Name: Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez la tomographie tridimensionnelle à haute résolution pour étudier les infections microbiennes chez la souris. Cette méthode permet de détecter Salmonella persistant dans la rate malgré les antibiotiques.

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Le travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la recherche scientifique 310030_156818, 310030_182315 et NCCR_ 180541 AntiResist (à DB).

Suivi d’agents pathogènes d’organe entier par quantification par rapporteur fluorescent

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le contexte tissulaire local des agents pathogènes bactériens est crucial pour déterminer les attaques locales de l’hôte, les adaptations bactériennes, l’issue locale des interactions hôte-pathogène et de la chimiothérapie antimicrobienne, et les contributions individuelles à l’issue globale de la maladie. L’imagerie de bactéries de taille micrométrique dans des organes de quelques centimètres a été un défi. La tomographie à deux photons en série (STP) offre une résolution spatiale suffisante pour détecter des cellules bactériennes individuelles dans des organes entiers, une coupe et une imagerie automatisées, et un débit suffisant (~1 organe par jour)11. Bien que les antigènes de l’hôte puissent être colorés in vivo, les cellules pathogènes doivent exprimer des protéines fluorescentes appropriées pour assurer une détection complète des cellules pathogènes intracellulaires. Les ensembles de données qui en résultent (0,5 à 1,5 téraoctet par organe) posent des défis considérables aux infrastructures informatiques pour l’analyse et le stockage des données.
Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, une souche pathogène avec une expression détectable et homogène de la protéine fluorescente GFP ou YFP est requise. Idéalement, une cassette d’expression chromosomique25 est utilisée pour minimiser l’hétérogénéité de fluorescence due à la variation du nombre de copies plasmidiques. Une intensité de fluorescence suffisante est requise, mais des niveaux excessifs de protéines fluorescentes doivent être évités pour éviter les troubles de la condition physique de l’agent pathogène23. Des niveaux d’expression appropriés peuvent être obtenus par la sélection d’un promoteur approprié et l’ajustement fin du site de liaison ribosomique25 ou de l’ensemble de la région 5' non traduite (UTR)26. Deuxièmement, la fixation de la perfusion doit impliquer un lavage initial avec un tampon pour éliminer autant d’érythrocytes que possible de la circulation sanguine. Ceci est particulièrement critique pour la rate et le foie (bien que l’élimination complète des érythrocytes de ces organes soit difficile). Les érythrocytes restants absorbent la lumière dans la partie visible du spectre, compromettant la qualité de l’imagerie27. Troisièmement, le stockage des tissus fixés dans le cryoprotecteur est essentiel pour réduire l’autofluorescence des tissus, qui est particulièrement élevée dans les tissus enflammés et peut éclipser la fluorescence relativement faible des cellules pathogènes11. Quatrièmement, la réticulation efficace du tissu avec le bloc d’agarose environnant est essentielle pour une coupe en douceur du vibratome sans que le tissu ne sorte du bloc d’agarose. Cinquièmement, les signaux fluorescents et leur identification en tant que cellules pathogènes doivent être vérifiés indépendamment à l’aide d’approches orthogonales telles que la coloration avec des anticorps contre les composants pathogènes (tels que le lipopolysaccharide pour les bactéries à Gram négatif) et la microscopie confocale des coupes extraites du tomographe11. Certains tissus infectés contiennent des particules auto-fluorescentes de forme similaire et de spectres de fluorescence qui se chevauchent et qui peuvent facilement être interprétées à tort comme des cellules pathogènes. Sixièmement, la quantité de cellules pathogènes dans les microcolonies doit être comparée à des approches orthogonales telles que la microscopie confocale pour évaluer la précision. Les charges bactériennes globales basées sur ces calculs doivent être vérifiées par comparaison avec des approches orthogonales telles que la cytométrie en flux et le placage.
Parmi les modifications importantes apportées au protocole STP largement utilisé, citons la mise en place d’un filtre passe-bande étroit de 510/20 nm devant le photomultiplicateur 211, afin de réduire les interférences de l’autofluorescence vert-jaune qui est particulièrement forte dans le foie, la rate et les plaques de Peyer infectées et enflammées. La forte autofluorescence et l’augmentation de la diffusion de la lumière de ces organes par rapport au cerveau (qui domine les autres applications de STP) génèrent également un besoin de correction plus efficace de l’éclairage inégal. Autre modification, ce protocole utilise l’approche CIDRE22 à cette fin (Figure 3) et la segmentation des bactéries basée sur l’IA. Enfin, le prétraitement tissulaire a été modifié en incluant une étape d’incubation dans un cryoprotecteur à -20 °C, ce qui réduit l’autofluorescence tissulaire et facilite ainsi la détection des petites cellules pathogènes à fluorescence relativement faible11.
Le dépannage peut être nécessaire si aucun signal d’agent pathogène ne peut être détecté, ou si la segmentation donne une sensibilité insuffisante (trop de cellules pathogènes sont manquées) ou une précision insuffisante (trop de particules d’arrière-plan sont segmentées en cellules pathogènes). Si l’autofluorescence des tissus de fond est détectable mais qu’il y a trop peu de signaux pathogènes, les agents pathogènes peuvent contenir des quantités insuffisantes de protéines fluorescentes. Cela peut être testé à l’aide de la microscopie confocale de coupes de tissus du même tissu infecté ou de la cytométrie en flux d’homogénats de tissus19,28. Les raisons sous-jacentes peuvent être des niveaux d’expression insuffisants ou une instabilité de la cassette d’expression. Les stratégies d’atténuation pourraient inclure d’autres promoteurs pour stimuler l’expression, l’adaptation des codons des gènes codant pour la protéine fluorescente pour l’espèce pathogène, l’utilisation de constructions épisomiques avec un nombre de copies plus élevé, ou la stabilisation des cassettes d’expression par intégration chromosomique ou complémentation létale équilibrée29. Le choix de la protéine fluorescente est également important, mais la détection est possible avec GFP.mut2, mWasabi, YPet et TIMERbac. Si la segmentation est inexacte, cela peut être dû à une fluorescence pathogène trop faible qui pourrait être traitée comme décrit ci-dessus, ou à un fond d’autofluorescence tissulaire trop élevé. Une perfusion importante de solution de lavage ou une incubation prolongée dans la mémoire tampon de stockage immédiatement avant l’intégration dans le bloc d’agarose et la tomodensitométrie peuvent résoudre ces problèmes. Enfin, un entraînement suffisant du réseau neuronal est nécessaire pour une classification précise, mais un entraînement excessif peut conduire à un surajustement qui nuit aux performances des nouveaux échantillons.
À l’heure actuelle, aucune autre méthode ne permet d’imager des organes entiers à une résolution spatiale suffisante en 3D pour détecter des bactéries individuelles. Les améliorations futures de l’élimination des tissus et de la microscopie à feuillet de lumière pourraient permettre d’obtenir une résolution similaire. Cela pourrait permettre d’obtenir des images à une vitesse plus élevée et avec plus de canaux fluorescents.
Une limitation importante de la STP est la résolution des pixels dans le plan de ~0,5 μm et la résolution verticale de 5 à 10 μm, ce qui est insuffisant pour résoudre les bactéries situées à proximité, par exemple au sein d’une microcolonie densément emballée. Cependant, il est possible de récupérer des coupes de tissus après la tomodensitométrie pour la microscopie confocale secondaire à haute résolution de parties de tissus sélectionnées. Une autre limitation de STP est la disponibilité de seulement trois canaux de fluorescence, ce qui limite le nombre de fluorophores pouvant être imagés simultanément. Encore une fois, l’analyse secondaire de coupes de tissus récupérées avec des méthodes de multiplexage peut révéler l’emplacement et l’intensité de beaucoup plus de marqueurs pour des parties de tissus sélectionnées. Cette information pourrait être intégrée dans la structure 3D globale du tissu environnant, telle que déterminée avec STP.
En conclusion, ce protocole permet d’étudier en détail les interactions hôte-pathogène au niveau local et au niveau de l’organe entier. Le protocole doit être facilement adaptable à d’autres agents pathogènes (à condition qu’ils puissent être obtenus sous forme de souches fluorescentes), à d’autres organes et à différentes espèces hôtes.

