Name: Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Apprenez à mesurer la confluence des cellules iPS à l'aide d'un système d'imagerie automatisé. Cette méthode évalue l'impact des revêtements de matrice extracellulaire sur la croissance cellulaire sans perturber la culture.

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L’étude a été financée par des subventions de la Fondazione Bambino Gesù et de Ricerca Corrente (ministère italien de la Santé) à C.C.  Nous tenons à remercier le Dr Enrico Bertini (Département de neurosciences, Unité des maladies neuromusculaires et neurodégénératives, Laboratoire de médecine moléculaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), le Dr Stefania Petrini (Centre central de microscopie confocale, Laboratoires de recherche, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Département d’onco-hématologie, thérapie génique et cellulaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù) et Roberta Ferretti (Département d’onco-hématologie, thérapie génique et cellulaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù) pour des discussions scientifiques et une aide technique. Maria Vinci est récipiendaire d’une bourse « Children with Cancer UK ».

1. Revêtement de 96 plaques de puits
REMARQUE : Différents revêtements ont été testés dans la même plaque, mais dans des puits distincts (voir le dossier supplémentaire).
<ol><li>Diluer le Matrigel 1:100 dans DMEM. Ajouter 100 μL par puits aux plaques de 96 puits et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez la solution et lavez les puits avec 100 μL de DMEM deux fois.</li>
	<li>Laminine diluée (20 μg/mL, LN-521) dans du PBS (avec calcium et magnésium). Ajouter 100 μL au puits et incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, effectuez deux lavages avec DMEM avant d’ensemencer les cellules.</li>
	<li>Diluer la vitronectine (10 μg/mL) dans un tampon de dilution. Ajouter 100 μL par puits à la plaque de 96 puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Lavez les puits avec du PBS (sans calcium ni magnésium) avant de plaquer les cellules.</li>
	<li>Diluer la HU-fibronectine (30 μg/mL) dans le ddH2O. Ajouter 100 μL dans les puits et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les puits avec le milieu avant d’ensemencer les cellules.</li>
</ol>2. Maintien des CSPi en culture
REMARQUE : Les CSPi ont été achetées dans le commerce. Les CSPi ont été dérivées de fibroblastes humains sains et reprogrammées à l’aide de la technologie épisomique.
<ol><li>À partir du congélateur à -80 °C ou de l’azote liquide, décongeler les CSPi cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C. Nettoyez le flacon contenant les cellules avec de l’éthanol à 70 % avant de le déposer dans l’enceinte de sécurité biologique.</li>
	<li>Ajouter goutte à goutte la suspension cellulaire à 5 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé (p. ex. mTeSR1) goutte à goutte à l’aide d’une pipette de 1000 μL dans un tube conique stérile de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 304 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de milieu de culture cellulaire.</li>
	<li>Plaquer la suspension cellulaire dans deux puits des 6 plaques de puits (105 CSPi par boîte de culture cellulaire à 6 puits), où les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été plaqués précédemment. Semencez des MEF deux jours avant le placage de CSPi à une densité de 2,4 x 104/cm2 dans du DMEM (contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine).</li>
	<li>Après l’ensemencement, compléter le milieu cellulaire avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632.</li>
	<li>Cultiver les CSPi sur MEF pendant les 4-5 premières semaines, puis à l’état sans alimentation (condition sans MEF), en utilisant l’un des revêtements d’intérêt (voir l’étape 1 et le tableau 1) dans mTeSR1.</li>
	<li>Lorsque les CSPi sont confluentes à 70-80%, passage 1:4 en utilisant un traitement EDTA de 0,5 mM pendant 3-5 min à TA. Ajouter 1 mL d’EDTA 0,5 mM pour une plaque à 6 puits (ou des quantités proportionnelles pour les autres types de plaques). Transférer dans de nouveaux puits dans des conditions sans alimentation et incuber à 37 °C, 5% CO2, 20% O2.</li>
