Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Les microbes associés à l’hôte constituent cet écosystème très complexe qui nécessite vraiment une imagerie pour être compris. Et à travers cette particule, nous allons vous montrer comment passer par le processus de coloration et obtenir une visualisation de l’interface du microbiome hôte. Comprendre la biologie des bactéries associées à l’hôte nécessite de comprendre leur localisation dans des micro-environnements.

Et cette technique nous permettra de visualiser des taxons individuels dans des environnements hôtes, ainsi que dans le contexte d’autres bactéries. Grâce à cette technique, il sera possible de déterminer quelles bactéries peuvent avoir pénétré à travers le tissu hôte, ainsi que de déterminer si des caractéristiques clés telles que le mucus hôte peuvent être épuisées. Préparer du méthacarn frais dans un récipient compatible avec 60% de méthanol absolu, 30% de chloroforme et 10% d’acide acétique glacial.

À l’aide d’outils pointus et propres, coupez les segments intestinaux des souris pour l’imagerie. Minimisez autant que possible le dérangement de l’échantillon et manipulez les sections par leurs crêtes pour éviter d’affecter la zone d’imagerie. Fixez l’échantillon dès que possible après la dissection pour éviter toute dégradation.

Placez les sections intestinales dans des cassettes d’histologie en tenant délicatement un bord du tissu avec une pince à épiler. Fermez la cassette et immergez-la complètement dans une solution de méthacarn fraîche, en veillant à ce que la solution ne soit pas plus vieille que quelques heures après l’immersion des cassettes. Pour les échantillons cliniques qui seront prélevés dans une suite clinique sans accès à une hotte aspirante, utilisez un récipient de stockage en polyéthylène avec un rabat coupé dans le couvercle qui permettra le passage des cassettes histologiques.

Scotchez ce rabat fermé lorsqu’il ne passe pas les échantillons pour empêcher l’échappement des fumées toxiques. Placez la paraffine dans un récipient résistant à la chaleur et faites fondre dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Lavez le tissu en versant le liquide dans le récipient à déchets approprié et en l’incubant séquentiellement dans du méthanol absolu, de l’éthanol absolu et du xylène comme décrit dans le manuscrit du texte.

Ouvrez légèrement les cassettes pour permettre à la paraffine d’entrer sans perdre les segments de tissu à l’aide de gants doubles ou d’une pince à épiler. Immergez et fermez les cassettes dans le récipient de paraffine fondue. Replacez le récipient dans le four à 60 degrés Celsius, en vous assurant que les cassettes sont remplies de paraffine et qu’il ne reste pas de grosses bulles d’air.

Après une incubation de deux heures, retirez le récipient du four. À l’aide de pinces, retirez soigneusement les cassettes. Chauffer le four à 60 degrés Celsius et préchauffer un pot Coplin.

Ajouter suffisamment de volume de xylène dans une bouteille en verre pour couvrir les lames de verre dans le pot deux fois et placer le parafilm autour du couvercle pour empêcher l’évaporation des xylènes. Laissez la température des xylènes atteindre 60 degrés Celsius. Préparez la solution d’hybridation FISH comme mentionné dans le manuscrit textuel.

Placez les lames dans le pot Coplin, en vous assurant que les sections ne sont pas entrées en contact avec d’autres lames ou le pot et faites cuire les lames à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans la hotte, remplissez le pot Coplin avec des xylènes préavertis du four, en prenant soin de ne pas verser directement sur les échantillons et potentiellement déloger les tissus. Replacez le pot Coplin dans le four à 60 degrés.

Versez les xylènes usagés dans un récipient à déchets approprié, en prenant soin de ne pas déranger les sections de tissu sur les lames en verre et en utilisant une paire de pinces pour empêcher les lames de tomber du pot Coplin. Reconstituez le pot Coplin avec les xylènes restants et incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans la hotte. Incuber les sections dans de l’éthanol à 99,5 % pendant cinq minutes à température ambiante.

Après l’incubation, retirez les lames du pot Coplin. Essuyez l’arrière des lames sur une lingette de laboratoire ou une serviette en papier et séchez brièvement à l’air jusqu’à ce que les gouttelettes d’éthanol aient disparu. Créez des cercles très étroits autour de chaque section de tissu à l’aide d’un bloqueur de liquide ou d’un stylo PAP pour limiter la zone d’expansion devant être couverte par la solution d’hybridation, en évitant le contact de l’encre avec la section.

