Name: Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez la visualisation des interactions hôte-microbiote intestinal par hybridation in situ fluorescente et coloration par lectine. Cette méthode permet d'imager la localisation des bactéries dans les tissus et d'étudier leur pénétration.

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Les auteurs tiennent à remercier la Dre Kristen Earle pour le développement inestimable de techniques, Amber Hann pour l’aide au dépannage, la Dre Jen Nguyen et Deanna Pepin pour l’examen critique du manuscrit, et le Dr Hesham Soliman et le laboratoire Rossi de l’Université de la Colombie-Britannique pour avoir fourni un accès au microscope. Les auteurs reconnaissent le soutien de la Subvention d’équipe des IRSC : Initiative canadienne pour le microbiome 2 (T.C.), Crohn et Colite Canada (à C.T. et K.M.N.), CIFAR (à C.T. et K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (à C.T.), la Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (à C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (à C.T.).

<ol><li>Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome%3A+connecting+spatial+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome: connecting spatial organization to function.</a> Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).</li>
<li>Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+of+the+two+Muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).</li>
<li>Johansson, M. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+host+intestinal+mucus+layers+requires+long-term+microbial+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).</li>
<li>Jakobsson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+shapes+the+colon+mucus+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier.</a> EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).</li>
<li>Tropini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+osmotic+perturbation+causes+long-term+alteration+to+the+aut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota.</a> Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).</li>
<li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dietary+fiber-deprived+gut+microbiota+degrades+the+colonic+mucus+barrier+and+enhances+pathogen+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility.</a> Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).</li>
<li>Ng, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+the+gut+microbiota+after+antibiotics+depends+on+host+diet%2C+community+context%2C+and+environmental+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs.</a> Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+spatial+mapping+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities.</a> Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).</li>
<li>Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+mucus+in+histological+sections%2C+immunostaining+of+mucins+in+fixed+tissue%2C+and+localization+of+bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+New+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+Improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoMiner+provides+a+rapid%2C+flexible+environment+for+the+design+of+genome-scale+oligonucleotide+in+situ+hybridization+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).</li>
<li>Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+a+model+15-member+human+gut+microbiota+established+in+gnotobiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).</li>
<li>Lagkouvardos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+cultivation+study+of+Muribaculaceae+reveals+novel+species%2C+host+preference%2C+and+functional+potential+of+this+yet+undescribed+family%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family.</a> Microbiome. 7 (1), 28(2019).</li>
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<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+metagenomic+analysis+of+intact+mucosa-associated+microbial+communities+of+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+tracking+of+host%26ndash%3Bmicrobiota+interactions+via+metabolic+labeling+of+gut+anaerobic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and tracking of host&ndash;microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria.</a> Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).</li>
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<li>Jones, M. V., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+gut+microbiota+spatial+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le protocole décrit ci-dessus fournit une méthode reproductible pour visualiser l’interface hôte-microbiote. Ces tests ont considérablement bénéficié du développement du protocole, depuis l’optimisation du marquage FISH18 jusqu’à la conservation et l’imagerie du mucus9. La fixation et l’intégration fournissent également un stockage utile des échantillons; de plus, les cassettes infiltrées dans la paraffine peuvent être envoyées par la poste sans aucune restriction, car les échantillons sont complètement fixes et inertes.
Importance et méthodes alternatives La combinaison de FISH et de coloration au mucus permet d’analyser la composition du microbiote à des endroits spécifiques des tissus et l’interaction entre les bactéries individuelles et l’hôte. Les techniques alternatives qui impliquent l’analyse de sites spécifiques au sein du microbiote sont généralement incapables d’explorer la nature unicellulaire de ces interactions, comme dans le cas de la microdissection de capture laser couplée au séquençage19. Cependant, les techniques basées sur le séquençage ont l’avantage de pouvoir capturer la constitution génétique du microbiote à un niveau plus fin et plus largement que les sondes d’ARNr 16S.