	<li>Changez le support avec mTeSR1 frais tous les jours et divisez les cellules tous les 2 jours.</li>
</ol>3. Caractérisation de la confluence cellulaire
<ol><li>Utilisez 96 plaques de puits pour les expériences.</li>
	<li>Ensemencer 10 000 cellules par puits après au moins 1 mois de culture en conditions exemptes de mangeoire afin de s’assurer que les MEF n’ont pas été transmis. Utilisez des lames de comptage jetables pour compter les cellules avec le microscope optique.</li>
	<li>Effectuez les expériences en trois exemplaires. Par conséquent, testez chaque condition d’ensemencement dans trois puits.</li>
	<li>Effectuer l’acquisition automatisée d’images dès le jour 1 suivant l’ensemencement à l’aide d’un cytomètre en mode fond clair. Effectuez une acquisition d’image automatisée toutes les 24 heures pendant 5 jours. Pour obtenir des informations détaillées sur les paramètres expérimentaux, reportez-vous au fichier supplémentaire.</li>
	<li>Utilisez le contraste automatique et l’exposition automatique pour mieux visualiser les cellules.</li>
	<li>Définissez le paramètre d’analyse (voir Fichier supplémentaire) pour l’analyse de confluence afin d’appliquer un masque de 60%, 80% et 100% par puits, afin d’évaluer les changements de focalisation dus à la réfraction de la lumière à la limite des puits. Utilisez les différents paramètres d’analyse de masque mentionnés ci-dessus pour analyser la confluence cellulaire à chaque point temporel.</li>
</ol>4. Analyses statistiques
<ol><li>Déclarez les résultats quantitatifs sous forme de moyennes ±'erreur-type de la moyenne (MEB).</li>
	<li>Pour comparer les différences globales des différentes conditions de revêtement, obtenez des données en utilisant les mêmes échantillons et effectuez le test t de l’échantillon apparié de Student. Les valeurs de p inférieures à 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives, et toutes les valeurs p déclarées sont recto verso.</li>
</ol>5. Caractérisation des microfilaments cytosquelettiques
<ol><li>Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (4% PFA) dans PBS pendant 10 min à TA, suivi de deux lavages dans PBS (10 min au total).</li>
	<li>Ajouter 100 μL de solution de blocage (composée de 5% de BSA, 0,1% de Triton dans PBS) à chaque puits pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Retirer la solution bloquante et laver les échantillons deux fois avec du PBS pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de la solution de travail conjuguée phalloïdine-conjuguée par échantillon et incuber pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Lavez les cellules deux fois avec du PBS (10 min à TA).</li>
	<li>Colorer les noyaux avec Hoechst 33342 dilué 1:10000 dans PBS pendant 10 min à TA.</li>
	<li>Retirez la solution Hoechst et lavez les cellules deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois.</li>
	<li>Laver l’échantillon avec H2O et laisser sécher sous une hotte chimique.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de support de montage (c.-à-d. PBS:glycérol, 1:1) pour couvrir les cellules et préserver la fluorescence des échantillons.</li>
	<li>Observez la cellule à Ex/Em 493/517 nm sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’une source laser à lumière blanche (WLL) et d’un laser à diode de 405 nm. Acquérir des images confocales séquentielles à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile HC PLAPO 40x. Utilisez la même puissance laser, les mêmes séparateurs de faisceau, les mêmes réglages de filtre, les mêmes diamètres de trous d’épingle et le même mode de balayage pour tous les échantillons examinés.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’utilisation des CSPi pour la modélisation des maladies et le dépistage futur des médicaments, ainsi que leur application possible en médecine de précision, en font une technologie d’une grande pertinence et, pour cette raison, nous pensons qu’il est nécessaire de comprendre clairement les conditions de culture in vitro qui ressemblent mieux à la situation physiologique des cellules souches embryonnaires. Dans ce contexte, nous avons testé différents revêtements ECM utilisant des CSPi de type sauvage afin de comprendre ...

Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont obtenues à partir de cellules somatiques et peuvent être différenciées en différents types de cellules. Ils sont souvent utilisés comme système pour modéliser la pathogenèse des maladies ou effectuer le dépistage de médicaments, et offrent également le potentiel d’être utilisés dans le contexte de la médecine personnalisée. Étant donné que les CSPi ont un grand potentiel, il est important de les caractériser pleinement pour les utiliser en tant que système modèle fiable. Nous avons déjà montré l’importance de cultiver des CSPi dans un environnement hypoxique, car ces cellules dépendent de la glycolyse et un environnement aérobie peut provoquer un déséquilibre redox1. Les CSPi sont également vulnérables à d’autres conditions de culture, en particulier l’environnement extracellulaire. L’optimisation des conditions de culture est un enjeu clé pour les maintenir en bonne santé et proliférer. Une culture saine de CSPi conduira à des cellules différenciées saines qui sont généralement le point final du modèle utilisé pour comprendre les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles de troubles humains ou de processus cellulaires spécifiques.
Dans cette étude, un protocole simple a été utilisé pour tester la confluence des CSPi en utilisant différentes conditions de revêtement dans des puits séparés. Les CSPi nécessitent une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires murins (MEF) pour se fixer correctement, mais la coexistence des CSPi et du MEF rend difficile l’analyse comme l’extraction d’ARN ou de protéines puisque deux populations de cellules sont présentes. Afin d’éviter la couche nourricière, différentes protéines appartenant à la matrice extracellulaire (ECM) ont été utilisées pour recréer la niche cellulaire naturelle et pour avoir une culture iPSC sans nourrisseur. En particulier, Matrigel est une préparation solubilisée de membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), qui est enrichie en protéines de la matrice extracellulaire (c.-à-d. laminine, collagène IV, protéoglycanes sulfate d’héparane, entactine/nidogène et facteurs de croissance)2,3. Les autres conditions de revêtement utilisées sont plutôt des protéines purifiées dont la pertinence dans la construction des ECM est connue : la laminine-521 est connue pour être sécrétée par les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans la masse cellulaire interne de l’embryon et c’est l’une des laminines les plus courantes dans le corps après la naissance 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectine est une matrice de culture cellulaire exempte de xéno connue pour soutenir la croissance et la différenciation desCSPh 12,13,14,15,16; La fibronectine est une protéine ECM importante pour le développement des vertébrés et la fixation et le maintien des cellules souches embryonnaires à l’état pluripotent 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Étant donné que différentes conditions de revêtement sont disponibles, nous les comparons en termes d’effet sur la confluence des CSPi.

<table><tbody><tr><td>Pipettes sérologiques à bandes de 10 ml, polystyrène, emballées individuellement dans du papier/plastique,</td> stériles <td>Corning</td><td>4488</td><td>Outil</td></tr><tr><td>15 mL de tubes à centrifuger coniques en polypropylène (PP) haute clarté</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>outil 1x PBS (avec Ca2+ ; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (sans Ca2+ ; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>Medium</td></tr><tr><td>5 mL Stripette Pipettes sérologiques, polystyrène, emballées individuellement dans du papier/plastique,</td> stériles <td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Outil Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, F-Bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Support</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire, 6 puits</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Support</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Epi Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Outil</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>77003</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td></td><td></td><td>Gibco LS25030081 Réactif</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>354277</td><td>Coating</td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>Coating</td></tr><tr><td>MTESR1</td><td>Medium Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td></td></tr><tr><td>Medium MTESR1 Supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td></td><td>15140122 Réactif</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Vitronectine</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Réactif</td></tr></tbody></table>

mesure de la confluence des cspi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Cette étude vise à comprendre comment la croissance des CSPi sur différents substrats de revêtement ECM peut affecter la confluence cellulaire. Un protocole permettant d’évaluer la confluence des CSPi en temps réel a été établi sans qu’il soit nécessaire de compter les cellules en suspension unicellulaire pour éviter toute perturbation de la croissance. Un système d’analyse d’images à haut contenu a été utilisé pour évaluer de manière automatisée la confluence iPCS sur 4 ECM différents au fil du temps. Différents paramètres d’analyse ont été utilisés pour évaluer la confluence cellulaire des CSPi adhérentes et seule une légère différence (à 24 et 48 heures avec la laminine) a été observée si un masque à 60, 80 ou 100% a été appliqué. Nous montrons également que la laminine conduit à la meilleure confluence par rapport à Matrigel, la vitronectine et la fibronectine.

