Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

Ce protocole est important car il permet une évaluation rapide de la confluence induite de cellules souches pluripotentes sur différents substrats de revêtement de matrice extracellulaire en temps réel. Le principal avantage de ce protocole est qu’il ne nécessite pas le comptage en suspension sur cellule unique, évitant ainsi les perturbations de la croissance des iPSC, qui sont sensibles au passage. Valentina Magliocca, postdoc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour mettre en place des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale, diluez la matrice de membrane basale, fixez un rapport de 1 à 100 dans DMEM et ajoutez 100 microlitres de la solution résultante à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Lorsque tous les puits ont été codés, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure. À la fin de l’incubation, jetez la solution matricielle de la membrane basale et lavez chaque puits deux fois avec 100 microlitres de DMEM frais par puits.

Pour mettre en place des plaques recouvertes de laminine, diluez 20 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS avec du calcium et du magnésium, et ajoutez 100 microlitres de la solution de laminine dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, incubez la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de laver les puits deux fois avec du DMEM frais, comme démontré. Pour mettre en place des plaques recouvertes de vitronectine, diluez 10 microgrammes par millilitre de vitronectine dans un tampon de dilution et ajoutez 100 microlitres de tampon à chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits.

Après une heure d’incubation à température ambiante, laver les puits avec 100 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium par puits. Pour préparer des plaques recouvertes de fibronectine humaine, diluez 30 microgrammes par millilitre de fibronectine dans de l’eau distillée deux fois et ajoutez 100 microlitres de la solution de fibronectine dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits. Après une incubation de 45 minutes à température ambiante, laver les puits avec du DMEM frais comme démontré.

Deux jours avant de mettre en place une culture iPSC, ensemencez des fibroblastes embryonnaires de souris à une densité de 2,4 par 10 à un quart par centimètre carré dans un milieu de culture cellulaire complet dans chacun des deux puits de plaques de culture cellulaire à six puits, et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Pour mettre en place une culture d’iPSC, réchauffez une solution mère d’iPSC cryoconservés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules viennent de décongeler, nettoyez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et placez les cellules dans une enceinte de sécurité biologique.

À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez les cellules goutte à goutte dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffé. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans quatre millilitres de milieu de culture cellulaire frais. Ensuite, plaquez 1 par 10 aux cinquièmes cellules dans chacun des deux puits de la souris embryonnaire fibroblastique à six puits.

Après l’ensemencement, complétez les cultures cellulaires avec 10 micromolaires de l’inhibiteur de ROCK Y-27632 et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre à cinq semaines. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, traitez chaque culture avec un millilitre d’EDTA de 0,5 millimolaire pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Lorsque les cellules se sont détachées, divisez-les dans un rapport de un à quatre dans un milieu de culture cellulaire frais, et plaquez les cellules dans chacun des quatre puits restants de la plaque à six puits dans des conditions sans chargeur.

Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Pour évaluer les effets des différents revêtements sur la confluence cellulaire après au moins un mois de culture dans des conditions sans mangeoire, utilisez des lames de comptage jetables pour compter les cellules de chaque culture à l’aide d’une chambre de comptage. Diluez les cellules à un par 10 à quatre cellules par 200 microlitres de concentration moyenne, et ensemencez les cellules en trois exemplaires dans chacun des trois puits d’une plaque de 96 puits recouverte d’un revêtement par condition.

Lorsque toutes les cellules ont été mises en plaques, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain et tous les jours pendant les cinq jours suivants, effectuez une imagerie automatisée des cellules à l’aide des paramètres de contraste automatique et d’exposition automatique pour une visualisation optimale. Pour évaluer les changements de foyer dus à la réfraction de la lumière à la frontière des puits, définissez les paramètres d’analyse sur l’analyse de confluence pour appliquer un masque de 60, 80 ou 100 % par puits, et utilisez les différents paramètres d’analyse de masque pour analyser la confluence cellulaire à chaque point temporel.

Pour comparer les différences globales des différentes conditions de codage, utilisez les données de l’échantillon pour effectuer le test T de l’échantillon apparié de l’élève, en rapportant les résultats quantitatifs comme les changements moyens de confluence, plus ou moins l’erreur type de la moyenne. Pour la caractérisation des microfilaments cytosquelettiques, fixez d’abord les cellules avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS par puits pendant 10 minutes à température ambiante, suivis de deux lavages de 10 minutes dans 200 microlitres de PBS par lavage. Transférez la lamelle de protection précédemment placée de la plaque sur la lame de microscope.

Ajouter 100 microlitres de sérum bovin à 5 % et de Triton à 0,1 % dans du PBS dans chaque puits pendant une heure à température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique, et laver les échantillons avec deux lavages PBS de 10 minutes comme démontré. Après le deuxième lavage, ajouter 100 microlitres de solution de travail conjuguée à la phalloïdine par échantillon pour une incubation d’une heure à température ambiante, suivie de deux lavages de 10 minutes dans du PBS. Ensuite, colorez les noyaux avec du Hoechst 33342 dilué à une concentration de un à 10 000 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages PBS.

Après le deuxième lavage, rincez les cellules à l’eau et laissez sécher les plaques sous une hotte chimique. Une fois que la lamelle en verre a séché, couvrez les cellules avec 100 microlitres d’un support de montage approprié par puits, et localisez les cellules sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’une source laser à lumière blanche et d’un laser à diode de 405 nanomètres aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Sélectionnez ensuite l’objectif d’immersion dans l’huile 63x et acquérez des images confocales séquentielles des cellules.

La coloration à la phalloïdine permet de visualiser le degré d’adhésion cellulaire à la surface d’un vaisseau et, en particulier, le revêtement utilisé pour le vaisseau. Les cellules qui adhèrent à un revêtement présentent des microfilaments cytosquelettiques clairement visibles au lieu de microfilaments effondrés. L’imagerie en fond clair permet également d’imager le niveau d’adhérence des iPSC aux surfaces revêtues.

Les iPSC ensemencées sur de la laminine présentent un taux élevé de prolifération cellulaire de manière linéaire au fil du temps par rapport à d’autres revêtements. Les cellules ensemencées sur la matrice de la membrane basale, la vitronectine et la fibronectine humaine, en revanche, présentent un taux de prolifération linéaire au cours des 96 premières heures avec une pente accrue de la courbe de confluence au cours des dernières 24 heures, indépendamment du masque utilisé. Comme la différence initiale à 24 heures pour les différents revêtements peut être due à des différences d’attachement cellulaire, la croissance cellulaire peut être normalisée aux données de 24 heures pour les points temporels ultérieurs.

Comme observé, il n’existe aucune différence en termes de confluence entre les différents revêtements, ce qui suggère que les différences observées au sein des cultures recouvertes de laminine sont probablement dues à une capacité accrue des iPSC à adhérer à ce revêtement lorsqu’elles sont passées. Cette étude pourrait contribuer à l’élaboration de méthodologies normalisées pour la culture des CSPi et pourrait contribuer à leur utilisation éventuelle future dans les cliniques. Nous étudions actuellement la biologie des principaux récepteurs de surface cellulaire qui interviennent dans les contacts cellule-ECM et qui pourraient être responsables du maintien de leur capacité d’auto-renouvellement.