Capture de composés organiques volatils microbiens produits activement à partir d’échantillons associés à l’homme avec extraction par sorbant assistée par vide

Ce protocole décrit l’extraction de composés organiques volatils à partir d’un échantillon biologique avec la méthode d’extraction par sorbant assistée par vide, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l’aide du rail de préparation d’échantillon Entech et l’analyse des données. Il décrit également la culture d’échantillons biologiques et le sondage d’isotopes stables.

Ce protocole nous permet de concentrer et d’identifier facilement les métabolites volatils et les volatiles produits activement à partir d’organismes microbiens dans une variété d’échantillons biologiques. VASE est une méthode plus conviviale de concentration des volatiles de faible abondance. Tout ce dont vous avez besoin est un échantillon sous vide proche, et laissez la physique faire le reste.

L’accès à l’analyse volatile d’échantillons cliniques a des implications importantes pour la découverte de biomarqueurs métaboliques dans un certain nombre d’états pathologiques différents. Par exemple, la conduite et l’infection de l’agent pathogène ou le succès du traitement antibactérien pourraient être détectés avec une analyse volatile d’échantillons de salive, d’expectorations ou d’haleine. Pour préparer des échantillons fécaux, ajoutez un millilitre d’eau désionisée à 100 milligrammes de matières fécales dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et un vortex pendant trois minutes.

Conservez les échantillons sur la glace lorsqu’ils ne sont pas utilisés. Ajouter 485 millilitres de milieu BHI avec du glucose 13C de 20 millimolaires ou du BHI avec 30% de deutérium à 15 microlitres de mélange de matières fécales et d’eau, en veillant à ce que le volume final de l’échantillon soit de 500 microlitres. Préparer des échantillons en trois exemplaires techniques.

Pour préparer des échantillons d’eaux usées, ajoutez 500 microlitres d’eaux usées à 500 microlitres de milieu BHI avec du glucose 13C ou 30% de deutérium pour un volume total d’un millilitre. Préparez les échantillons en trois exemplaires et conservez-les sur la glace. Pour préparer des échantillons de salive, ajoutez 50 microlitres de salive à 500 microlitres de milieu BHI avec du glucose 13C ou 30% de deutérium pour un volume total de 550 microlitres.

Préparez les échantillons en trois exemplaires et conservez-les sur la glace. Pour préparer des échantillons d’expectorations, ajoutez 15 microlitres d’expectorations dans un flacon. Préparez les échantillons en trois exemplaires et conservez-les sur la glace.

Placez les flacons VOA vides sur la plaque froide et placez la plaque froide sur de la glace dans la hotte de biosécurité. Allumez le SPEU 5600 et ajustez-le à la température requise. Étiquetez les flacons VOA de 20 millilitres en fonction des échantillons, des répliques et des ID HSP à l’aide d’un marqueur résistant à l’eau qui résiste à l’eau au cas où de la condensation se formerait à l’extérieur du flacon sur la glace.

À l’intérieur de la hotte de biosécurité, dévissez le capuchon blanc du flacon, pipetez rapidement l’échantillon dans le flacon et assemblez la doublure du couvercle, le capuchon noir et le HSP. Replacez le flacon contenant l’échantillon et le HSP sur la plaque froide. Une fois que tous les échantillons ont été préparés dans les flacons en verre, allumez la pompe à vide, placez les flacons sous vide et retirez la source de vide.

Vérifiez la pression après avoir placé tous les échantillons sous vide à l’aide du manomètre. Si un flacon fuit, assurez-vous que le bouchon est bien vissé et que les joints toriques blancs du HSP et des doublures de couvercle sont correctement en place. Placez les flacons dans le SPEU pour optimiser le temps et la température avec agitation à 200 RPM.

Extrayez des cultures pendant une heure à 70 degrés Celsius et extrayez des expériences de sondage d’isotypes stables avec des échantillons de matières fécales, d’eaux usées, de salive et d’expectorations pendant 18 heures à 37 degrés Celsius. Placez la plaque froide à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation après la fin de la période d’extraction. Lorsque l’extraction est terminée, placez les échantillons sur la plaque froide pendant 15 minutes pour extraire la vapeur d’eau du HSP et de l’espace de tête du flacon, puis transférez les HSP dans leurs manchons.

Configurez la séquence d’échantillons sur le logiciel Entech. Ouvrez le programme et sélectionnez 5800 et Séquence dans les options à droite du menu déroulant Instrument. Enregistrez la table de séquences, sélectionnez Exécuter sur le côté gauche, puis Démarrer avec vide dans Desorber si le HSP vide n’est pas le désorbeur.

