Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

L’objectif global de l’expérience de chute est de fournir des macromolécules sans vecteur aux cellules cibles en utilisant une perturbation mécanique. Pour ce faire, il suffit d’abord de placer le type de cellule cible en suspension avec le matériau de livraison souhaité et de le charger dans le réservoir d’un dispositif microfluidique spécialement conçu. Dans un deuxième temps, le dispositif microfluidique est pressurisé et les cellules sont entraînées à travers un réseau de canaux microfluidiques qui compriment les cellules pour faciliter la perturbation membranaire transitoire.

Ensuite, les cellules sont laissées incuber en présence du matériel de livraison cible pour faciliter le transport diffusif du matériel dans le cytoplasme cellulaire. Pendant que la membrane cellulaire est réparée. On obtient des résultats qui montrent une administration efficace des macromolécules grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’ation et la lipoperfection est qu’elle est capable de traiter des types de cellules et des matériaux difficiles qui ne peuvent pas être efficacement délivrés par d’autres méthodes. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine biologique, telles que l’amélioration de la reprogrammation cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie et au diagnostic du cancer, car le système permet de manipuler les cellules immunitaires pour améliorer leur efficacité antitumorale.

Pour commencer, fabriquez ou achetez le dispositif microfluidique, le support de dispositif, les réservoirs de fluide en plastique et les joints toriques illustrés ici et répertoriés avec des détails dans le protocole de texte d’accompagnement, puis remplissez partiellement trois récipients refermables avec de l’éthanol à 70 %. Placez les appareils dans le premier récipient, les réservoirs et les joints toriques dans le deuxième récipient et les supports dans le troisième. Remplissez ensuite les récipients avec 70 % d’éthanol.

Placez ensuite, le récipient contenant les réservoirs et les joints toriques ainsi que celui contenant les supports dans un bain à ultrasons pendant cinq à 10 minutes avant utilisation. Cela aidera à éliminer toutes les particules contaminantes des expériences précédentes pendant que le composant sonicate essuie l’espace de travail dans une enceinte de biosécurité avec 70 % d’éthanol. Ensuite, stérilisez tout le matériel requis, y compris les trois récipients et une pince à épiler, en les essuyant avec de l’éthanol à 70 % et placez-les à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité pour commencer l’assemblage.

Tout d’abord, déposez deux à trois lingettes à faible peluche dans la zone de travail. Retirez ensuite les réservoirs en plastique du récipient d’éthanol à l’aide d’une pince à épiler et placez-les sur les lingettes pour faciliter l’évacuation de l’humidité et l’évaporation de l’éthanol de sa surface intérieure. Tapotez doucement les réservoirs pour aider à éliminer la solution d’éthanol.

Si nécessaire, utilisez du gaz sous pression pour purger complètement le réservoir. Une fois les réservoirs secs, insérez les joints toriques dans les fentes appropriées sur les réservoirs. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, placez la puce face vers le haut dans le support de l’appareil.

Assurez-vous que la puce est à plat dans le support et ajustez-la si nécessaire à l’aide de la pince à épiler. Si l’appareil ne s’insère pas correctement dans son support, il y a un risque qu’il se casse au cours des étapes suivantes. Ensuite, placez délicatement les réservoirs sur le support et alignez-les avec les clips.

Assurez-vous que les joints toriques ne tombent pas hors de leurs fentes. Au cours de ce processus, appuyez doucement sur les réservoirs jusqu’à ce qu’ils s’enclenchent. Assurez-vous que les deux côtés des réservoirs sont bien fixés et que la puce semble être dans la bonne position.

N’appuyez pas sur les réservoirs avec une force excessive. Comme la pression pourrait casser les copeaux pour la primaire ou l’adhérence. Lignées cellulaires, placez les cellules un à deux jours avant l’expérience afin qu’elles ne soient pas confluentes à plus de 80 %.

Le jour de l’expérience. Immédiatement avant l’expérience, récoltez les cellules et mettez-les en suspension dans un milieu ou un autre tampon souhaité entre un et 10 millions de cellules par millilitre. Ensuite, passez soigneusement la suspension cellulaire à travers un treillis de crépine de 40 microns pour éviter que des amas de cellules et de matrice n’obstruent l’appareil.

