Intégration de transgènes dirigée par phiC31-Integrase : une technique de micro-injection pour l’intégration de transgènes spécifiques à un site dans un vecteur d’anophèles

phiC31 integrase est une enzyme recombinase dérivée d’un phage qui catalyse la recombinaison spécifique d’un transgène, un gène étranger, dans le génome de l’hôte. Pour l’intégration du transgène dans un hôte d’anophèle, commencez par un embryon d’anophèle dans un tampon approprié.

Le génome de l’anophèle est pré-conçu avec un site d’attache pour l’intégration des gènes et un marqueur cyan-fluorescent pour la sélection visuelle. Ensuite, ajoutez un petit volume de plasmide donneur transportant la cargaison de transgène souhaitée, un site de fixation, un marqueur fluorescent rouge et des composants du squelette plasmidique dans un flacon. Ensuite, ajoutez un volume optimal d’un plasmide auxiliaire portant une intégrase codant pour le gène. Maintenant, chargez le mélange plasmidique dans une microseringue.

Injectez doucement les plasmides dans le pôle postérieur de l’embryon, le site d’origine des cellules germinales, ce qui entraîne un léger mouvement du cytoplasme. Une fois à l’intérieur de l’embryon, le plasmide auxiliaire commence à synthétiser les enzymes intégrases.

L’enzyme intégrase médie la recombinaison spécifique du site entre le plasmide donneur et le génome de l’hôte. Ainsi, le transgène et le marqueur fluorescent rouge du plasmide donneur s’intègrent dans les sites d’attachement recombinants du génome de l’anophèle. Par la suite, incuber l’embryon injecté dans des conditions physiologiques d’éclosion, avec un tourbillon intermittent.

En quelques jours, l’embryon éclot en une larve. Sous un microscope à fluorescence, la larve d’anophèle avec des gènes intégrés avec succès exprime à la fois une fluorescence cyan, marquant le génome de l’hôte, et une fluorescence rouge, marquant le transgène du plasmide donneur.

Purifiez les plasmides du donneur et de l’aide à l’aide d’un kit de purification sans endotoxines. Combinez le plasmide donneur marqué attB portant le transgène d’intérêt, et le plasmide auxiliaire portant l’intégrase, pour obtenir un mélange avec une concentration finale de 350 nanogrammes par microlitre du plasmide donneur, et de 150 nanogrammes par microlitre du plasmide auxiliaire.

Précipitez l’ADN en ajoutant 0,1 volume d’acétate de sodium 3 molaires, dans 2,5 volumes d’éthanol 100 % glacé. Puis, vortex. Un précipité blanc doit être immédiatement visible. Lavez la pastille et mettez-la en suspension dans le tampon d’injection, pour atteindre une concentration finale totale de 500 nanogrammes par microlitre. Ensuite, préparez des aliquotes de 10 à 15 microlitres chacune, et conservez-les à moins 20 degrés Celsius.

Nourrissez par le sang des moustiques âgés de 4 à 7 jours à partir de la ligne d’amarrage souhaitée, et leurs homologues de type sauvage, 72 heures avant la microinjection. Effectuez des micro-injections d’embryons d’Anopheles gambiae, dans du chlorure de sodium de 25 millimolaires, en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 45 degrés.

Effectuez des micro-injections d’embryons d’Anopheles stephensi, dans de l’huile d’halocarbure, en ciblant le pôle postérieur à un angle de 30 degrés. Immédiatement après l’injection, transférez les œufs dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée stérile et remettez-les dans des conditions insectivores. À l’éclosion, transférez quotidiennement les larves G₀ dans un plateau avec de l’eau distillée salée, et faites-les revenir aux nymphes.