Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

L’objectif global de cette procédure est d’analyser avec précision la quantité et la structure de chaque espèce de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lipides relatives à la biologie des lipides et aux lipides. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons caractériser une variété d’espèces de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques par chromatographie et spectrométrie de masse. Pour commencer, retirez le milieu de culture d’une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres contenant des cellules HeLa et rincez les cellules deux fois avec six millilitres de PBS glacé.

Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé dans la boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les cellules. Une fois retirées de la surface de la parabole, transférez les cellules dans deux tubes en plastique siliconé d’un millilitre. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de méthanol à chaque pastille de cellule.

Ensuite, faites brièvement tourbillonner les tubes. Ensuite, placez les échantillons dans un sonicateur de type bain et sonifiez à 200 watts pendant cinq minutes. Une fois terminé, transférez l’homogénat entier de la cellule dans des tubes à essai équipés de bouchons à vis doublés de téflon.

Ajoutez maintenant un millilitre de méthanol, un millilitre de chloroforme, 0,8 millilitre d’eau distillée double dans 50 microlitres de 10 micromolaires d’un étalon interne dans chaque tube à essai. Bouchez les tubes et agitez-les vigoureusement à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite un millilitre supplémentaire de chloroforme et un millilitre d’eau distillée double dans chaque tube.

Encore une fois, faites tourbillonner vigoureusement les tubes à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez les échantillons afin de séparer complètement les phases aqueuse et organique. Transférez la phase inférieure dans des tubes en verre jetables.

Ajoutez deux millilitres de chloroforme dans les tubes à essai. Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement les tubes à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante pour les mélanger suffisamment avec la phase supérieure et les peluches interphasaires. Après une deuxième centrifugation, transférez la phase inférieure modifiée dans les tubes en verre jetables avec la phase inférieure initiale.

Placez maintenant les tubes de verre sous un jet d’azote pendant environ 60 minutes et éliminez complètement les solvants organiques dans la phase inférieure collectée. Enfin, reconstituez les échantillons avec 500 microlitres de méthanol ou d’éthanol. Filtrez le mélange obtenu avec un filtre de 0,02 micron dans des flacons en verre.

Conservez ensuite l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Effectuez des dilutions en série du composé standard et ajoutez 50 microlitres de chaque concentration dans des tubes à essai séparés. Ensuite, préparez trois échantillons de contrôle qualité en ajoutant une quantité dans les trois fois la limite inférieure de la courbe standard au premier échantillon, une quantité près du centre de la courbe pour le deuxième échantillon et une quantité près de la limite supérieure de la courbe standard pour le troisième échantillon.

Ajoutez ensuite l’homogénat cellulaire dans un millilitre de méthanol dans chaque tube à essai et extrayez la fraction lipidique totale de chaque échantillon en utilisant la méthode qui vient d’être montrée. Pour commencer, préparez la phase mobile. Mélangez de l’acétonitrile, du méthanol et de l’eau distillée à un rapport de deux à deux pour un pour la phase aqueuse.

Utilisez de l’isopropanol pour la phase organique dans des bouteilles en verre avec des bouchons à vis doublés de téflon. Ensuite, sonicez les deux phases mobiles pendant cinq minutes dans un sonicateur de type bain. Ajoutez ensuite de l’acide formique à une concentration finale de 26,4 millimolaires et de l’hydroxyde d’ammonium à 14,9 millimolaires dans chaque phase mobile.

Pour une analyse qualitative, activez le système de chromatographie liquide à haute performance. Placez les tubes d’entrée dans les bouteilles en verre qui contiennent les phases mobiles et purgez les lignes HPLC. Reliez ensuite une colonne HPLC C18 au système HPLC.

Maintenez la température dans le four à colonne à 50 degrés Celsius et conditionnez la colonne avec la phase mobile aqueuse à 100 microlitres par minute. Pendant le cycle, placez les échantillons dans un support d’échantillons de l’échantillonneur automatique. Définir les paramètres du système de spectrométrie de masse à piège ionique linéaire triple, quadruple et quadruple pour l’analyse par spectrométrie de masse en trois étapes, comme indiqué dans le tableau un et le tableau deux du protocole de texte ci-joint.

De plus, il faut définir les paramètres pour les premier et deuxième ions précurseurs de l’espèce d’intérêt SM, comme décrit plus en détail dans le protocole de texte d’accompagnement. Créez un fichier de lot et soumettez-le pour obtenir les données des spectres d’ions de produit MS trois de chaque espèce de Sphingomyéline par chromatographie liquide, ionisation par ionisation par électronébulisation, analyse spectrométrique de masse en tandem. Obtenir les spectres d’ions de produit MS triphasé de l’espèce d’intérêt Sphingomyelin par chromatographie liquide, ionisation par électronébulisation, analyse par spectrométrie de masse en tandem.

Ensuite, attribuez à chaque MS trois spectres d’ions produits de la Sphingomyéline en comparant le rapport masse/charge des spectres d’ions produits dans la masse exacte de la base à longue chaîne du sphingoïde et de la fraction n-acyle d’intérêt. Analyser quantitativement la sphingomyéline à l’aide de la chromatographie liquide, de l’ionisation par ionisation par électronébulisation, de l’analyse par spectrométrie de masse en tandem, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Traitez ensuite les données de surveillance des réactions multiples à l’aide du logiciel d’intégration des données afin d’obtenir les données de la zone du pic pour le chromatogramme ionique extrait de chaque espèce de Sphingomyeline.

Quantifiez chaque espèce de Sphingomyelin et construisez les courbes standard comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Le spectre de la sphingomyéline synthétisée chimiquement et de la sphingomyéline dans des échantillons lipidiques extraits de cellules HeLa est montré ici. Il convient de noter que l’intensité spectrale de la sphingosylphosphorylcholine déméthylée est supérieure à celle de la fraction n-acyle SM dans les deux échantillons.

Il est également intéressant de noter que le spectre correspondant à la sphingosine-1-phosphate est utile pour spéculer sur le nombre de carbones et de doubles liaisons de la base à longue chaîne sphingoïde de la sphingomyéline. Dans la méthode quantitative actuelle, il est essentiel de préparer avec précision les échantillons pour construire la courbe d’étalonnage afin de valider cette méthode. La courbe d’ajustement de la faible concentration a été nettement améliorée en utilisant le facteur de pondération égal à un sur x au carré par rapport à celui utilisant le facteur de pondération de un ou un sur x.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie et de l’industrie pour caractériser une variété d’espèces de Sphingomyelin dans des échantillons biologiques et des produits industriels tels que les cosmétiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser avec précision la quantité et la structure de chaque espèce de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques. N’oubliez pas que travailler avec des absorbants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une usure appropriée du verre doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

De plus, il est important de porter des gants pour éviter la contamination des lipides dérivés de vos mains.