Une fois filtré, mélangez 300 microlitres de suspension cellulaire avec la concentration souhaitée de matériau de distribution dans un tube séparé. Pour cette démonstration, deux microlitres de dextrine à cinq milligrammes par millilitre et deux microlitres d’Alexa. 4 anticorps anti-isotopes de 88 sont ajoutés par 50 microlitres de suspension cellulaire.

Ensuite, mélangez doucement 100 microlitres de cellules par pipetage. Ensuite, à l’aide d’embouts de chargement de gel, pipetez les cellules et le matériel d’administration dans l’un des réservoirs, fixez le tube de pression au réservoir rempli et serrez le nœud à la main pour assurer un plafond approprié. Ajustez ensuite la pression d’air à 70 PSI sur le régulateur pour contrôler la vitesse à laquelle les cellules se déplacent dans l’appareil.

La pression doit être optimisée pour la combinaison spécifique de cellules et de puces microfluidiques utilisée dans chaque expérience. Une fois que tout est prêt, soulevez l’appareil au niveau des yeux et orientez-le de manière à ce que le liquide dans le réservoir soit facilement visible. Appuyez ensuite sur la valve à bouton-poussoir pour pressuriser le réservoir et commencer l’écoulement de la cellule.

Surveillez la vitesse à laquelle le fluide s’écoule du réservoir. Si le fluide ralentit considérablement par rapport à son débit initial, l’appareil monté est probablement bouché et doit être remplacé. L’augmentation du cisaillement causée par le blocage provoquera une mort cellulaire supérieure à la normale.

Lorsque le niveau de liquide est à environ deux millimètres du fond du réservoir, tournez rapidement le régulateur à zéro PSI pour arrêter le débit. Il est important d’arrêter le flux d’air avant que le réservoir ne soit vidé, sinon l’échantillon peut être éjecté du réservoir de collecte. Ensuite, récupérez les cellules traitées dans le réservoir d’évacuation et placez-les dans un microtube de centrifugation.

À température ambiante, les cellules nominales continueront à absorber le matériau jusqu’à 10 minutes. Après 10 minutes, plaquez les cellules avec des milieux supplémentaires ou continuez à utiliser les cellules selon les besoins expérimentaux. Répétez ces étapes pour collecter autant de cellules traitées que nécessaire et remplacez les puces si nécessaire si elles obstruent et jetez les dispositifs obstrués C pour chaque échantillon suivant.

Modifiez le sens d’écoulement pour minimiser les effets de colmatage. Une fois les cellules de collecte terminées, débranchez doucement les réservoirs du support principal en écartant les bras du clip. Placez ensuite chaque pièce à réutiliser dans le récipient de stockage approprié et remplissez-les d’éthanol frais à 70 %.

Enfin, placez tous les copeaux utilisés dans un récipient séparé pour une élimination appropriée. L’efficacité de l’administration et la viabilité cellulaire des cellules hela ont été mesurées. À la suite d’une série d’expériences, trois puces microfluidiques différentes ont été testées dans une gamme de vitesses allant jusqu’à 600 millimètres par seconde.

Ces tests ont montré que l’augmentation de la vitesse d’écoulement améliorait l’administration de dextrine de trois kilodaltons conjuguée par fluorescence dans les cellules de chacune des puces testées. De plus, l’augmentation des vitesses a également entraîné une baisse de la viabilité des cellules d’environ 20 % dans les appareils testés. Cette quantité de mort cellulaire est relativement faible et est souvent beaucoup plus élevée dans les dispositifs mal conçus.

L’absorption de la dextrine conjuguée au bleu du Pacifique dans la population de cellules témoins illustrée à gauche est le résultat d’une liaison de surface limitée et d’effets endocytaires. Comme les cellules sont exposées au matériau d’administration pendant la même durée que les cellules traitées. À droite, la population de cellules vivantes qui passent à travers le dispositif microfluidique tout en étant exposées à la même concentration de dextrine que les cellules de contrôle.

Les cellules de la région ombrée sont considérées comme non remises, et les cellules à droite de la ligne sont définies comme remises. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est exécutée correctement. Après cette procédure, d’autres méthodes, la vie post-optométrie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’efficacité de l’administration et la fonctionnalité du matériau après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la programmation cellulaire dans les cellules primaires adultes en utilisant l’administration directe de protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration et de l’utilisation du système d’auto-compression pour l’application souhaitée.