Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

L'objectif général de l'expérience de chute est de délivrer des macromolécules sans vecteur aux cellules cibles en utilisant une perturbation mécanique. Cela est réalisé en premier lieu en mettant le type cellulaire cible en suspension avec le matériau de livraison souhaité, puis en chargeant ce mélange dans le réservoir d'un dispositif microfluidique spécialement conçu. Dans un deuxième temps, le dispositif microfluidique est pressurisé et les cellules sont entraînées à travers un réseau de canaux microfluidiques qui compriment les cellules afin de faciliter une perturbation transitoire de la membrane.

Ensuite, les cellules sont laissées en incubation en présence du matériau cible à délivrer afin de faciliter le transport diffusif de ce matériau dans le cytoplasme cellulaire. Pendant que la membrane cellulaire se répare. Les résultats obtenus montrent un délivrance efficace de macromolécules grâce à l'utilisation de la cytométrie en flux.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transfection et la lipofection est qu'elle est capable de cibler des types cellulaires et des matériaux difficiles à transfecter, qui ne peuvent pas être efficacement livrés par d'autres méthodes. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine biologique, comme la manière d'améliorer la reprogrammation cellulaire. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic du cancer, car le système permet de manipuler les cellules immunitaires afin d'améliorer leur efficacité anti-tumorale.

Pour commencer, fabriquez ou achetez le dispositif microfluidique, le support de dispositif, les réservoirs fluides en plastique et les joints toriques illustrés ici et décrits en détail dans le protocole textuel accompagnant, puis remplissez partiellement trois récipients hermétiques avec de l’éthanol à 70 %. Placez les dispositifs dans le premier récipient, les réservoirs et les joints toriques dans le deuxième récipient, et les supports dans le troisième. Ensuite, complétez le remplissage des récipients avec de l’éthanol à 70 %.

Placez ensuite le contenant contenant les réservoirs et les joints toriques, ainsi que celui contenant les supports, dans un bain à ultrasons pendant cinq à dix minutes avant utilisation. Cela permettra d'éliminer toute particule contaminante provenant d'expériences antérieures pendant que les composants sont soumis à l'ultrasonication. Nettoyez l'espace de travail dans une hotte de sécurité biologique avec de l'éthanol à 70 %. Puis, stérilisez tous les matériaux nécessaires, y compris les trois contenants et une paire de pinces, en les essuyant avec de l'éthanol à 70 %, et placez-les à l'intérieur de la hotte de sécurité biologique pour commencer l'assemblage.

Tout d'abord, placer deux à trois lingettes peu pelucheuses dans la zone de travail. Ensuite, retirer les réservoirs en plastique du contenant d'éthanol à l'aide de pinces et les poser sur les lingettes afin de favoriser l'absorption et l'évaporation de l'éthanol sur leur surface interne. Tapoter doucement les réservoirs pour faciliter l'élimination de la solution d'éthanol.

Si nécessaire, utilisez un gaz sous pression pour purger complètement le réservoir. Une fois les réservoirs secs, insérez les joints toriques dans les fentes appropriées des réservoirs. Ensuite, utilisez une pince pour placer la puce face vers le haut dans le support de dispositif.

Veillez à ce que la puce soit bien à plat dans son support et ajustez-la si nécessaire à l’aide de la pince. Si le dispositif ne s’insère pas correctement dans son support, il risque de se briser lors des étapes suivantes. Ensuite, placez délicatement les réservoirs sur le support et alignez-les avec les clips.

Veillez à ce que les joints toriques ne sortent pas de leurs emplacements. Pendant cette opération, appuyez doucement sur les réservoirs jusqu'à ce qu'ils s'encliquettent en place. Assurez-vous que les deux côtés des réservoirs sont bien fixés et que la puce semble être correctement positionnée.

Ne pas appuyer sur les réservoirs avec une force excessive, car la pression pourrait endommager les puces destinées aux cellules primaires ou adhérentes. Pour les lignées cellulaires, placer les cellules un à deux jours avant l'expérience afin qu'elles atteignent au maximum une confluence de 80 %.

Le jour de l'expérience, récoltez les cellules immédiatement avant l'expérience et resuspendez-les dans un milieu ou un tampon approprié à une concentration comprise entre un et dix millions de cellules par millilitre. Passez ensuite soigneusement la suspension cellulaire à travers une maille de tamis cellulaire de 40 microns afin d'éviter que des agrégats de cellules ou de matrice n'obstruent le dispositif.