Dans cette étude, nous avons étudié la confluence des CSPi lorsqu’elles sont cultivées dans différentes conditions de revêtement. À l’aide d’un cytomètre, nous avons pu obtenir des résultats facilement informatifs en trois exemplaires en 5 jours. Étant donné que les CSPi se fixent à peine aux récipients en plastique et qu’un revêtement est nécessaire pour favoriser leur prolifération, nous avons décidé de surveiller la confluence des CSPi humaines car elle indique la santé de la culture cellulaire et peut refléter leur p...

L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.

Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Ce protocole est important car il permet une évaluation rapide de la confluence induite de cellules souches pluripotentes sur différents substrats de revêtement de matrice extracellulaire en temps réel. Le principal avantage de ce protocole est qu’il ne nécessite pas le comptage en suspension sur cellule unique, évitant ainsi les perturbations de la croissance des iPSC, qui sont sensibles au passage. Valentina Magliocca, postdoc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour mettre en place des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale, diluez la matrice de membrane basale, fixez un rapport de 1 à 100 dans DMEM et ajoutez 100 microlitres de la solution résultante à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Lorsque tous les puits ont été codés, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure. À la fin de l’incubation, jetez la solution matricielle de la membrane basale et lavez chaque puits deux fois avec 100 microlitres de DMEM frais par puits.Pour mettre en place des plaques recouvertes de laminine, diluez 20 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS avec du calcium et du magnésium, et ajoutez 100 microlitres de la solution de laminine dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, incubez la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de laver les puits deux fois avec du DMEM frais, comme démontré. Pour mettre en place des plaques recouvertes de vitronectine, diluez 10 microgrammes par millilitre de vitronectine dans un tampon de dilution et ajoutez 100 microlitres de tampon à chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits.Après une heure d’incubation à température ambiante, laver les puits avec 100 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium par puits. Pour préparer des plaques recouvertes de fibronectine humaine, diluez 30 microgrammes par millilitre de fibronectine dans de l’eau distillée deux fois et ajoutez 100 microlitres de la solution de fibronectine dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits. Après une incubation de 45 minutes à température ambiante, laver les puits avec du DMEM frais comme démontré.Deux jours avant de mettre en place une culture iPSC, ensemencez des fibroblastes embryonnaires de souris à une densité de 2,4 par 10 à un quart par centimètre carré dans un milieu de culture cellulaire complet dans chacun des deux puits de plaques de culture cellulaire à six puits, et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Pour mettre en place une culture d’iPSC, réchauffez une solution mère d’iPSC cryoconservés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules viennent de décongeler, nettoyez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et placez les cellules dans une enceinte de sécurité biologique.À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez les cellules goutte à goutte dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffé. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans quatre millilitres de milieu de culture cellulaire frais. Ensuite, plaquez 1 par 10 aux cinquièmes cellules dans chacun des deux puits de la souris embryonnaire fibroblastique à six puits.Après l’ensemencement, complétez les cultures cellulaires avec 10 micromolaires de l’inhibiteur de ROCK Y-27632 et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre à cinq semaines. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, traitez chaque culture avec un millilitre d’EDTA de 0,5 millimolaire pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Lorsque les cellules se sont détachées, divisez-les dans un rapport de un à quatre dans un milieu de culture cellulaire frais, et plaquez les cellules dans chacun des quatre puits restants de la plaque à six puits dans des conditions sans chargeur.Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Pour évaluer les effets des différents revêtements sur la confluence cellulaire après au moins un mois de culture dans des conditions sans mangeoire, utilisez des lames de comptage jetables pour compter les cellules de chaque culture à l’aide d’une chambre de comptage. Diluez les cellules à un par 10 à quatre cellules par 200 microlitres de concentration moyenne, et ensemencez les cellules en trois exemplaires dans chacun des trois puits d’une plaque de 96 puits recouverte d’un revêtement par condition.Lorsque toutes les cellules ont été mises en plaques, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain et tous les jours pendant les cinq jours suivants, effectuez une imagerie automatisée des cellules à l’aide des paramètres de contraste automatique et d’exposition automatique pour une visualisation optimale. Pour évaluer les changements de foyer dus à la réfraction de la lumière à la frontière des puits, définissez les paramètres d’analyse sur l’analyse de confluence pour appliquer un masque de 60, 80 ou 100 % par puits, et utilisez les différents paramètres d’analyse de masque pour analyser la confluence cellulaire à chaque point temporel.Pour comparer les différences globales des différentes conditions de codage, utilisez les données de l’échantillon pour effectuer le test T de l’échantillon apparié de l’élève, en rapportant les résultats quantitatifs comme les changements moyens de confluence, plus ou moins l’erreur type de la moyenne. Pour la caractérisation des microfilaments cytosquelettiques, fixez d’abord les cellules avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS par puits pendant 10 minutes à température ambiante, suivis de deux lavages de 10 minutes dans 200 microlitres de PBS par lavage. Transférez la lamelle de protection précédemment placée de la plaque sur la lame de microscope.Ajouter 100 microlitres de sérum bovin à 5 % et de Triton à 0,1 % dans du PBS dans chaque puits pendant une heure à température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique, et laver les échantillons avec deux lavages PBS de 10 minutes comme démontré. Après le deuxième lavage, ajouter 100 microlitres de solution de travail conjuguée à la phalloïdine par échantillon pour une incubation d’une heure à température ambiante, suivie de deux lavages de 10 minutes dans du PBS. Ensuite, colorez les noyaux avec du Hoechst 33342 dilué à une concentration de un à 10 000 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages PBS.Après le deuxième lavage, rincez les cellules à l’eau et laissez sécher les plaques sous une hotte chimique. Une fois que la lamelle en verre a séché, couvrez les cellules avec 100 microlitres d’un support de montage approprié par puits, et localisez les cellules sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’une source laser à lumière blanche et d’un laser à diode de 405 nanomètres aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Sélectionnez ensuite l’objectif d’immersion dans l’huile 63x et acquérez des images confocales séquentielles des cellules.La coloration à la phalloïdine permet de visualiser le degré d’adhésion cellulaire à la surface d’un vaisseau et, en particulier, le revêtement utilisé pour le vaisseau. Les cellules qui adhèrent à un revêtement présentent des microfilaments cytosquelettiques clairement visibles au lieu de microfilaments effondrés. L’imagerie en fond clair permet également d’imager le niveau d’adhérence des iPSC aux surfaces revêtues.Les iPSC ensemencées sur de la laminine présentent un taux élevé de prolifération cellulaire de manière linéaire au fil du temps par rapport à d’autres revêtements. Les cellules ensemencées sur la matrice de la membrane basale, la vitronectine et la fibronectine humaine, en revanche, présentent un taux de prolifération linéaire au cours des 96 premières heures avec une pente accrue de la courbe de confluence au cours des dernières 24 heures, indépendamment du masque utilisé. Comme la différence initiale à 24 heures pour les différents revêtements peut être due à des différences d’attachement cellulaire, la croissance cellulaire peut être normalisée aux données de 24 heures pour les points temporels ultérieurs.Comme observé, il n’existe aucune différence en termes de confluence entre les différents revêtements, ce qui suggère que les différences observées au sein des cultures recouvertes de laminine sont probablement dues à une capacité accrue des iPSC à adhérer à ce revêtement lorsqu’elles sont passées. Cette étude pourrait contribuer à l’élaboration de méthodologies normalisées pour la culture des CSPi et pourrait contribuer à leur utilisation éventuelle future dans les cliniques. Nous étudions actuellement la biologie des principaux récepteurs de surface cellulaire qui interviennent dans les contacts cellule-ECM et qui pourraient être responsables du maintien de leur capacité d’auto-renouvellement.

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