Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Ce protocole est important car il fournit une méthode de micro-injection spécifique pour un Anopheles gambiae, qui a été historiquement difficile à transformer en utilisant des techniques de génie génétique courantes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée de manière fiable des anophèles gambiens transgéniques. Les applications de cette technique s’étendent à de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme en facilitant la création de moustiques adaptés à la suppression ou à la modification des populations d’Anopheles gambiae de type sauvage.

Cette méthodologie peut être facilement adaptée à différentes espèces de moustiques. Notre technologie de micro-injection demande de la patience et de la pratique. Il y a une courbe d’apprentissage.

Pour commencer, utilisez un aspirateur pour placer 20 à 30 femelles dans un tube conique transparent de 50 millilitres. Assurez-vous que le tube est ouvert aux deux extrémités et recouvert d’un film dentaire en latex à une extrémité et d’un filet de nylon et de papier filtre à l’autre, où les moustiques pondront leurs œufs. Placez le tube rempli de moustiques dans une petite boîte de Pétri remplie d’eau double distillée, puis placez le tube et la boîte dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Retirez le tube de l’incubateur et insérez-le dans une cage vide. Tapotez doucement le tube pour permettre aux moustiques de s’envoler. Retirez le tube de la cage une fois que tous les moustiques se sont envolés.

Lorsque le tube est exempt de moustiques, dévissez l’anneau inférieur, retirez le nylon et utilisez une pince pour retirer soigneusement le papier filtre avec les œufs du tube. Placez le papier filtre chargé d’œufs dans une boîte de Petri en plastique contenant une couche de papier filtre humidifiée avec de l’eau. Placez une membrane sur une lame de verre propre et utilisez des pinces propres pour recouvrir la membrane d’un morceau de papier filtre, laissant environ un millimètre du filtre à membrane découvert.

Mouillez le papier filtre avec de l’eau désionisée, puis utilisez la brosse pour transférer doucement 30 à 50 embryons sur le bord de la membrane et aligner les œufs verticalement le long de la membrane. Orientez les œufs dans la même direction de sorte que lorsque les œufs sont observés au microscope à microinjection, l’extrémité postérieure est en position descendante et forme un angle de 15 degrés avec l’aiguille. Tapisser tout le bord de la membrane avec des œufs.

Utilisez une pointe de microchargeur pour remplir les aiguilles avec deux microlitres de mélange d’ADN. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez le tube de pompe à pression automatisé. Alignez l’aiguille de manière à ce qu’elle fasse un angle de 15 degrés avec le plan de la diapositive.

Ouvrez la pointe de l’aiguille en touchant soigneusement le premier œuf, puis insérez la pointe de l’aiguille à environ 10 micromètres dans le pôle postérieur. Une injection réussie entraînera un petit mouvement du cytoplasme dans l’œuf. Utilisez les commandes de l’étape coaxiale du microscope pour passer à l’œuf suivant afin de poursuivre l’injection.

Pour vous assurer que la pointe de l’aiguille reste ouverte et n’a pas été bouchée, appuyez sur le bouton Injecter avant d’entrer dans un autre embryon et visualisez la petite gouttelette à l’ouverture de l’aiguille. Si l’aiguille est bouchée, appuyez sur le bouton Effacer pour effacer l’aiguille et répétez le test de visualisation des gouttelettes. Ajustez la pression au besoin si l’ouverture de la pointe de l’aiguille devient légèrement plus grande pour vous assurer que la taille des gouttelettes reste petite.

Injecter environ 40 à 50 œufs avec une aiguille. Une fois les injections terminées, rincez les œufs dans un récipient en verre tapissé de papier filtre et rempli de 50 millilitres d’eau désionisée. En utilisant ce protocole, un système autonome piloté par des gènes a été inséré dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire G3 d’Anopheles gambiae.

Le système a été conçu pour cibler l’orthologue cardinal, ou Agcd, sur le troisième chromosome de cette espèce. Le plasmide pCO37 est montré. Il contient Streptococcus pyogenes Cas9 endonucléase sous contrôle des éléments régulateurs de l’orthologue du gène nanos.

De plus, il dispose d’un ARN guide sous le contrôle d’un promoteur du gène U6 et de la cassette de marqueur dominant CFP 3XP3 exprimant la protéine fluorescente cyan. Les approches moléculaires ont vérifié l’insertion précise d’environ 10 kilos de paires de bases d’ADN, qui a été désigné comme AgNosCd-1. Des analyses de suivi approfondies ont montré que l’AgNosCd-1 était très efficace à l’entraînement, créait peu d’allèles résistants et n’avait pas de charge génétique majeure en raison de l’intégration et de l’expression du système de forçage génétique.

Le forçage génétique homozygote contenant des moustiques était des mutants en perte de fonction, les larves, les nymphes et les adultes nouvellement apparus ayant un phénotype des yeux rouges. Lorsque vous essayez ce protocole, il est crucial de rester à 88 pour une bonne éclosion aux œufs gris clair et éviter les œufs blancs.