Name: Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Apprenez une méthode LC-MS pour quantifier et qualifier les espèces de sphingomyéline dans des échantillons biologiques. Cette technique permet une analyse précise des lipides membranaires.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche du ministère de l’Education, Culture, Sports, Science et technologie du Japon (KAKENHI) à K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) et une subvention pour l’étude de morbidité insolubles du ministère de Health, Labour and Welfare (K.Y. #201510032A). Nous remercions le groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet de ce manuscrit.

Consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. Porter des gants pour minimiser la contamination des échantillons de peau dérivés SM. Le présent protocole a été appliqué aux cellules HeLa cultivées dans un milieu essentiel minimum d’aigle additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM L-glutamine, 1 000 U/L la pénicilline et streptomycine 100 mg/L.
1. préparation des échantillons de lipides
Remarque : Il est important que toute la verrerie y compris les tubes à essai avec bouchons à vis téflon sans tensioactifs.
<ol><li>Extraction de la fraction lipidique totale de l’homogénat de cellule à l’aide de la méthode7 Bligh & Dyer<ol>
<li>Supprimer la culture (ou conditionné) médias de la culture de tissu de 10 cm plat et rincer deux fois avec 6 mL de PBS glacée.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de PBS glacée dans le récipient de culture de tissu de 10 cm la pipette P1000. Récolter les cellules avec racleurs de cellule et recueillir dans des tubes en plastique siliconées de 2,0 mL.</li>
		<li>Après centrifugation (1 000 × g, 5 min, 4 ° C), retirer le surnageant par une pipette P1000.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de méthanol. Vortex tubes brièvement et laisser agir à 200 W pendant 5 min dans un sonicateur bain-type. Remarque : Réglez le niveau d’eau dans un sonicateur de bain de type afin que le culot cellulaire est homogénéisé efficacement.</li>
		<li>Transférer l’homogénat de cellule dans le méthanol pipette dans des éprouvettes (13 x 100 mm) avec bouchons à vis recouverts de téflon.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de méthanol, 1 mL de chloroforme, 0,8 mL d’eau bidistillée et 50 µL de 10 µmol/L de d18:1 standard interne /(D31)-16:0 SM dans chaque tube à essai.</li>
		<li>Tubes à essai vortex vigoureusement pendant 5 min à température ambiante. Remarque : À ce stade, une seule phase (chloroforme/méthanol/eau = 0,8/2/1 (v/v/v)) est formé.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de chloroforme et 1,0 mL d’eau bidistillée.</li>
		<li>Tubes vortex vigoureusement à 2 500 tr/min pendant 5 min à température ambiante. Remarque : À ce stade, l’humeur aqueuse (en haut) et organique phase (en bas) est séparé.</li>
		<li>Après centrifugation (2 150 × g, 5 min, 25 ° C), collecter et transférer la phase inférieure dans des tubes de verre jetable (phase initiale inférieure). Remarque : Recueillir la phase inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur et un filtre de sécurité pipette. Introduire l’embout de la pipette dans la phase inférieure, squeeze la petite ampoule à côté de la vanne « E » pour livrer la phase supérieure et interfaciale peluches à l’intérieur de l’embout de la pipette et ensuite siphonner la phase inférieure dans la pipette.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de chloroforme dans les tubes à essai et vortex les tubes vigoureusement à 2 500 tr/min pendant 5 min à température ambiante suffisamment mélanger avec la phase supérieure et peluches interfaciale.</li>
		<li>Après centrifugation (2 150 × g, 5 min, 25 ° C), collecter et transférer la phase inférieure modifiée dans les tubes de verre jetable avec la phase initiale inférieure telle que décrite à l’étape 1.1.10.</li>
		<li>Placer les tubes de verre sous un courant d’azote et de supprimer complètement les solvants organiques dans la phase inférieure collectée.</li>