Un piège du protocole présenté est qu’il fournit un instantané unique du microbiote par rapport à l’hôte. Pour l’imagerie en temps réel chez des animaux vivants, des techniques d’imagerie spéciales sont nécessaires pour faciliter l’acquisition d’un signal de fluorescence dans les tissus profonds (p. ex., microscopie intravitale à deux photons et microscopie à fluorescence à feuille de lumière20,21). Dans ces méthodes, l’organisme modèle est soit colonisé par des bactéries colorées par des molécules qui se lient à leur enveloppe20, soit par des bactéries génétiquement modifiées qui hébergent des protéines fluorescentes21. Dans ce dernier cas, la maturation des protéines de fluorescence est un problème clé car la plupart des protéines fluorescentes standard ont besoin d’oxygène pour émettre de la lumière. Par conséquent, des organismes modèles qui ont au moins des environnements nanérobiques (concentration nanomolaire d’oxygène) sont nécessaires, tels que l’intestin aérobie du poisson-zèbre21.
Dans ce protocole, le méthanol-carnoy est utilisé comme fixateur au lieu du paraformaldéhyde ou du formol car il ne contient pas d’eau. Cela empêche l’hydratation, la déshydratation et l’effondrement de la couche de mucus pendant le traitement et facilite des mesures précises de l’épaisseur du mucus. Bien que la fixation du méthacarn et l’incorporation de paraffine soient devenues une norme dans le domaine, différents fixateurs et techniques d’incorporation ont été étudiés pour optimiser la conservation du mucus9,22, certaines études indiquant que les résines peuvent être supérieures à l’incorporation de paraffine22. Une autre limitation importante à l’incorporation de paraffine et à la fixation du méthacr est la perte de fluorescence des protéines fluorescentes, qui peut être évitée en utilisant d’autres fixateurs (par exemple, le formol ou le paraformaldéhyde (PFA)) ou des techniques d’incorporation modifiées23. Chaque fixateur a des avantages et des inconvénients, et le choix du fixateur dépend des priorités d’imagerie. Les modalités d’imagerie peuvent être combinées si des répliques biologiques sont fixées dans le PFA et le méthacarn et si des images sont obtenues à partir des deux échantillons.
FISH a été associé à l’immunofluorescence dans des cas isolés avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-Muc2C3 spécifiques9,24. Ces résultats n’ont pas été largement reproduits avec d’autres anticorps Muc2, ce qui indique que le choix des anticorps peut être essentiel au succès de la combinaison FISH-immunofluorescence. Les conditions d’une coloration réussie des anticorps pour un anticorps donné peuvent ne pas permettre la rétention de la coloration FISH.
Dépannage Dans ce protocole, la collecte d’échantillons, la section et la coloration représentent des étapes critiques pour empêcher la création d’artefacts d’imagerie. Par exemple, appuyer sur le tissu lors de la collecte et avant l’incorporation peut entraîner une mauvaise localisation du microbiote et affecter la qualité du mucus. Une autre considération importante est d’éviter de combiner des segments d’épaisseurs très différentes dans une seule cassette, comme un morceau relativement vide de l’intestin grêle et une pastille dans le côlon distal. Les différentes épaisseurs entraînent des difficultés d’imagerie : après l’encastrement, la section transversale à une profondeur spécifique pour un segment peut être à la mauvaise profondeur pour l’imagerie pour l’autre (par exemple, la lumière sera à des profondeurs différentes pour chaque tissu) (Figure 1B, C et Figure 3A). De plus, pour l’imagerie des granulés de selles de modèles animaux, ils peuvent être enveloppés dans une membrane péritonéale24. Dans cette technique, une petite section de péritoine fraîchement isolé est doucement pliée autour des selles et préserve la structure de la pastille pendant les étapes de lavage décrites dans le protocole.
Contrairement au traitement des tissus animaux avec contenu, l’imagerie des échantillons intestinaux humains présente certains défis. Plus précisément, le contenu luminal et la muqueuse seront probablement perturbés par la préparation intestinale de coloscopie habituellement effectuée avant les biopsies intestinales ou les procédures de résection. De plus, lorsque des biopsies sont prélevées, il est utile de noter l’orientation des tissus pour aider à identifier des caractéristiques spécifiques (par exemple, lumen vs sous-muqueuse) en l’absence de contenu intestinal. Pré-incorporation avec 3% d’agar et/ou d’agar:les mélanges de gélatine peuvent être utiles pour maintenir la polarité tissulaire25; cependant, il y a des problèmes avec la déshydratation et le sectionnement de la gélose, comme indiqué dans la littérature, et les délais de traitement peuvent devoir être modifiés.
