Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique

Ainsi, le test TBARS est mieux utilisé pour l’évaluation générale intra-laboratoire du stress oxydatif dans les échantillons biologiques, dans laquelle les niveaux relatifs de TBARS sont directement comparés entre les échantillons qui ont été stockés et traités ensemble. Ces tests ont un coût extrêmement faible d’environ 3 pour tester 96 échantillons par rapport aux kits disponibles dans le commerce, qui coûtent environ 400, et ne permettent d’analyser qu’un seul lot d’échantillons. La méthode décrite ici peut être adaptée à des applications spécifiques, y compris les études de stabilité des échantillons biologiques et celles pour lesquelles l’ajout d’antioxydants ou d’autres types de conservateurs d’échantillons avant l’analyse est approprié ou obligatoire.

Pour éviter des résultats très variables, préparez des réactifs frais, en vous assurant que le pH n’est pas supérieur à quatre pour les réactifs de couleur et éliminez toutes les bulles dans la plaque de gonflement nidese avant de mesurer l’absorbance. Commencez par préparer une solution aqueuse à 0,8 % d’acide thiobarbiturique. Préparez une solution d’hydroxyde de sodium à cinq molaires en dissolvant quatre grammes de billes d’hydroxyde de sodium dans 20 millilitres d’eau.

Conservez la solution dans un récipient en plastique. Il doit être fraîchement préparé pour chaque lot. Ajoutez quatre grammes d’acide thiobarbiturique à 450 millilitres d’eau déminéralisée et utilisez un agitateur magnétique pour le dissoudre doucement.

Ajoutez lentement environ quatre millilitres de la solution d’hydroxyde de sodium par incréments de 100 microlitres, en vérifiant le pH à mesure que les particules d’acide thiobarbiturique se dissolvent. Continuez à ajouter l’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que toutes les particules se dissolvent. Vérifiez que le pH de la solution n’est pas supérieur à quatre avec une bandelette de pH, puis portez le volume final à 500 millilitres avec de l’eau désionisée et conservez la solution aqueuse d’acide barbare thiobarbiturique à température ambiante.

Préparez des solutions de courbe standard MDA bis diméthylacétal dans des tubes en polypropylène à pression de deux millilitres. En diluant la solution mère de 200 micromolaires dans l’eau comme décrit dans le manuscrit. Vortex les échantillons.

Étiquetez les tubes en verre pour les échantillons à analyser, puis ajoutez 100 microlitres de l’échantillon préparé dans chaque tube. Ajoutez 200 microlitres de 8,1 % de SDS à chaque échantillon et faites tourner doucement le tube de verre dans un mouvement circulaire pour mélanger. Ajoutez 1,5 millilitre de tampon d’acétate de sodium à 3,5 molaires à chaque échantillon, puis ajoutez 1,5 millilitre de la solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 %.

Portez le final de chaque tube à quatre millilitres en ajoutant 700 microlitres d’eau déminéralisée. Fermez hermétiquement les tubes de verre et incubez-les dans un bloc chauffant réglé à 95 degrés Celsius pendant une heure. Couvrez les tubes de papier d’aluminium pour éviter la condensation, puis retirez les tubes du bloc et incuberez-les sur de la glace pendant 30 minutes.

Après l’incubation, centrifuger les échantillons et les étalons à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 150 microlitres de surnageant de chaque tube dans un puits dans une plaque à 96 puits, en éliminant toutes les bulles d’air avec la pointe de la pipette. Mesurez l’absorbance des échantillons à 532 nanomètres, puis soustrayez la lecture absorbante moyenne des échantillons vierges de toutes les autres lectures d’absorbants.

Créez une courbe standard et utilisez-la pour calculer des concentrations d’échantillons inconnues. Des courbes standard MDA bis diméthylacétol ont été générées pour déterminer les limites de détection et de sensibilité du test et les niveaux d’oxydation dans trois échantillons biologiques différents. Au total, 9 tests TBARS ont été effectués sur les trois échantillons à des jours différents.

Pour déterminer les limites de détection, l’absorbance des échantillons à blanc a été mesurée sur trois jours différents. La concentration minimale de substance TBARS nécessaire pour donner un signal non absorbant le bruit détectable est de 1,1 micromolaire. Et la sensibilité du test est d’environ 0,0016 unité d’absorption par augmentation micromolaire de la concentration.

Le test TBARS peut être utilisé pour détecter les changements dans la peroxydation lipidique de diverses matrices biologiques. Pour démontrer cela, le chlorure de cuivre deux a été utilisé pour induire l’oxydation in vitro des lysats de cellules HEPG2 sériques humaines et des lipoprotéines de basse densité. Un test TBARS a été effectué sur des échantillons de LDL contenant de l’EDTA et les niveaux de TBARS n’ont pas changé entre les échantillons de cuivre traités et les échantillons de LDL non traités.

Cependant, après l’élimination de l’EDTA par filtration de spin, le LDL a subi une oxydation médiée par le cuivre deux. Pour illustrer la plage dynamique du test TBARS dans le sérum humain, une concentration de deux ions de cuivre millimolaires a été ajoutée aux échantillons, ce qui a entraîné une augmentation de six à sept fois des TBARS. Lorsque vous essayez ce protocole, ne laissez pas les échantillons sur de la glace pendant plus de 10 minutes et laissez-les à température ambiante après la centrifugation.

Pour les lots ou les sous-ensembles d’échantillons biologiques qui n’ont pas été initialement collectés, traités et stockés ensemble, il faut évaluer statistiquement les données pour les effets de lot afin de s’assurer que l’oxydation artificielle n’a pas contribué aux résultats. L’oxydation in vitro quantifiable intentionnelle des lipoprotéines de basse densité permet de comprendre comment l’oxydation affecte sa biologie fonctionnelle.