		<li>Reconstituer les échantillons avec 500 µL de méthanol ou d’éthanol, filtrer avec un filtre de 0,02 µm et stocker dans des flacons en verre à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des échantillons pour construire la courbe d’étalonnage et de validation de la méthode<ol>
<li>Ajouter 50 µL de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 ou 50 µmol/L de composé standard (d18:1 /(D9)-18:1 SM) dans des éprouvettes avec capuchons de téflon.</li>
		<li>Ajouter l’homogénat cellulaire dans chaque tube à essai et ajoute 1 mL de méthanol. Remarque : La quantité d’homogénat cellulaire comme une matrice varie en fonction de chaque expérience. Si l’espèce SM dans des échantillons provenant de cellules dans une boîte de Petri de 10 cm est systématiquement analysés, le montant de l’homogénat cellulaire dans chaque tube à essai devrait être proche de celle des cellules dans une boîte de Petri de 10 cm.</li>
		<li>Extraire la fraction lipidique total tel que décrit dans les étapes 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Préparer les (QC) échantillons de contrôle de qualité pour la validation de la méthode décrite dans les étapes 1.2.1-1.2.3. Préparer les trois échantillons QC avec différentes concentrations de composé standard (d18:1 /(D9)-18:1 SM) : un délai de 3 x la limite inférieure de la courbe d’étalonnage (QC-basse, QC-L), un près du Centre (QC-middle, QC-M) et l’autre près de la limite supérieure de la courbe d’étalonnage (QC-haute, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analyse par LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Préparation de la phase mobile<ol>
<li>Mélanger les solvants (acétonitrile/méthanol/FD2O = 1/2/2 (v/v/v) pour la phase aqueuse et l’isopropanol pour la phase organique) en bouteilles avec bouchons à vis téflon en verre et laisser agir pendant 5 min dans un sonicateur bain-type.</li>
		<li>Ajouter de l’acide formique (concentration finale 26,4 mmol/L) et NH4OH (14,9 mmol/L) dans chaque phase mobile.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse qualitative du SM par LC-ESI-MS3<ol>
<li>Activer le système de chromatographie liquide (HPLC) haute performance, mettre les tubes d’entrée dans les bouteilles en verre qui contiennent des phases mobiles et purger les lignes HPLC. Une colonne HPLC C18 (longueur de 100 mm × 1,5 mm i.d., particule taille 3,0 µm) un lien vers le système de CLHP, maintenir la température dans le four à colonne à 50 ° C et conditionner la colonne avec la phase mobile aqueuse à 100 µL/min. Placer les échantillons dans un rack d’échantillon dans l’autosampl cateur.</li>
		<li>Définissez les paramètres du quadripôle linéaire piège à ions spectrométrie de masse système pour MS3 analyse figurant dans le tableau 1 et tableau 2 ainsi que le précurseur de la première et la deuxième les ions des espèces d’intérêt SM et triple quadripôle.<ol>
<li>Double-cliquez sur l’icône du logiciel d’acquisition de données, double-cliquez sur la « Configuration matérielle », sélectionnez « LC + QTRAP4500 + Valve » et cliquez sur « Activer le profil ».</li>
			<li>Créez un sous-dossier en cliquant sur « Nouveau sous-projet » et « OK ».</li>
			<li>Cliquez sur l’onglet « fichier », sélectionnez « Nouveau » et sélectionnez « Méthode de l’Acquisition » et « OK ». Cliquez sur l’icône « Mass Spec » et « MS » onglet sélectionner Scan type comme « MS/MS/MS (MS3) », analyse taux comme 10 000 Da/s, la polarité comme « Négatif » et « Duration » en tout temps être analysée (min). La valeur m/z « Débutent (Da) » et « Stop (Da) » comme la gamme à numériser. La valeur m/z des ions précurseurs de 1ère et 2ème de la cible des espèces d’intérêt SM. Remarque : Pour analyser les multiples espèces de SM, mettez en surbrillance le '-MS3' icône, faites un clic droit, sélectionnez « Copier cette expérience » et puis mettre les m/z des 1er et 2e ions précurseurs d’autres espèces de SM.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet « Avancé MS » et définir chaque paramètre comme suit : mode de balayage comme « Profil », taille d’étape que 0,12 (Da), résolution Q1 et Q3 « Unité » et « Éclairée », respectivement, seuil d’intensité dans le temps de réglage 0, 50 (ms), Pause entre les plages de massives que 1,5 ms, sélectionnez ' Dynamic remplir le temps ', barrière à l’entrée Q3 8 V et temps d’Excitation que 25 ms.</li>