Un aspect clé pour obtenir une bonne coloration FISH provient de l’ajustement de la concentration de formamide pour des sondes FISH spécifiques. Le formamide contrôlera la rigueur d’hybridation des sondes FISH vers leurs cibles. Il est important de s’assurer que a) la concentration appropriée de formamide est choisie pour colorer une communauté donnée, et b) qu’une concentration appropriée de formamide est même possible pour la combinaison de sondes utilisée, ce qui peut affecter le choix optimal de la sonde lors de l’utilisation de plusieurs sondes. Des sites Web tels que mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) peuvent aider à calculer les concentrations appropriées de formamide pour une sonde donnée. En l’absence d’informations sur les concentrations appropriées de formamide, ce protocole peut être testé avec 0% et 10% de formamide.
La section des échantillons incorporés nécessite de couper le bloc à une profondeur suffisante pour obtenir des tranches luminales, car une section trop superficielle dans un bloc entraînera une vue en coupe transversale des villosités/ cryptes sans contenu luminal (Figure 3A). Colorez les échantillons peu après la section pour obtenir un signal FISH optimal et utilisez du DAPI frais (ou DAPI stocké à -20 °C) pour résoudre les problèmes d’arrière-plan (Figure 3C). La coloration FISH des sections âgées de plus d’un mois peut entraîner une coloration plus faible / incohérente.
Si le tissu ou le couvercle n’est pas parfaitement plat par rapport à la lame, l’échantillon peut ne pas être mis au point à toutes les positions d’un balayage de tuiles (Figure 3B), ce qui entraîne un gaspillage d’efforts et un photoblanchiment potentiel. Cela peut être résolu en prenant des scans de tuiles plus petits dans lesquels toutes les positions ont été vérifiées pour être au point. La section avec des lames ternes peut également entraîner le détachement du mucus et du contenu luminal, qui apparaissent comme de grandes zones sombres lors de l’imagerie. Enfin, l’évaporation de la solution ou des bulles lors de l’étape d’hybridation peut entraîner une coloration inégale des sondes FISH dans le tissu.
Un autre paramètre critique qui affecte l’efficacité de la liaison de la sonde FISH est la concurrence entre les différentes sondes. Une vérification utile pour vérifier que la sonde FISH marque les bactéries consiste à examiner la colocalisation du signal de la sonde FISH avec DAPI (Figure 2C,D). Dans les échantillons qui nécessitent l’utilisation de plusieurs sondes à ARNr, il devient essentiel d’ajuster des paramètres tels que la température d’hybridation, la concentration de la sonde et le formamide pour s’assurer que les sondes se lient efficacement à la bonne espèce18.
Remarques sur l’imagerie Les bactéries colorées par FISH sont mieux visualisées à l’aide d’un microscope confocal et d’un objectif d’un grossissement d’au moins 40x. Alors que le grossissement 63x est préféré à l’image des bactéries au niveau de la cellule unique, le grossissement 40x peut également être utilisé en maximisant le zoom numérique ou en utilisant un système de super-résolution. Les systèmes équipés de capacités de super-résolution peuvent également fournir une résolution subcellulaire de cellules bactériennes individuelles. Des objectifs de grossissement plus faibles peuvent être utilisés pour obtenir une idée générale de la localisation bactérienne et de l’épaisseur du mucus.
L’acquisition d’images 16 bits au lieu d’images 8 bits est également fortement recommandée, car la plage dynamique plus élevée aidera à capturer la large gamme du signal DAPI à partir des noyaux extrêmement brillants de l’épithélium et le signal relativement faible des bactéries luminales. Outre l’utilisation de la configuration d’imagerie décrite ci-dessus, une considération d’imagerie importante est le choix des fluorophores. Pour une meilleure séparation entre les types bactériens, assurez-vous que les fluorophores utilisés ne se chevauchent pas dans les spectres d’excitation et d’émission (sauf imagerie sur un système capable d’effectuer un démélange linéaire). De plus, les sondes peuvent être utilisées en combinaison (p. ex., la combinaison d’une sonde spécifique à une famille et d’une sonde spécifique à un genre) pour identifier d’autres membres de la communauté. Si vous utilisez des sondes linéaires non mélangées ou non validées, il est essentiel de tester la précision et le niveau de coloration FISH sur des cultures pures8,14.