Préparer la solution d’hybridation et ajouter 0,5 microgramme de sonde pour chaque 50 microlitres de la solution utilisée. Pipettez la solution sur les sections de la glissière. Superposez la section avec des couvercles en plastique flexible, en veillant à ce que le volume de liquide utilisé couvre toute la section.

Créez une chambre humide avec une boîte à embouts de pipette avec des lingettes ou des serviettes en papier qui ont été trempées avec un excès de solution d’hybridation ou de PBS pour fournir de l’humidité. Incuber la lame dans la chambre humide à 45 à 50 degrés Celsius pendant au moins trois heures selon la sonde réglée pour réduire l’évaporation. Retirez les couvercles en plastique et incubez les lames dans un tampon de lavage FISH dans un pot Coplin préavertissé à 50 degrés Celsius.

Replacez le pot Coplin dans le four à 50 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes. Retirez le tampon de lavage FISH et remplacez-le par pbS dans le pot Coplin. Immédiatement après avoir rempli le pot Coplin avec du PBS, décantez le PBS.

Retirez les glissières du pot et pipettez la contre-tache sur toute la section, tout en vous assurant de ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Lavez les taches trois fois rapidement avec du PBS frais.

Essuyez l’arrière des glissières contre une lingette ou une serviette en papier et laissez la majeure partie du PBS s’évaporer des sections aidées par une conduite de vide reliée à une pointe de pipette. Montez les sections à l’aide d’un support de montage. Fixez les couvercles à la glissière en peignant le long des bords de la lèvre de couverture avec du vernis à ongles transparent, en prenant soin de rester à l’écart du bord de la glissière.

Laissez-le régler à température ambiante. Des images du côlon distal de souris mono-colonisées avec Muribaculum intestinale et celle bi-colonisée avec Muribaculum intestinale et Bacteroides thetaiotaomicron sont montrées ici. Les échantillons ont été colorés avec une sonde FISH à trois cyanines premières marquées spécifiques à l’isolat de Muribaculum et également contre-colorées avec la lectine UEA-1 et la DAPI liées à la rhodamine.

Les images de sections colorées avec des canaux cyanine-3 FISH, DAPI et combinés cyanine-3 FISH et DAPI montrent la localisation de Muribaculum intestinale. Tous les signaux DAPI en forme de bactéries et de la taille d’une bactérie sont marqués avec de la cyanine-3 à l’état de monocolonisation. Dans l’état de bicolonisation, en plus de ces cellules double positives cyanine-3 et DAPI, il existe des cellules bactériennes colorées par DAPI qui sont cyanine-3 négatives comme prévu.

À l’exception des bactéries filamenteuses plus longues, les structures DAPI positives plus grandes sont du matériel végétal ou des noyaux provenant de cellules hôtes. Un segment intestinal qui a été sectionné à une profondeur qui fournit une vue de la lumière ainsi que des vues longitudinales de l’épithélium et un segment de section peu profonde ne révélant que des sections transversales de cryptes et aucune couche de mucus constante ou de bactéries prouve que la section peu profonde ne fournira pas de tranches luminales de l’intestin. La couverture inégale des tissus ou des couvertures entraîne des balayages de carreaux flous et inégalement éclairés.

Un exemple d’arrière-plan normal et d’arrière-plan élevé est également présenté ici. Au fur et à mesure que nous en apprenons davantage sur le microbiote, il est devenu très évident que les essais en vrac tels que le séquençage ne suffisent pas à déterminer vraiment ce qui se passe entre les différentes espèces microbiennes et comment elles interagissent ensemble. Et pour cela, nous avons vraiment besoin d’imagerie.

Ce type de technique a permis des découvertes très importantes, par exemple, que la privation de fibres de l’alimentation provoque un amincissement de la couche de mucus et potentiellement une infection par des agents pathogènes tels que des études du groupe Martins, ainsi que des études sur les effets de la diarrhée osmotique et comment l’épuisement de la couche de mucus affecte réellement à la fois l’hôte et le microbiote. Et ce sont des études faites par le groupe Sonnenberg, ainsi que par notre groupe.