Les infections se produisent dans des tissus à l’anatomie complexe et à la physiologie compartimentée. Les divers microenvironnements qui coexistent dans les tissus infectés peuvent déterminer le destin des sous-ensembles locaux d’agents pathogènes et leurs contributions à l’issue globale de la maladie 1,2,3. Cependant, la cartographie 3D complète des agents pathogènes microbiens dans des tissus de taille centimétrique reste difficile4. L’imagerie du cerveau et d’autres organes est un domaine de recherche très actif avec des stratégies expérimentales en constante amélioration5, mais de nombreuses méthodes n’ont toujours pas la résolution inférieure au μm qui serait nécessaire pour identifier avec certitude des agents pathogènes bactériens de taille μm. En revanche, la tomographie série à deux photons (STP)6 permet une imagerie multicolore automatisée et sans déformation de tissus entiers avec une résolution dans le plan inférieure à μm, ce qui permet d’obtenir des ensembles de données volumétriques complets. Cette méthode combine une section physique répétée du tissu à l’aide d’un vibratome avec une imagerie intermittente à deux photons des faces émergentes des blocs émergents avec une lumière infrarouge. La tomographie STP a été largement utilisée pour cartographier les axones minces dans le cerveau afin d’établir des cartes de connectivité 7,8,9,10.
La tomographie STP permet également de cartographier en 3D des cellules pathogènes microbiennes individuelles (Salmonella, Toxoplasma) dans l’ensemble des tissus infectés11,12 à l’aide d’un tomographe. La génération de seconde harmonique révèle des gaines de collagène autour des artères et dans des bandes fibreuses telles que les trabécules de la rate, fournissant ainsi un contexte anatomique. Des anticorps fluorescents injectés in vivo peuvent être utilisés pour colorer les cellules hôtes afin de révéler les interactions entre les cellules pathogènes individuelles et les cellules immunitaires infiltrantes telles que les neutrophiles. Ici, le pipeline impliquant le traitement du tissu, l’imagerie, l’assemblage de tuiles d’imagerie avec correction de l’éclairage, l’empilement d’images en trois dimensions et la segmentation à l’aide d’outils d’apprentissage automatique est décrit. Ce pipeline produit des positions 3D d’agents pathogènes individuels, de cellules et de microcolonies dans leur contexte hôte. Le comptage du nombre de cellules individuelles au sein des microcolonies reste difficile en raison des limites de résolution, mais ce nombre peut être estimé sur la base de la luminosité intégrée de la microcolonie. Le pipeline peut être facilement adapté à d’autres modèles d’infection si des agents pathogènes recombinants exprimant la GFP ou le YFP sont disponibles.