Une fois les images collectées, plusieurs outils sont disponibles pour l’analyse quantitative de l’interface hôte-microbiote, tels que BacSpace26, HiPR-FISH8 et d’autres outils de segmentation27. BacSpace est un logiciel MATLAB qui permet la segmentation des composants tissulaires et luminaux et l’élimination du matériel végétal des images26. Le programme fournit également une analyse de l’épaisseur du mucus en 2D et une quantification de la distribution spatiale basée sur les distances en pixels dans différents canaux26. Inversement, le logiciel HiPR-FISH Image Analysis permet la segmentation des cellules colorées FISH8. Enfin, d’autres outils de segmentation bactérienne optimisés pour les expériences in vitro27 pourraient également être adaptés à cette application.
Conclusion L’imagerie in situ permet l’analyse quantitative de taxons microbiens individuels dans le contexte d’autres membres de la communauté et des divers microenvironnements créés par l’alimentation, le mucus et les cryptes épithéliales hôtes. L’interaction entre les organismes dicte la biologie des systèmes microbiens associés à l’hôte et fournit une analyse essentielle du changement dans ces structures au cours de la perturbation qui a des implications pour la santé. Notamment, la capacité d’imager le microbiote in situ grâce au protocole décrit ci-dessus offre une fenêtre incroyable sur la biogéographie du microbiote par rapport à l’hôte animal.

Les techniques de visualisation microbienne ont des origines aussi anciennes que la microbiologie elle-même, quand Antonie Van Leeuwenhoek a utilisé son microscope pour observer les bactéries (qu’il a appelées « animalcules ») de la plaque dentaire et des selles au 17ème siècle. Depuis lors, de nombreuses techniques ont été développées pour visualiser l’organisation spatiale du consortium de bactéries, champignons et virus qui vivent associés à un hôte, le microbiote1. Élucider la localisation de ces microbes est essentiel pour déterminer leur fonction au sein de leur hôte animal. La biogéographie des bactéries est importante dans les taxons commensaux et pathogènes, car la proximité d’endroits spécifiques (par exemple, l’épithélium), de substrats nutritionnels et de microbes spécifiques peut dicter la production bactérienne de métabolites sous-jacents aux interactions inter-espèces et inter-règnes.
Une structure clé séparant les bactéries et les tissus hôtes dans plusieurs sites corporels disparates, tels que la cavité buccale, l’intestin ou le poumon, est le mucus - une couche produite par l’hôte qui empêche la translocation microbienne sur les cellules épithéliales de l’hôte et sert de ressource nutritionnelle pour le microbiote2,3,4 . La caractérisation des brèches et des changements dans cette barrière est d’une importance capitale, conduisant à un aperçu mécaniste des interactions hôte-microbiote qui ne serait pas obtenu par séquençage seul5,6,7. Par exemple, l’imagerie a permis de découvrir que l’exposition aux antibiotiques peut perturber la couche de mucus et l’organisation du microbiote7,8, et que les laxatifs peuvent épuiser le mucus, en corrélation avec de grands changements dans les paramètres immunitaires5.
Ce protocole décrit un cadre général pour la fixation, la coloration et l’imagerie du microbiote et du tissu hôte (Figure 1), basé sur les travaux de Johansson et Hansson9. Bien que ce protocole soit modélisé dans le contexte des coupes intestinales, il peut être facilement adapté à d’autres types de tissus. Ce protocole permet le traitement d’échantillons cliniques expérimentaux d’animaux ou d’humains; des notes pour le traitement des deux types d’échantillons ont été incluses. Dans l’exemple présenté ici, l’épithélium hôte et les bactéries luminales ont été marqués simultanément avec une coloration au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), du mucus avec la lectine conjuguée à la fluorescéine (FITC), de l’agglutinine I d’Ulex europaeus (UEA-1) et un taxon bactérien spécifique utilisant FISH. Les sondes FISH sont généralement conçues contre les gènes de l’ARNr 16S d’un taxon pour assurer le signal élevé de la liaison d’un transcrit à copie élevée.
Dans cet exemple, la sonde cible l’ARNr 16S de la famille bactérienne Muribaculaceae (Figure 2). Cependant, les taches sont facilement substituées par différentes sondes FISH et / ou lectines pour répondre à la question biologique appropriée. Les sondes FISH précédemment validées peuvent être trouvées sur ProbeBase10, une ressource en ligne pour les sondes d’oligonucléotides ciblées par l’ARNr, ou sur SILVA11, une base de données d’ARN ribosomique. Pour la conception de nouvelles sondes, le lecteur peut se référer à de nouveaux pipelines tels que HiPR-FISH8 ou Oligominer12. En utilisant ce protocole, il est possible d’observer l’emballage étroit des bactéries dans la lumière intestinale et les différentes caractéristiques du mucus intestinal dans tout le tube digestif. Le flux de travail décrit ici permet l’analyse quantitative du microbiote dans le contexte spatial de son environnement hôte.