Notez que les HSP seront gérés par le SPR pour chaque échantillon de la séquence. Laissez le SPR s’échauffer. Autorisez le SPR à exécuter tous les échantillons automatiquement.

La séquence du côté GC-MS enregistrera automatiquement les données dans des fichiers séparés. Ajoutez un pic à la méthode de traitement en sélectionnant Calibrer, puis Modifier le composé, Nom et Insérer un composé sous Composé standard externe. Ajoutez le nom des composés, le temps de rétention et l’ion cible du signal quantitatif.

Ajoutez les trois plus grands pics, qui comprennent des composés avec une probabilité supérieure à 75%, en veillant à ce que l’alignement de chaque ion d’identification du composé se trouve au centre du pic. Enregistrez-le en sélectionnant OK, puis Méthode et Enregistrer. Une fois la méthode de processus configurée, passez à Quantitate and Calculate, puis View et QEDIT Quant Result pour quantifier les données.

Ici, l’extraction par sorbant assistée par le vide a été suivie d’une désorption thermique sur un GC-MS pour étudier les profils volatils des monocultures et co-cultures bactériennes et identifier les volatiles produits activement avec des échantillons d’isotopes stables provenant d’échantillons d’excréments humains, de salive, d’eaux usées et d’expectorations. Les monocultures et co-cultures étaient constituées des espèces bactériennes staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa et acinetobacter baumannii. 43 molécules volatiles annotées ont été détectées à partir des monocultures et co-cultures à des points de temps de 24 et 48 heures.

Il y avait plus d’incorporation de 13C dans des molécules volatiles entièrement marquées par rapport au deutérium. Le 13C a été incorporé dans le 2-butanone, le 3-hydroxy, le 2, 3-butanedione diacétyle, l’acide acétique et le phénol pour tous les échantillons de matières fécales, d’eaux usées et de salive. L’acétone, l’acide butanoïque et l’acide propanoïque ont été détectés comme marqués dans la salive et les eaux usées.

tandis que le trisulfure de diméthyle et le disulfure de diméthyle ont été enrichis dans des échantillons de matières fécales et de salive. Les volatiles 1-propanol, 2-butanone, benzophénone, éthanol et acétate de méthylthiol ont été enrichis uniquement dans les eaux usées et 2,3-pentanedione dans la salive. Le deutérium a été incorporé dans les acides acétique volatils, le benzaldéhyde, le trisulfure de 4-méthyl-diméthyle et le phénol provenant d’échantillons de salive ou d’eaux usées.

L’acide acétique, le trisulfure de diméthyle, l’acétone et le propanol 2-méthyl étaient plus abondants dans les échantillons d’expectorations cultivées que les échantillons d’expectorations non cultivés. Une analyse multivariée permutée des variantes, un PERMANOVA, a été effectuée sur une matrice de distance de Bray-Curtis des abondances volatiles des échantillons d’expectorations de fibrose kystique. Nous avons constaté que le sujet qui a donné l’échantillon explique 51% de la variation des expectorations cultivées marquées au 13C et 33% de la variation des expectorations non cultivées.

Ici, le succès du marquage isotopique stable avec du glucose 13C dans les volatiles à partir d’échantillons d’expectorations cultivées prélevés sur sept personnes atteintes de mucoviscidose est montré. Les substances volatiles qui ont une incorporation plus élevée de 13C pour la majorité des échantillons sont montrées dans le panel 5A, celles avec une incorporation de 13C plus faible dans la majorité des échantillons d’expectorations sont dans le panel 5B, et les molécules avec une conversion de 13C plus faible dans une minorité des échantillons d’expectorations sont montrées dans le panel 5C. Vérifiez toujours la pression de votre flacon après environ une minute.

Un vide cassé va à l’encontre de la sensibilité et de la vitesse de la méthode VASE. À la suite de cette procédure, si un sondage isotopique stable a été effectué, l’ADN peut être extrait du matériel restant pour identifier les organismes microbiens ou les espèces qui pourraient avoir contribué à la production des molécules volatiles. Cette méthode est également utile pour détecter les substances volatiles de n’importe quel type d’échantillon sans sondage isotopique.

Avec des avantages de sensibilité et de faible volume d’échantillons, de nombreuses applications peuvent bénéficier de cette technique.