<table><tbody><tr><td><fort>Chimie</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>Roth Art</td><td>. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif instantané Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Periodate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tétraborate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au tris (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vide filtration 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp ;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moule en plastique détachable</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 tomographe</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps/colorants</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Primaire anticorps</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, sifin de lapin</td><td>REF</td><td>TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clone 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, clone 1A8</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>Anticorps</td> secondaires 127608<td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-rabbit Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version Fiji</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Image J</td><td>1.54g ou version ultérieure</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b ou version ultérieure</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrateur (tomograph)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de visualisation Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 ou version ultérieure</td><td></td></tr></tbody></table>

tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

La plupart des infections se produisent dans les tissus tridimensionnels de l’hôte avec une anatomie complexe et une physiologie de l’hôte variant localement. Le positionnement des cellules pathogènes dans cet environnement diversifié affecte considérablement leur niveau de stress, leurs réponses, leur destin et leur contribution à la progression globale de la maladie et à l’échec du traitement. Cependant, en raison des difficultés techniques rencontrées pour localiser des cellules pathogènes de taille μm dans des organes hôtes de taille cm, ce domaine de recherche a été relativement inexploré. Nous présentons ici une méthode pour relever ce défi. Nous utilisons la tomographie à deux photons en série et l’analyse d’image améliorée par l’IA pour localiser les cellules individuelles de Salmonella dans l’ensemble de la rate, des lobes hépatiques et des ganglions lymphatiques entiers des souris infectées. À l’aide de rapporteurs fluorescents et de l’administration d’anticorps in vivo , il est possible de déterminer le taux de réplication des cellules uniques de Salmonella , leur interaction locale avec des cellules immunitaires spécifiques et les réponses bactériennes aux antibiotiques. Ces méthodologies ouvrent la voie à un examen complet des infections, de leur prévention et de leur traitement dans le contexte tissulaire tridimensionnel.