			<li>Cliquez sur le bouton « Modifier les paramètres » dans l’onglet « MS » et sélectionnez « Source/gaz » onglet réglez les paramètres du gaz de Rideau, gaz de collision, ionspray tension, température, ion source gaz1 et gas2 comme indiqué au tableau 1. Puis sélectionnez l’onglet « Compound ». Réglez les paramètres de la declustering potentiel, potentiel d’entrée, énergie de collision, énergie d’excitation et énergie de collision se propager comme figurant au tableau 2.</li>
			<li>Mettez en surbrillance « Vanne intégrée de Valco » et sélectionnez « nom de Position pour l’étape 0' a et définissez « B » comme position pour total temps min 5,0. Aussi la valeur « A » comme position pour total temps 70,0 min.</li>
			<li>Mettez en surbrillance « Système de Shimadzu LC ». Sélectionnez l’onglet « Pompe » et mode de pompage comme débit binaire, le débit total 0,28 mL/min, et maximum de limites de pression comme 20,0 MPa. Sélectionnez l’onglet « Échantillonneur automatique » et régler le volume de rinçage comme 200 µL, needle AVC comme 52 mm, vitesse 35 µL/s de rinçage, dégustation de vitesse 5,0 µL/s, purge temps que 25,0 min, rincer temps trempette comme 5 s et le mode de rinçage comme « Avant et après aspiration ».<ol>
<li>En outre, permettre au groupe refroidisseur, régler la température plus froide que 4 ° C et la course de l’aiguille contrôle flacon comme mm 52. Sélectionnezl ' onglet « Four », activer le four et régler la température du four et la température maximale 50 ° C et 85 ° C, respectivement.</li>
				<li>Sélectionnez l’onglet « Controller » et cochez la case « Sous tension ». Sélectionnez l’onglet « Programme » et définissez les gradients de solvants comme suit : solvants A / B à un ratio de 100/0 pendant 5 min, programme des altérations linéaires à 80/20 pendant 4 min, 35/65 pendant 50 min et à 25/75 pendant 1 min après , tenez-les à 25/75 pendant 10 min, puis linéairement à 100/0 pendant 4 min. Puis enregistrez la méthode.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Créer le fichier de commandes<ol>
<li>Double-cliquez sur l’icône « Construire Acquisition lot », cliquez sur « Ajouter Set », « Ajouter des Samples », définissez le nombre de nouveaux échantillons, puis cliquez sur « OK ».</li>
			<li>Cliquez sur le bouton "Method Editor" et sélectionnez la méthode à utiliser. Si plusieurs méthodes sont utilisées dans un fichier de commandes, cochez la case « Utiliser plusieurs méthodes » et sélectionnez la méthode d’acquisition pour chaque échantillon. Renommer « Nom de l’échantillon », définir le nombre approprié de « Position flacon » et précisez le montant du volume d’injection. Puis enregistrez le fichier de commandes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Se procurer le produit de3 MS spectres des espèces d’intérêt SM par LC-ESI-MS3 analyse<ol>
<li>Sélectionnez l’onglet « Soumettre » dans le fichier de commandes, sélectionnez la ligne des échantillons à analyser et cliquez sur le bouton « Soumettre ».</li>
			<li>Cliquez sur la '' vue que ', « Stabiliser » icône, sélectionnez la méthode d’acquisition à servir, régler l’heure que 1 min et cliquez sur « OK ».</li>
			<li>Désactiver « Instrument de réserve pour Tuning » en cliquant sur l’icône correspondante. Puis exécuter la séquence de traitement par lots en cliquant sur l’icône « Échantillon de commencer ».</li>
		</ol>
</li>
		<li>Assignez à chaque MS3 spectres ion produit du SM en comparant la masse de facturer ratio (m/z) du produit spectres et la masse exacte de le SPHINGOÏDES LCB et N-groupement acyle d’intérêt. Déterminer le nombre de carbones et de doubles liaisons dans la SPHINGOÏDES LCB et N-groupement acyle selon les ions produits correspondants.<ol>
<li>Confirmez que le dossier de sous-projet approprié est sélectionné, puis double-cliquez sur l’icône « Open Data File » et prélever des échantillons à analyser. Faites glisser la pointe dans le chromatogramme pour chaque cible espèces SM et puis double-cliquez sur. Les obtenus spectres MS3 produit ion au sein de la zone déplacée seront présentés.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse quantitative du SM par LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Définir les phases mobiles et colonne CLHP comme indiqué au point 2.1 et 2.2.1.</li>