Une fois filtré, mélanger 300 microlitres de la suspension cellulaire avec la concentration souhaitée de matériau de livraison dans un tube séparé. Pour cette démonstration, deux microlitres de dextrine à cinq milligrammes par millilitre et deux microlitres d'anticorps contrôle isotopique Alexa. 4 88 sont ajoutés pour chaque 50 microlitres de suspension cellulaire.

Ensuite, mélangez délicatement 100 microlitres des cellules à l’aide d’une pipette. Puis, à l’aide de pointes de chargement pour gel, transférez les cellules et le matériau de livraison dans l’un des réservoirs, fixez un tube de pression au réservoir rempli et serrez le nœud avec le doigt pour assurer un bon scellement. Réglez ensuite la pression d’air à 70 PSI sur le régulateur afin de contrôler la vitesse à laquelle les cellules traversent le dispositif.

La pression doit être optimisée en fonction de la combinaison spécifique de cellules et de puce microfluidique utilisée pour chaque expérience. Une fois tous les préparatifs terminés, élevez l'appareil à hauteur des yeux et orientez-le de manière à ce que le liquide dans le réservoir soit facilement visible. Ensuite, appuyez sur le bouton-poussoir pour pressuriser le réservoir et amorcer l'écoulement des cellules.

Surveillez la vitesse à laquelle le fluide s'écoule du réservoir. Si le débit du fluide ralentit considérablement par rapport à sa vitesse initiale, le dispositif monté est probablement obstrué et doit être remplacé. Le cisaillement accru causé par l'obstruction entraînera une mortalité cellulaire supérieure à la normale.

Lorsque le niveau du liquide se situe à environ deux millimètres du fond du réservoir, tournez rapidement le régulateur sur zéro PSI pour arrêter l'écoulement. Il est important d'arrêter l'écoulement d'air avant que le réservoir ne soit vidé, sinon l'échantillon pourrait être éjecté du réservoir de collecte. Ensuite, récupérez les cellules traitées à partir du réservoir de sortie et placez-les dans un tube de microcentrifugeuse.

À température ambiante, les cellules marquées continueront d'absorber le matériau pendant jusqu'à 10 minutes. Après 10 minutes, mettez les cellules en culture avec du milieu supplémentaire ou utilisez-les directement selon les besoins expérimentaux. Répétez ces étapes pour recueillir autant de cellules traitées que nécessaire, et remplacez les puces au besoin si elles se bouchent, en éliminant les dispositifs C bouchés pour chaque échantillon ultérieur.

Changer le sens d'écoulement afin de minimiser les effets de colmatage. Une fois la collecte des cellules terminée, déconnecter délicatement les réservoirs du support principal en écartant les bras de la pince. Ensuite, placer chaque pièce devant être réutilisée dans le contenant de stockage approprié et les remplir avec de l'éthanol à 70 % frais.

Enfin, placer toutes les puces utilisées dans un contenant séparé pour un élimination appropriée. L'efficacité de livraison et la viabilité cellulaire des cellules HeLa ont été mesurées. Après une série d'expériences, trois puces microfluidiques différentes ont été testées à une gamme de vitesses allant jusqu'à 600 millimètres par seconde.

Ces tests ont montré que des vitesses d'écoulement plus élevées amélioraient la délivrance de dextrine marquée par un fluorochrome de trois kilodaltons dans les cellules pour chacune des puces testées. De plus, des vitesses accrues provoquaient également une baisse de la viabilité cellulaire d'environ 20 % dans les dispositifs testés. Ce niveau de mort cellulaire est relativement faible et est souvent nettement plus élevé dans des dispositifs mal conçus.

L'absorption de la dextrine conjuguée au bleu Pacifique par la population de cellules témoins représentée à gauche résulte d'effets limités de liaison à la surface et d'endocytose. Comme les cellules sont exposées au matériau de livraison pendant la même durée que les cellules traitées. À droite se trouve la population de cellules vivantes qui traversent le dispositif microfluidique tout en étant exposées à la même concentration de dextrine que les cellules témoins.

Les cellules situées dans la zone ombrée sont considérées comme non livrées, et celles situées à droite de la ligne sont définies comme livrées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'analyse post-ophtalmologique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'efficacité du livrage et la fonctionnalité du matériel, après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la programmation cellulaire dans les cellules primaires adultes à l'aide d'une livraison directe de protéines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place et d'utiliser le système auto-comprimant pour votre application souhaitée.