Construction de mutants dans la souche 519/43 de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1

Ce protocole est important car il permet la modification génétique d’un sérotype auparavant non traitable, ce qui permet de rechercher et de comprendre le sérotype. Cela ouvre des voies pour des travaux biologiques tels que le développement de vaccins. Vanessa S.Terra, professeure adjointe à la London School of Hygiene and Tropical Medicine, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, générer le plasmide pSD1 en effectuant une ligature en suivant les instructions du fabricant du pGEM-T Easy System I. Incuber la réaction pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transformez E. coli Dh5-alpha chimiquement compétent avec pSD1, en incubant 50 microlitres de cellules avec trois microlitres de réaction de ligature pSD1 pendant 15 minutes sur de la glace, puis exposez les cellules à un choc thermique et placez les cellules sur de la glace pendant deux minutes.

Retirez les cellules de la glace et ajoutez 350 microlitres de milieu SOC, puis incubez la culture pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 120 tr/min. Placez la transformation sur une gélose Luria-Bertani complétée par 0,4 millimolaire d’IPTG, 0,24 milligramme par millilitre de X-Gal pour la sélection bleu-blanc et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline pour vous assurer que toutes les colonies qui poussent sur la plaque ont le squelette plasmidique. Choisissez trois colonies blanches qui contiennent pSD1 et mettez en place des excroissances pendant la nuit dans 10 millilitres de L-B complétés par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.

Incuber les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant. Le lendemain, centrifugez les cultures à 3 082 G et utilisez la pastille pour l’extraction plasmidique. Après avoir extrait l’ADN plasmidique, mettez en place une digestion de restriction BamH1 pour le plasmide pSD1 et la cassette de spectinomycine.

Incuber la restriction, la digestion, les réactions et les contrôles à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Lorsque la restriction est terminée, analysez les produits par électrophorèse puis excisez la bonne bande et purifiez-la à l’aide d’un kit commercial. Ensuite, exécutez une réaction de ligature en utilisant le pSD1 digéré par BamH1 et la spectinomycine.

Cela générera le plasmide pSD2. Transformer pSD2 en E.coli DH5-alpha chimiquement compétent, comme décrit précédemment. Ensuite, sélectionnez les transformants porteurs du plasmide pSD2 en fonction de leur capacité à se développer dans un LBA complété par 100 microgrammes par millilitre de spectinomycine et d’ampicilline et extrayez l’ADN plasmidique.

Préparez une culture de nuit de S.pneumoniae 519/43 dans BHI et laissez-la croître statiquement à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, diluez les cultures 1:50 et 1:100 dans 10 millilitres de bouillon BHI frais. Incuber la culture de manière statique à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le DO à 595 nanomètres soit compris entre 0,05 et 0,1.

Une fois que la DO appropriée est atteinte, prélevez 860 microlitres de culture et transférez-les dans un tube de microcentrifugation. Ajoutez 100 microlitres d’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires, 10 microlitres de BSA à 20 %, 10 microlitres de chlorure de calcium de 100 millimolaires, deux microlitres de 50 nanogrammes par millilitre de CSP1 et 500 nanogrammes de pSD2. Incuber la réaction statiquement à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, placez 330 microlitres sur des plaques de gélose à 5 % de gélose sanguine complétées par 100 microgrammes par millilitre de spectinomycine toutes les heures pendant une période d’incubation de trois heures. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Placez les colonies résistantes à la spectinomycine sur une autre plaque de gélose au sang complétée par 100 microgrammes par millilitre de spectinomycine et sur des plaques de gélose au sang complétées par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline, ce qui permet de détecter la présence du squelette plasmidique.

Incuber les deux ensembles d’assiettes pendant la nuit. L’assemblage correct de pSD2 a été confirmé par une digestion par restriction. pSD2 a ensuite été utilisé pour transformer 519,43 cellules de type sauvage.

Les colonies cultivées sous spectinomycine après une incubation d’une nuit ont été considérées comme des transformants positifs. La confirmation phénotypique de la mutation de la pneumolysine a été réalisée en évaluant l’activité hémolytique pour D39, 519/43 de type sauvage et 519/43 delta ply mutant. Cela a été comparé à l’hémolyse des globules rouges par 0,5 % de saponine, qui est considérée comme 100 %. Le mutant a perdu sa capacité à lyser les globules rouges.

Toutes les colonies positives ont été confirmées par séquençage pour évaluer l’emplacement de l’insertion. Des amorces avec des sites de liaison en dehors de la région d’homologie ont été utilisées. Lors de l’exécution de la réaction de transformation, il est important d’ajouter les réactifs dans le bon ordre.