		<li>Définissez les paramètres de la triple quadripôle et quadripôle linéaire piège à ions système de spectrométrie de masse pour plusieurs réaction suivi analyse (MRM), telles qu’énumérées dans le tableau 1 et tableau 2.<ol>
<li>Effectuer les procédures comme indiqué au point 2.2.2.1 et 2.2.2.2.</li>
			<li>Cliquez sur l’onglet « fichier », sélectionnez « Nouveau » et sélectionnez « Méthode de l’Acquisition » et « OK ». Cliquez sur l’icône « Mass Spec » et « MS » onglet sélectionner Scan type comme « MRM », polarité comme « Positif ». Comme tout le temps d’analyser la valeur « Duration ». Définir la m/z de [M + H]+ et 184 comme « Masse de Q1 (Da) » et « Masse Q3 (Da) » de la cible des espèces de SM d’intérêt, respectivement. Définir « Temps » comme 10 ms et « ID » comme nom de la cible espèces SM.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet « Avancé MS » et définir chaque paramètre comme suit : les deux de la résolution Q1 et Q3 comme « Cible », seuil d’intensité comme 0, réglage heure 0 (ms) et de Pause entre les plages de massives comme 5 ms.</li>
			<li>Cliquez sur le bouton « Modifier les paramètres » dans l’onglet « MS » et sélectionnez l’onglet « Source/essence ». Placez le paramètre de gaz de Rideau, gaz de collision, ionspray tension, température, ion source gaz1 et gas2 comme indiqué au tableau 1. Sélectionnez ensuite l’onglet « Aliments composés » mettre les paramètres de declustering potentiel, potentiel d’entrée, énergie de collision et collision cellule sortie potentiel telles qu’énumérées dans le tableau 2.</li>
			<li>Placez la vanne comme indiqué au point 2.2.2.6.</li>
			<li>Définir la condition de LC tel que décrit à l’étape 2.2.2.7. Puis enregistrez la méthode.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Créer le fichier de commandes comme indiqué au point 2.2.3.</li>
		<li>Obtenir les données MRM de chaque espèce de SM par analyse LC-ESI-MS/MS comme indiqué au point 2.2.4.</li>
		<li>Traiter les données MRM à l’aide du logiciel d’intégration de données et d’obtenir les données de l’aire des pics pour le chromatogramme de l’extrait d’ion de chaque espèce de SM.<ol>
<li>Double-cliquez sur l’icône du logiciel d’intégration de données dans l’analyse quantitative, cliquez sur l’onglet « Modifier » et sélectionnez l’utilisateur intégration par défaut. Gaussienne de largeur lisse comme 1,0 point, puis cliquez sur « OK ». Cliquez sur l’onglet « Modifier » et sélectionnez « Nouvelle Table de résultats ». Sélectionner l’échantillon à s’intégrer, cliquez sur un bouton fléché et cliquez sur « Suivant ». Sélectionnez « Créer Nouvelle méthode », le nom de la méthode de la valeur et cliquez sur « Suivant ». Cliquez sur « Suivant » et cochez la case de d18:1 /(D31)-16:0 SM en l’État, cliquez sur « Suivant », puis cliquez sur « Terminer ».</li>
			<li>Cliquez sur « Affiche la revue PIC » et confirmez que les pics du chromatogramme sont dûment reconnus. Il est à noter que le temps de rétention de d18:1 /(D31)-16:0 SM est généralement plus petit par ~ min 0,3 par rapport à celle de la SM de 34-1 (habituellement se compose de d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantifier à chaque espèce de SM selon le ratio de la crête de chaque espèce de SM à la d18:1 /(D31)-16:0 étalon interne SM.<ol>
<li>Cliquez sur l’onglet « Fichier », sélectionnez « Exporter », sélectionnez « Tableau des résultats », de confirmer le format « MultiQuant », colonnes, comme « Exporter toutes les colonnes », rangées comme « Toutes les lignes sauf celles explicitement dissimulées à l’exportation », puis cliquez sur « OK ».</li>
			<li>Ouvrez le fichier exporté dans le logiciel Excel. Normaliser la zone de la cible espèces SM de la zone de IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Puis multiplier par la quantité théorique de l’IS de l’échantillon injecté pour calculer le montant de cible espèces SM dans l’échantillon injecté.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Construire la courbe d’étalonnage<ol>
