Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Ce protocole décrit le flux de travail pour obtenir des macrophages dérivés des monocytes (MDM) à partir d’échantillons de sang humain, une méthode simple pour introduire efficacement des rapporteurs de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) de caspase inflammatoire dans le MDM humain sans compromettre la viabilité et le comportement des cellules, et une approche basée sur l’imagerie pour mesurer l’activation des caspases inflammatoires dans les cellules vivantes.

Ce protocole est important car il peut être utilisé pour visualiser et interroger la voie inflammatoire de la caspase au niveau moléculaire dans les cellules vivantes dans un état pathologique particulier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour identifier les composants, les besoins et la localisation des complexes d’activation de la caspase inflammatoire dans les cellules immunitaires primaires. Avec des optimisations mineures, cette méthode peut être adaptée à d’autres cellules primaires et à une gamme de protéines activées par oligomérisation, et son applicabilité ne se limite pas aux méthodologies microscopiques.

Tout d’abord, aspirez les milieux de macrophages entièrement différenciés sur de la vaisselle de 10 centimètres et lavez la monocouche cellulaire avec un milieu RPMI-1640 sans sérum chaud, en éliminant complètement tous les milieux. Récoltez les cellules en ajoutant deux millilitres de solution chaude de trypsine-EDTA à 0,25% par plat de 10 centimètres. Pipettez doucement la trypsine-EDTA de haut en bas sur tout le plat avec une micropipette P-1000, puis transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de culture complet chaud.

Vérifiez le détachement des cellules sous un microscope à champ lumineux et détachez-vous à nouveau si nécessaire. Aspirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de PBS stérile 1X préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, prenez une aliquote de 20 microlitres pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Prendre une à deux fois 10 à la cinquième cellule par transfection et les placer dans un tube de 15 millilitres. Porter à un volume final de 15 millilitres avec pbS stérile 1X préchauffé. Aspirer le PBS et centrifuger une fois de plus pendant une minute à 250 x g.

Retirez tout PBS résiduel de la pastille de cellule à l’aide d’une micropipette P-200. Prenez un microtube stérile de 1,5 millilitre par transfection et ajoutez le plasmide rapporteur approprié et les plasmides BiFC caspase dans le capot. Placez la station de pipette, l’appareil, les embouts, les tubes d’électroporation et la pipette dans une hotte à écoulement laminaire stérile.

Connectez et allumez le dispositif de nucléofection. Entrez les paramètres de transsection dans l’écran de démarrage affiché. Appuyez sur Tension, entrez 1000 et appuyez sur Terminé pour le régler sur 1000 volts.

Appuyez sur Largeur, entrez 40 et appuyez sur Terminé pour régler l’impulsion sur 40 millisecondes. Enfin, appuyez sur Pulses, entrez 2 et appuyez sur Done pour définir le nombre d’impulsions électriques sur 2. Prenez l’un des tubes d’électroporation et remplissez-le de trois millilitres de tampon électrolytique E à température ambiante.

Insérez le tube d’électroporation dans le porte-pipette de la station de pipette, en vous assurant que l’électrode sur le côté du tube est orientée vers l’intérieur et qu’un bruit de clic se fait entendre lorsque le tube est inséré. Prenez la pastille de cellule et ajoutez 10 microlitres de tampon R de remise en suspension préchauffé pour chacune des deux fois 10 à la cinquième cellule, et mélangez doucement avec une micropipette P-20. Ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire à chaque tube de transfection et mélanger doucement avec une micropipette P-20.

Insérez une pointe dans la pipette en appuyant sur le bouton-poussoir jusqu’au deuxième arrêt, en vous assurant que la pince capte complètement la tige de montage du piston dans la pointe. Ensuite, appuyez sur le bouton-poussoir de la pipette jusqu’au premier arrêt et plongez dans le premier tube contenant un mélange d’ADN cellulaire ou plasmidique pour aspirer l’échantillon. Insérez la pipette avec l’échantillon très soigneusement dans le porte-pipette, en vous assurant que la pipette clique et est placée de manière appropriée.

Appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile et attendez que les impulsions électriques soient délivrées. Retirez lentement la pipette de la station et ajoutez immédiatement la suspension de cellule transectée dans le puits correspondant avec le milieu sans antibiotique préchauffé en appuyant lentement sur le bouton-poussoir jusqu’au premier arrêt. Bercez doucement la plaque avec des cellules transectées et incubez pendant une à trois heures dans un incubateur de culture tissulaire humidifié, puis ajoutez 200 microlitres de milieu de culture préchauffé à chaque puits.

Placez le plat dans l’incubateur et prévoyez au moins 24 heures pour l’expression des gènes. Le lendemain, inspectez la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Retirez soigneusement le milieu des cellules avec une micropipette P-1000 et ajoutez 500 microlitres de la solution de stimulus sur le côté du puits.

Pour faire fonctionner des puits de contrôle non traités, ajoutez un milieu d’imagerie sans le stimulus. Pour visualiser les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal, allumez le microscope et la source de lumière fluorescente en suivant les instructions. Sélectionnez l’objectif 10 fois ou 20 fois et placez la boîte de culture sur la scène du microscope.

Trouvez des cellules sous le filtre de 568 nanomètres avec l’oculaire. Et concentrez-vous sur les cellules exprimant les globules rouges rapporteurs. Comptez tous les globules rouges dans le champ visuel.

Lorsque vous êtes dans le même champ visuel, passez aux filtres 488 ou 512, comptez le nombre de globules rouges qui sont également verts. Comptez au moins 100 globules rouges d’au moins trois champs. Calculez le pourcentage de cellules transectées Vénus positive par champ visuel et faites la moyenne des pourcentages résultants pour chaque puits de traitement afin d’obtenir l’écart-type.

Pour imager les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocale, visualisez l’image en direct des cellules sur l’écran de l’ordinateur telle qu’elle a été acquise par la caméra. Affinez la mise au point et la position des cellules à l’aide de la commande du joystick et de la molette de mise au point. Réglez le pourcentage de puissance laser et le temps d’exposition pour les lasers de 512 nanomètres ou 488 nanomètres et 568 nanomètres, de sorte que le signal dans l’image soit bon sans saturation.

Activez la capture en direct et examinez l’image résultante, en vous assurant qu’un pic distinct est visible pour chaque étage dans les histogrammes d’affichage des deux canaux. Tout en visualisant l’image en direct des cellules, prenez plusieurs images représentatives d’un champ qui contient une ou plusieurs cellules exprimant le rapporteur mCherry ou dsRedmito pour chaque puits de la plaque. Des monocytes CD-14 positifs sélectionnés incubés avec du GM-CSF pendant sept jours ont montré des changements dans la morphologie cellulaire au cours de la période de différenciation, passant de cellules de suspension sphériques à des cellules filiformes et complètement attachées, et enfin, à des cellules plus étalées lorsqu’elles sont complètement différenciées.

Des cellules entièrement différenciées ont été transectées avec les paires de caspase BiFC VC et VN ainsi que le plasmide rapporteur dsRedmito, qui a été utilisé pour marquer les cellules transectées. Les cellules non traitées n’ont montré aucune fluorescence de Vénus. Et dans les cellules traitées à la nigéricine, la caspase-1 BiFC est apparue comme un seul punctum avec la forme typique des taches ASC.

La quantification du MDM Vénus positif a montré que le pourcentage le plus élevé de caspase-1 BiFC est observé dans le groupe de traitement LPS plus nigericine. Sur le titrage plasmidique des paires caspase-1, 4 et 5 pro-BiFC, le pourcentage le plus élevé de cellules Vénus positives a résulté de 400, 500 et 1 000 nanogrammes de plasmide transecté, respectivement. Des images confocales obtenues avec un objectif 20 fois d’un champ de cellules 24 heures après la transsection ont montré que les cellules transectées non traitées sont viables car les mitochondries sont intactes.

Après traitement par hème, le complexe caspase-1 apparaît comme un seul punctum vert similaire à celui induit par la nigericine. N’oubliez pas d’éviter les conditions difficiles et la manipulation excessive des cellules pendant la différenciation, la transfection et le traitement, car cela peut entraîner une activation spontanée et des niveaux de fond élevés d’activation de la caspase.