<table><tbody><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Toxic Coplin</td><td>pot Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture, 22 &times ; 22 mm, no #1</td><td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Remis en suspension à 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Boîte(s) vide(s)</td><td></td><td></td> <td>d’embouts de pipettePour faire fondre la paraffine</td></tr><tr><td>Éthanol, anhydre, de qualité moléculaire</td><td>-</td><td>---Sondes</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td>FISH</tr><tr><td>Solution d’hybridation FISH</td><td>--</td><td>--20</td> <td>mM Tris&ndash ; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01 % (p/v) SDS dans l’eau sans nucléases. Ajout facultatif de 5&ndash ; 50 % (v/v) de formamide</td></tr><tr><td>FISH tampon de lavage</td><td>--</td><td>--</td><td>20 mM Tris&ndash ; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl</td></tr><tr><td>Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) marqué par fluorescence</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1061 (marqué à la fluorescéine) ou RL-1062-2 (marqué à la rhodamine)</td><td>UEA-1 marque les glycanes fucosylés, il ne convient donc pas aux souris exemptes de germes ou aux échantillons d’hôtes déficients en fucosyltransférase 2 (FUT2).</td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid Fisher</td><td></td><td>A38-212</td><td>Corrosive et inflammable</td></tr><tr><td>HybriSlip lamelles en plastique souple, 22 x 22 mm &times ; 0,25 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL722222</td><td>pour les étapes d’hybridation FISH, peut remplacer les lamelles en verre</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrière hydrophobe PAP Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>Microtome</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> toxique et inflammable <td>pour la coupe de</td></tr><tr><td>récipients de stockage d’échantillons polyvalents, 473 mL</td><td>Fisher</td><td>14-955-117A</td><td>Peut remplacer par un récipient en verre ou en polyéthylène de votre choix. Le méthacarn n’est pas compatible avec le polystyrène ou le métal.</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72180</td><td>N’importe quel vernis à ongles devrait fonctionner</td></tr><tr><td>Four</td><td></td><td></td><td>Plage nécessaire : 45-60 &deg ; C</td></tr><tr><td>Paraffine : Leica Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solution saline tamponnée au phosphate (solution 10x)</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Diluer à 1x pour le protocole</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS), solution à 20 %, sans RNase,</td><td>Invitrogen</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Loc HistoScreen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>CA83009-999</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Eau, sans nucléase</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Toxique et inflammable</td></tr></tbody></table>

visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Mesurer la localisation des microbes dans leur contexte in vivo est une étape essentielle pour révéler les relations fonctionnelles entre le microbiote et l’intestin des vertébrés. Le paysage spatial du microbiote intestinal est étroitement contrôlé par les caractéristiques physiques - mucus intestinal, cryptes et plis - et est affecté par des propriétés contrôlées par l’hôte telles que le pH, la disponibilité de l’oxygène et les facteurs immunitaires. Ces propriétés limitent la capacité des microbes commensaux et des agents pathogènes à coloniser l’intestin de manière stable. À l’échelle du micron, l’organisation microbienne détermine les interactions étroites entre différents microbes ainsi que les interactions entre les microbes et leur hôte. Ces interactions affectent ensuite le fonctionnement des organes à grande échelle et la santé de l’hôte.
Ce protocole permet de visualiser l’organisation spatiale du microbiote intestinal à partir des distances entre les cellules et des échelles à l’échelle de l’organe. La méthode est basée sur la fixation des tissus intestinaux tout en préservant la structure intestinale et les propriétés du mucus. Les échantillons fixes sont ensuite incorporés, sectionnés et colorés pour mettre en évidence des espèces bactériennes spécifiques par hybridation in situ par fluorescence (FISH). Les caractéristiques de l’hôte, telles que le mucus et les composants de la cellule hôte, sont marquées avec des lectines marquées par fluorescence. Enfin, les sections colorées sont imagées à l’aide d’un microscope confocal utilisant l’imagerie par balayage par tuiles à fort grossissement pour relier les échelles de longueur du micron au centimètre. Ce type d’imagerie peut être appliqué à des coupes intestinales à partir de modèles animaux et à des biopsies de tissus humains pour déterminer la biogéographie du microbiote dans l’intestin en santé et en maladie.