<li>Obtenir les données MRM de d18:1 /(D9)-18:16-/(D31) SM et d18:1 1:0 SM dans les échantillons pour construire la courbe d’étalonnage par analyse LC-ESI-MS/MS, comme décrit dans l’étape 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obtenir les données de la surface du pic de d18:1 /(D9)-18:16-/(D31) SM et d18:1 1:0 SM comme indiqué au point 2.3.5.</li>
		<li>Calculer la quantité de d18:1 /(D9)-18:1 SM dans l’échantillon injecté comme décrit dans étape 2.3.6.</li>
		<li>Construire la courbe de tendance, en définissant les axes x et y que le montant nominal et calculez le montant des d18:1 /(D9)-18:1 SM et obtenir la formule de courbe de tendance.</li>
	</ol></li>
	<li>Validation de la méthode quantitative à l’aide du logiciel Excel<ol>
<li>Pour la validation de la méthode, quantifier la quantité de d18:1 /(D9)-18:16-/(D31) SM et d18:1 1:0 SM dans le QC échantillons en analysant chaque QC goûter au moins trois fois en 1 jour et répéter au moins 3 jours, tel que décrit dans l’étape 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obtenir les données de zone maximale et calculer le montant de d18:1 /(D9)-18:1 SM dans l’échantillon injecté comme décrit dans étape 2.3.5 et 2.3.6.</li>
		<li>Selon la courbe d’étalonnage obtenue, calculer le montant de d18:1 /(D9)-18:1 SM dans l’échantillon injecté.</li>
		<li>Évaluation de la précision<ol>
<li>Calculer la moyenne et l’écart type d’un montant de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtenu à l’étape 2.5.3 sur le dataset de la journée-intra et inter-jour à l’aide du logiciel Excel.</li>
			<li>La moyenne obtenue à l’étape 2.5.4.1 est divisée par l’écart-type et exprimée en %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Évaluation de précision<ol>
<li>Calculez la précision de chaque donnée comme suit : [(Le montant calculé obtenu à l’étape 2.5.3.) / (Montant nominal) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calculer la moyenne de la valeur absolue de la précision sur le dataset de l’intra et inter-jours.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Dans la présente méthode qualitative, nous avons obtenu MS3 ions produits un CCP et un N-groupement acyle. Il est essentiel d’affecter correctement un SPC tant un N-groupement acyle. À cette fin, il convient de noter que les autres molécules contenant de phosphorylcholine peuvent également être détectés sous forme d’ions de produit3 MS. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) et plasmalogène-PC sont abondamment présents dans les cellules de mammifères et leur hydrophobicité est similaire à...

Sphingomyéline (SM) est un SPHINGOLIPIDE commune dans les cellules de mammifères. SM est synthétisée dans les cellules1 et présent comme un précurseur pour les autres sphingolipides comme une sphingosine-1-phosphate et un céramide, qui ont un rôle crucial en immunitaire cellulaire traite et barrière l’homéostasie, respectivement2, de la peau 3. Ainsi, l’analyse précise du métabolisme SM est importante pour élucider les rôles physiologiques et pathologiques des sphingolipides.
SM est composé d’un céramide et une phosphorylcholine qui est liée au groupe hydroxy-1 de la céramide, qui regroupe plus d’une sphingosine et un N-groupement acyle. Une variété du nombre de carbone et la double liaison dans la sphingosine et N-groupement acyle résulte en l’espèce nombre de céramide (et SM). Les progrès récents dans LC-ESI-MS/MS a permis une analyse quantitative et qualitative des SM4,5. Dans l’analyse qualitative, le nombre de carbone et de doubles liaisons d’un SPHINGOÏDES LCB de SM a été identifiés en assignant des spectres ion produit de LCB. Cependant, information structurale de la N-groupement acyle ne provient pas directement car ses ions produit correspondant n’a été signalées et par conséquent N-groupements acyles sont déduites par l’analyse différentielle entre les ions précurseurs et ions produits correspondant à la LCB dans les deux modes d’ions positifs et négatifs4,5. Dans ce rapport, nous présentons une méthode pour détecter les ions produit de LCB et N-groupement acyle simultanément en mode de3 MS à l’aide de triple quadripôle et spectrométrie de masse linéaire piège ionique quadripolaire, qui facilite la construction précise spéculation de chaque espèce de SM6.