La procédure décrite permet de détecter des cellules individuelles de Salmonella dans des organes entiers de souris tels que la rate, le foie, les ganglions lymphatiques mésentériques et les plaques de Peyer11 (figures 5 et 6). Il détecte également les parasites Toxoplasma gondii dans le cerveau de la souris12. Certains tissus infectés, notamment le foie, les plaques de Peyer et la rate, émettent une autofluorescence substantielle dans la gamme vert-jaune. L’autofluorescence est encore renforcée par la fixation au paraformaldéhyde, qui est nécessaire pour préserver la structure tissulaire. La détection de la fluorescence verte de la GFP, du mWasabi et de la composante verte de TIMERbac contre ce fond d’autofluorescence est améliorée en plaçant un filtre passe-bande étroite 510/20 nm (transmettant la plupart des émissions GFP mais bloquant une grande partie du spectre d’autofluorescence) devant le photomultiplicateur 2 (qui collecte les émissions vertes) et en réduisant l’autofluorescence tissulaire en stockant les tissus fixés pendant 3 jours ou plus dans le cryoprotecteur11. Cependant, les bactéries devraient toujours exprimer au moins quelques milliers de copies par cellule de GFP ou d’autres protéines fluorescentes. D’autre part, des niveaux excessifs de protéines fluorescentes doivent être évités afin de minimiser les coûts de remise en forme qui pourraient conduire à une virulence atténuée23.
La segmentation correcte des bactéries fluorescentes dans les tissus peut être confirmée par l’immunohistochimie des coupes de tissus récupérées après l’imagerie. Plus précisément, les objets colorés avec un anticorps contre les composants de surface bactériens tels que le lipopolysaccharide peuvent être alignés avec l’image de fluorescence obtenue par tomographie STP (Figure 5). Il est important de noter que certaines cellules colorées de Salmonella sont dépourvues de protéines fluorescentes et donc de fluorescence détectable à la fois en microscopie confocale et en tomographie STP. Ces cellules sont des Salmonella qui ont été tuées par le système immunitaire de l’hôte, comme le démontrent le tri cytométrique en flux et les cultures de croissance à partir de cellules triées uniques, ainsi que la corrélation étroite entre le nombre d’unités formant des colonies sur les plaques de gélose et le nombre de cellules fluorescentes de Salmonella , déterminée par cytométrie en flux24. De plus, la perte de plasmide peut entraîner la formation de cellules viables non fluorescentes, ce qui doit être testé par placage sur des milieux avec et sans antibiotiques appropriés correspondant au marqueur de sélection sur le plasmide. Pour les plasmides dérivés de pSC101, la perte de plasmide in vivo est rare19. Pour la plupart des cassettes d’expression chromosomiquement intégrées telles que sifB ::gfp utilisées dans11, la perte d’expression est indétectable in vivo. Si la segmentation n’est pas cohérente avec les données d’immunohistochimie, le pipeline de segmentation doit être modifié.
La résolution de la tomographie STP est insuffisante pour résoudre les cellules bactériennes individuelles au sein de microcolonies densément tassées. Cependant, l’intensité totale de fluorescence de la microcolonie permet d’estimer le nombre de cellules Salmonella . Cela nécessite une souche fluorescente avec des niveaux de fluorescence très homogènes tels que Salmonella sifB ::gfp11. La combinaison du nombre estimé de cellules de Salmonella pour toutes les microcolonies et les cellules individuelles permet d’obtenir des charges tissulaires bactériennes totales qui sont compatibles avec d’autres méthodes telles que le placage ou la cytométrie en flux des homogénats tissulaires11. Le placage et la cytométrie en flux ne peuvent pas être effectués directement à partir des mêmes tissus car ils doivent être fixés par perfusion pour la tomographie STP. Au lieu de cela, ils doivent être faits avec des animaux supplémentaires qui ne sont pas fixes. Si les charges bactériennes médianes déterminées par les différentes approches diffèrent de plus de 3 fois, la viabilité des bactéries fluorescentes pourrait être compromise (dans le cas d’unités formant des colonies inférieures) ou certaines bactéries pourraient avoir perdu la construction du rapporteur fluorescent (dans le cas d’unités formant des colonies supérieures). Une expérience de contrôle sera nécessaire pour identifier la source de ces écarts.
La tomographie STP permet de localiser les cellules bactériennes dans la structure 3D des tissus infectés. Les signaux de la deuxième harmonique du collagène fournissent des repères anatomiques tels que les artères et les trabécules. De plus, les cellules hôtes peuvent être colorées in vivo en injectant un anticorps aux marqueurs de surface avant la perfusion (Figure 5 et Figure 6). Cette coloration fournit des repères supplémentaires pour les compartiments tissulaires et les microenvironnements spécifiques, y compris les foyers d’inflammation (les marqueurs intracellulaires et certains compartiments avec des barrières de diffusion, tels que la splénique, la pulpe blanche ou le cerveau, ne sont pas facilement accessibles, adaptés à cette coloration in vivo ). Cette approche a révélé que la pulpe splénique blanche est un compartiment tissulaire qui permet la survie à long terme de Salmonella pendant la chimiothérapie antimicrobienne11.
Enfin, la réplication de Salmonella à des taux modérés ou lents peut être identifiée et localisée dans la structure 3D des tissus à l’aide de souches qui expriment timerbac, un rapporteur unicellulaire pour le taux de réplication11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Figure 1 : Procédure d’imagerie de l’organe entier à l’aide de la tomographie à deux photons en série (STP). (A-B) L’organe est prélevé après une perfusion transcardique et stocké pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C. (C-E) L’organe est incorporé dans de l’agarose oxydée et réticulé, puis le tissu est scanné et tranché à l’aide de la tomographie STP. Les tranches sont collectées pour l’immunohistochimie ultérieure. (F-J) Pipelines d’analyse computationnelle pour la quantification du nombre de bactéries, la confirmation des bactéries fluorescentes et la reconstruction 3D des positions bactériennes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Figure 2 : Configuration de la tomographie en série à deux photons (STP). (A) Tomographe qui intègre (B) l’imagerie à 2 photons avec (C) la section automatisée des tissus en série. (D) Coupes de tissu collectées pour des investigations de suivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Figure 3 : Couture des carreaux et correction de l’éclairage. Les tuiles sont assemblées et l’éclairage inégal est corrigé à l’aide de distributions d’intensité corrigées à l’aide de la minimisation d’énergie régularisée (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Figure 4 : Segmentation de Salmonella exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) à l’aide d’une machine à vecteurs de support (SVM) et d’un réseau neuronal convolutif (CNN). (A) Images représentatives d’objets GFP segmentés par SVM (à gauche) et images correspondantes (à droite) avec régions segmentées par SVM (Barre d’échelle : 10 μm). (B) Distribution des valeurs en grappes rouge-vert-bleu (RVB) pour les régions segmentées. (C) Images représentatives d’objets non-GFP faussement identifiés par la SVM comme des bactéries (à gauche). CNN les rejette correctement en tant qu’arrière-plan (à droite, barre d’échelle : 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Figure 5 : Détection de Salmonella exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) par tomographie et confirmation par immunohistochimie. Images de la même section acquises par tomographie (à gauche) ou microscopie confocale après coloration avec un anticorps contre le lipopolysaccharide de Salmonella (à droite). Les neutrophiles (en rouge) ont été colorés par injection in vivo d’un anticorps anti-Ly-6G marqué en PE avant la perfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Figure 6 : Reconstruction 3D et localisation de Salmonella dans la rate de souris infectée. (A) Reconstruction tridimensionnelle (3D) d’une tranche de rate de 5 mm d’épaisseur et colorée in vivo avant perfusion avec un anticorps anti-CD169 (rouge). Le signal bleu représente le collagène détecté par les secondes harmoniques. (B) Un plan optique de la pile 3D illustrée en (A). Les positions des cellules ou microcolonies de Salmonella sont indiquées par des étoiles. (C) Reconstruction 3D des positions de Salmonella (étoiles) dans le foie infecté. Les artères sont visibles grâce à leurs gaines de collagène (bleu). Barre d’échelle : 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons ici une procédure qui permet de détecter les bactéries pathogènes à l’échelle de l’organe pendant l’infection et de quantifier les activités des rapporteurs fluorescents.

Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Les infections bactériennes sont une menace majeure pour la santé humaine. La résistance aux antimicrobiens augmente et il n’existe toujours pas de vaccins contre plusieurs agents pathogènes majeurs. Pour identifier de nouvelles pistes pour les stratégies de contrôle, nous devons en savoir plus sur la façon dont les agents pathogènes réagissent au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques in vivo dans les tissus infectés.Les bactéries survivantes peuvent provoquer des rechutes si les antimicrobiens ne parviennent pas à éradiquer une infection. À l’aide de la tomographie en série, nous montrons que la fièvre typhoïde causant la salmonelle peut persister pendant le traitement dans une partie spécifique de la rate. L’inflammation est faible dans cette région, ce qui perturbe la synergie critique entre les antibiotiques et l’inflammation pour une élimination efficace.Les bactéries sont des objets de taille micrométrique. Il est difficile de localiser de si petits objets dans leur contexte tissulaire. La tomographie à deux photons en série peut détecter une seule bactérie dans des organes de taille centimétrique et déterminer son taux de réplication.Nous pouvons également détecter les cellules immunitaires, telles que les neutrophiles, et déterminer leur relation spatiale avec les bactéries. Nous étudions les activités des antibiotiques bactériostatiques. Ces antibiotiques peuvent guérir les infections, bien qu’ils ne puissent qu’inhiber la croissance bactérienne sans tuer l’agent pathogène.Nous déterminons également la propagation de mutants bactériens dépourvus de certains facteurs de virulence, et l’impact des défauts immunitaires sur l’infection et le traitement.

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