Pour étudier la localisation de bactéries commensales intestinales spécifiques dans l’intestin de la souris, des souris Webster suisses sans germes qui avaient été colonisées avec des isolats bactériens individuels ont été utilisées dans cette étude. Pour cette expérience, les espèces bactériennes étiquetées étaient i) un isolat humain de la famille muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, une famille abondante et répandue de bactéries dans le microbiote murin15, ainsi que ii) Bacteroides thetaiotaomicron, une bactérie intestinale génétiquement traitable et commune. Après deux semaines d’équilibrage, les souris ont été euthanasiées et un segment du côlon contenant une pastille fécale a été sectionné et fixé dans du méthacarn fraîchement préparé. Après deux jours de fixation, les sections ont été déshydratées par traitement à travers du méthanol, de l’éthanol et des xylènes, infiltrées avec de la paraffine, incorporées, puis sectionnées en tranches luminales de 4 μm. Ces échantillons ont ensuite été colorés avec une sonde FISH (3' marquée Cy3) spécifique à l’isolat de Muribaculum, conçue à l’aide du logiciel Oligominer12, et vérifiés pour la structure secondaire et tertiaire et la liaison minimale non spécifique à l’aide de NuPACK et mathFISH16,17. Les échantillons ont également été contre-colorés avec la lectine UEA-1 liée à la rhodamine (qui colore les glycanes fucosylés dans le mucus) et le DAPI. Les sections colorées ont été imagées à l’aide d’un objectif d’huile 40x et d’un module de super-résolution.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail de visualisation de l’interface microbiote-hôte dans l’intestin. (A) Un flux de travail illustré pour le pipeline. (B) Les deux plans de section donneront soit des sections transversales (préférées pour ce pipeline), soit des « beignets » de section transversale. (C) L’incorporation de tissus d’épaisseurs très différentes peut donner lieu à des tranches qui ne sont optimales que pour un tissu ou un autre. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig02.jpg"> Figure 2 : L’imagerie du côlon montre la localisation de Muribaculum intestinale par rapport au mucus dans un modèle murin gnotobiotique. Les sections ont été colorées avec DAPI (bleu), Muribaculaceae FISH probe (rouge) et UEA-1 (vert). (A) Côlon distal de souris mono-colonisé avec Muribaculum intestinale et (B) côlon distal de souris bi-colonisé avec Muribaculum intestinale et Bacteroides thetaiotaomicron. Barre d’échelle = 20 μm. (C et D) Cy3-FISH (à gauche), DAPI (au milieu) et canaux combinés Cy3-FISH + DAPI pour les parties luminales de (A) et (B), respectivement. Barre d’échelle = 5 μm. Dans (A) et (C), tous les signaux DAPI en forme de bactéries et de taille bactérienne sont marqués avec Cy3 (pointes de flèche simples), et dans (B) et (D), en plus de ces cellules Cy3 et DAPI-double-positives (pointes de flèche simples), il existe des cellules bactériennes colorées DAPI qui sont Cy3-négatives (doubles pointes de flèche), comme prévu pour les états mono- et bi-colonisation. À l’exception des bactéries filamenteuses plus longues, les structures DAPI positives plus grandes (&gt;4 μm de longueur) (flèches émoussées) sont du matériel végétal ou des noyaux provenant de cellules hôtes. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig03.jpg"> Figure 3: Problèmes courants. (A) La section peu profonde ne fournira pas de tranches luminales de l’intestin. (À gauche) Un segment intestinal qui a été sectionné à une profondeur qui fournit une vue de la lumière ainsi que des vues longitudinales de l’épithélium. (À droite) Un segment intestinal qui a été sectionné trop peu profondément, ne révélant que des sections transversales de cryptes et aucune couche de mucus ou de bactéries constantes. (B) Une couverture inégale des tissus et des couvertures peut entraîner des balayages de carreaux flous et inégalement éclairés. Un balayage de tuiles a été mis en place avec des positions floues (coin supérieur droit). (C) Exemple d’arrière-plan normal (à gauche) et d’arrière-plan élevé (à droite). Dans cet exemple, pour le signal DAPI, notez le signal provenant de l’épithélium, à l’extérieur des noyaux. Toutes les barres d’échelle = 20 μm. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Les microbes associés à l’hôte constituent cet écosystème très complexe qui nécessite vraiment une imagerie pour être compris. Et à travers cette particule, nous allons vous montrer comment passer par le processus de coloration et obtenir une visualisation de l’interface du microbiome hôte. Comprendre la biologie des bactéries associées à l’hôte nécessite de comprendre leur localisation dans des micro-environnements.Et cette technique nous permettra de visualiser des taxons individuels dans des environnements hôtes, ainsi que dans le contexte d’autres bactéries. Grâce à cette technique, il sera possible de déterminer quelles bactéries peuvent avoir pénétré à travers le tissu hôte, ainsi que de déterminer si des caractéristiques clés telles que le mucus hôte peuvent être épuisées. Préparer du méthacarn frais dans un récipient compatible avec 60% de méthanol absolu, 30% de chloroforme et 10% d’acide acétique glacial.À l’aide d’outils pointus et propres, coupez les segments intestinaux des souris pour l’imagerie. Minimisez autant que possible le dérangement de l’échantillon et manipulez les sections par leurs crêtes pour éviter d’affecter la zone d’imagerie. Fixez l’échantillon dès que possible après la dissection pour éviter toute dégradation.Placez les sections intestinales dans des cassettes d’histologie en tenant délicatement un bord du tissu avec une pince à épiler. Fermez la cassette et immergez-la complètement dans une solution de méthacarn fraîche, en veillant à ce que la solution ne soit pas plus vieille que quelques heures après l’immersion des cassettes. Pour les échantillons cliniques qui seront prélevés dans une suite clinique sans accès à une hotte aspirante, utilisez un récipient de stockage en polyéthylène avec un rabat coupé dans le couvercle qui permettra le passage des cassettes histologiques.Scotchez ce rabat fermé lorsqu’il ne passe pas les échantillons pour empêcher l’échappement des fumées toxiques. Placez la paraffine dans un récipient résistant à la chaleur et faites fondre dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Lavez le tissu en versant le liquide dans le récipient à déchets approprié et en l’incubant séquentiellement dans du méthanol absolu, de l’éthanol absolu et du xylène comme décrit dans le manuscrit du texte.Ouvrez légèrement les cassettes pour permettre à la paraffine d’entrer sans perdre les segments de tissu à l’aide de gants doubles ou d’une pince à épiler. Immergez et fermez les cassettes dans le récipient de paraffine fondue. Replacez le récipient dans le four à 60 degrés Celsius, en vous assurant que les cassettes sont remplies de paraffine et qu’il ne reste pas de grosses bulles d’air.Après une incubation de deux heures, retirez le récipient du four. À l’aide de pinces, retirez soigneusement les cassettes. Chauffer le four à 60 degrés Celsius et préchauffer un pot Coplin.Ajouter suffisamment de volume de xylène dans une bouteille en verre pour couvrir les lames de verre dans le pot deux fois et placer le parafilm autour du couvercle pour empêcher l’évaporation des xylènes. Laissez la température des xylènes atteindre 60 degrés Celsius. Préparez la solution d’hybridation FISH comme mentionné dans le manuscrit textuel.Placez les lames dans le pot Coplin, en vous assurant que les sections ne sont pas entrées en contact avec d’autres lames ou le pot et faites cuire les lames à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans la hotte, remplissez le pot Coplin avec des xylènes préavertis du four, en prenant soin de ne pas verser directement sur les échantillons et potentiellement déloger les tissus. Replacez le pot Coplin dans le four à 60 degrés.Versez les xylènes usagés dans un récipient à déchets approprié, en prenant soin de ne pas déranger les sections de tissu sur les lames en verre et en utilisant une paire de pinces pour empêcher les lames de tomber du pot Coplin. Reconstituez le pot Coplin avec les xylènes restants et incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans la hotte. Incuber les sections dans de l’éthanol à 99,5 % pendant cinq minutes à température ambiante.Après l’incubation, retirez les lames du pot Coplin. Essuyez l’arrière des lames sur une lingette de laboratoire ou une serviette en papier et séchez brièvement à l’air jusqu’à ce que les gouttelettes d’éthanol aient disparu. Créez des cercles très étroits autour de chaque section de tissu à l’aide d’un bloqueur de liquide ou d’un stylo PAP pour limiter la zone d’expansion devant être couverte par la solution d’hybridation, en évitant le