par une solution antimycosique antibiotique. Ensuite, pour augmenter le nombre de cellules endothéliales lymphatiques, ajoutez un milieu de cellules endothéliales fraîches aux cellules et incubez la culture pendant cinq à sept jours jusqu’à ce que la culture soit confluente à environ 80 %. Pour colorer les cellules à trier par tri cellulaire activé par fluorescence multiparamètre.

Tout d’abord, retirez le milieu cellulaire, lavez les cellules trois fois dans du PBS. Ajoutez ensuite sept millilitres de solution de détachement après une incubation de cinq à sept minutes à 37 degrés Celsius. Récoltez les cellules dissociées, inactivez les enzymes avec trois volumes de milieu cellulaire endothélial et transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile.

Centrifugez les cellules trois fois, en lavant la pastille dans cinq millilitres de PBS pour les deuxième et troisième essorages après le dernier lavage. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de PBS frais et comptez le nombre de cellules viables en excluant le bleu trian. Après le comptage cellulaire.

Transférez aseptiquement les cellules dans des tubes de coloration par cytométrie en flux et faites tourner les cellules pour bloquer la liaison non spécifique. Remettre les cellules en suspension dans 5 % F-B-S-P-B-S et incuber sur de la glace pendant 20 minutes. Après avoir bloqué la centrifugeuse, les cellules éliminent le surnageant et le résus.

Suspendre la pastille dans le cocktail d’anticorps CD 34, CD 31 potanine et récepteur VEGF trois. Après 20 minutes sur glace, lavez les cellules trois fois dans deux millilitres de F-B-S-P-B-S pour éliminer tout anticorps non lié et réusus. Suspendre la pastille dans 300 microlitres d’iodure de propidium dans une solution F-B-S-P-B-S sur de la glace.

Enfin, triez les cellules endothéliales lymphatiques humaines purifiées sur un instrument de tri cellulaire activé par fluorescence multiparamètre. Ensuite, faites tourner les cellules triées et suspendez les granulés dans le milieu approprié pour l’ensemencement de la culture cellulaire. Ici, les vaisseaux lymphatiques et de malformation lymphatique humains normaux marqués avec des anticorps contre le déplane du pot sont montrés note la dilatation marquée et la variation considérable de la taille de la lumière dans les vaisseaux de malformation lymphatique humaine.

En effet, la plupart des malformations lymphatiques contiennent à la fois des structures kystiques anormales petites ou microkystiques et de grandes structures anormales ou macrokystiques après la digestion initiale des tissus et 24 heures de culture dans les échantillons non fractionnés. Des colonies de cellules endothéliales distinctes peuvent être observées en plus des cellules de type fibroblaste et des cellules musculaires lisses après le tri et 24 heures supplémentaires en culture cellulaire. Cependant, le CD 34, le récepteur VEGF faible CD 31 positif, trois cellules positives et les cellules positives attachées au récipient de culture présentent la morphologie typique des galets observée dans ces images.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler avec une grande pureté la cellule endothéliale lymphatique qui tapisse la malformation lymphatique humaine et les vaisseaux lymphatiques complets de la peau à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains primaires peut être dangereux car ils peuvent contenir des agents infectieux nocifs pour la santé humaine. Les précautions standard telles que le port de gants, de lunettes de protection et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.