contact de l’encre avec la section.Préparer la solution d’hybridation et ajouter 0,5 microgramme de sonde pour chaque 50 microlitres de la solution utilisée. Pipettez la solution sur les sections de la glissière. Superposez la section avec des couvercles en plastique flexible, en veillant à ce que le volume de liquide utilisé couvre toute la section.Créez une chambre humide avec une boîte à embouts de pipette avec des lingettes ou des serviettes en papier qui ont été trempées avec un excès de solution d’hybridation ou de PBS pour fournir de l’humidité. Incuber la lame dans la chambre humide à 45 à 50 degrés Celsius pendant au moins trois heures selon la sonde réglée pour réduire l’évaporation. Retirez les couvercles en plastique et incubez les lames dans un tampon de lavage FISH dans un pot Coplin préavertissé à 50 degrés Celsius.Replacez le pot Coplin dans le four à 50 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes. Retirez le tampon de lavage FISH et remplacez-le par pbS dans le pot Coplin. Immédiatement après avoir rempli le pot Coplin avec du PBS, décantez le PBS.Retirez les glissières du pot et pipettez la contre-tache sur toute la section, tout en vous assurant de ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Lavez les taches trois fois rapidement avec du PBS frais.Essuyez l’arrière des glissières contre une lingette ou une serviette en papier et laissez la majeure partie du PBS s’évaporer des sections aidées par une conduite de vide reliée à une pointe de pipette. Montez les sections à l’aide d’un support de montage. Fixez les couvercles à la glissière en peignant le long des bords de la lèvre de couverture avec du vernis à ongles transparent, en prenant soin de rester à l’écart du bord de la glissière.Laissez-le régler à température ambiante. Des images du côlon distal de souris mono-colonisées avec Muribaculum intestinale et celle bi-colonisée avec Muribaculum intestinale et Bacteroides thetaiotaomicron sont montrées ici. Les échantillons ont été colorés avec une sonde FISH à trois cyanines premières marquées spécifiques à l’isolat de Muribaculum et également contre-colorées avec la lectine UEA-1 et la DAPI liées à la rhodamine.Les images de sections colorées avec des canaux cyanine-3 FISH, DAPI et combinés cyanine-3 FISH et DAPI montrent la localisation de Muribaculum intestinale. Tous les signaux DAPI en forme de bactéries et de la taille d’une bactérie sont marqués avec de la cyanine-3 à l’état de monocolonisation. Dans l’état de bicolonisation, en plus de ces cellules double positives cyanine-3 et DAPI, il existe des cellules bactériennes colorées par DAPI qui sont cyanine-3 négatives comme prévu.À l’exception des bactéries filamenteuses plus longues, les structures DAPI positives plus grandes sont du matériel végétal ou des noyaux provenant de cellules hôtes. Un segment intestinal qui a été sectionné à une profondeur qui fournit une vue de la lumière ainsi que des vues longitudinales de l’épithélium et un segment de section peu profonde ne révélant que des sections transversales de cryptes et aucune couche de mucus constante ou de bactéries prouve que la section peu profonde ne fournira pas de tranches luminales de l’intestin. La couverture inégale des tissus ou des couvertures entraîne des balayages de carreaux flous et inégalement éclairés.Un exemple d’arrière-plan normal et d’arrière-plan élevé est également présenté ici. Au fur et à mesure que nous en apprenons davantage sur le microbiote, il est devenu très évident que les essais en vrac tels que le séquençage ne suffisent pas à déterminer vraiment ce qui se passe entre les différentes espèces microbiennes et comment elles interagissent ensemble. Et pour cela, nous avons vraiment besoin d’imagerie.Ce type de technique a permis des découvertes très importantes, par exemple, que la privation de fibres de l’alimentation provoque un amincissement de la couche de mucus et potentiellement une infection par des agents pathogènes tels que des études du groupe Martins, ainsi que des études sur les effets de la diarrhée osmotique et comment l’épuisement de la couche de mucus affecte réellement à la fois l’hôte et le microbiote. Et ce sont des études faites par le groupe Sonnenberg, ainsi que par notre groupe.

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Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

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