Les effets de suppression (ou amélioration) ion causées par la matrice dans des échantillons biologiques entravent la quantification précise dans l’analyse de LC-ESI-MS, et par conséquent, il est souhaitable de construire les courbes d’étalonnage pour tous les analytes d’intérêt dans la matrice identique de l’échantillon biologique. Toutefois, cette stratégie n’est pas possible car il est presque impossible de préparer toutes les espèces de SM dans des échantillons biologiques, en particulier dans l’analyse complète. Ainsi, il est pratique de construire une courbe d’étalonnage et déterminer l’échelle quantitative à l’aide d’une espèce représentative de SM dopée dans les échantillons biologiques. Nous avons utilisé deux espèces de SM isotopiquement étiquetés pour établir une courbe d’étalonnage ; a été utilisé pour un étalon interne et l’autre pour un standard composé. Nous avons détecté une petite quantité d’espèces de SM isotopiquement étiquetés comme un composé standard dopés dans des échantillons biologiques et a réussi à obtenir une courbe d’étalonnage et le quantitatif rang6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Racleur à cellules</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Tube siliconé de 2,0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon à vis doublé de téflon</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Tube en verre jetable</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro ; m 1,5 mm D.I. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>La cartouche Guard est insérée dans le porte-cartouche et reliée à la colonne C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTOUCHE DE GARDE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Porte-cartouche</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (alcool isopropylique)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28 % Eau ammoniacale</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur (type bain)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex pour tube à essai en verre</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1,4 mL flacon en verre</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Les échantillons sont conservés dans un flacon en verre de 1,4 mL scellé par un bouchon à vis et un septum de 8 mm à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Septum 8 mm</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Lors de l’analyse des échantillons, les bouchons à vis sont remplacés par des bouchons à vis avec septum fendu</td></tr><tr><td>Bouchon à vis pour flacon en verre de 1,4 mm</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon à vis avec septum fendu</td><td>Shimadzu</td><td>GLC GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &micro ; m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Spectrométrie de masse à piège ionique linéaire triple quadripôle et quadripôle</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>Le logiciel pour l’acquisition et l’analyse des spectres d’ions de produits</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>Le logiciel pour l’intégration de données dans l’analyse quantitative</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyéline</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>ThermoFisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s support essentiel minimum</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode quantitative et qualitative de sphingomyéline par lc-ms à l’aide de deux stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Nous présentons une méthode d’analyse de sphingomyéline (SM) qualitativement et quantitativement par chromatographie en phase liquide-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (LC-ESI-MS/MS). SM est un SPHINGOLIPIDE commun composé d’une phosphorylcholine et un céramide, appelé le composant hydrophile et hydrophobe, respectivement. Un certain nombre d’espèces de SM est présent dans les cellules de mammifères en raison d’une variété de la SPHINGOÏDES longue chaîne base (LCB) et un N-groupement acyle dans la céramide. Dans ce rapport, nous montrons une méthode d’estimation du nombre de carbone et des doubles liaisons dans une lame et un N-groupement acyle issu de leurs ions correspondants du produit dans les expériences de MS/MS/MS (MS3). En outre, nous présentons une méthode d’analyse quantitative pour SM en utilisant deux stable isotopiquement étiquetés SM espèces, qui facilite la détermination la plage utilisée dans la quantification de la SM. La présente méthode sera utile pour la caractérisation de diverses espèces de SM dans des échantillons biologiques et les produits industriels tels que les cosmétiques.

Synthétisés chimiquement d18:1 / 24:0 cm (Figure 1A) et d18:1 / 24:0 SM dans des échantillons de lipides extraits de cellules HeLa (Figure 1B) ont été analysés par LC-ESI-MS3 employant [M + HCOO]– et [M-CH3]- sous forme d’ions précurseurs de première et seconde, respectivement. Notez que l’intensité du spectre de déméthylé-sphingosylphosphorylcholine (S...

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier et qualifier chaque espèce de sphingomyéline multiple réaction sous contrôle et le mode MS/MS/MS, respectivement.

Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

L’objectif global de cette procédure est d’analyser avec précision la quantité et la structure de chaque espèce de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lipides relatives à la biologie des lipides et aux lipides. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons caractériser une variété d’espèces de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques par chromatographie et spectrométrie de masse. Pour commencer, retirez le milieu de culture d’une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres contenant des cellules HeLa et rincez les cellules deux fois avec six millilitres de PBS glacé.Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé dans la boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les cellules. Une fois retirées de la surface de la parabole, transférez les cellules dans deux tubes en plastique siliconé d’un millilitre. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de méthanol à chaque pastille de cellule.Ensuite, faites brièvement tourbillonner les tubes. Ensuite, placez les échantillons dans un sonicateur de type bain et sonifiez à 200 watts pendant cinq minutes. Une fois terminé, transférez l’homogénat entier de la cellule dans des tubes à essai équipés de bouchons à vis doublés de téflon.Ajoutez maintenant un millilitre de méthanol, un millilitre de chloroforme, 0,8 millilitre d’eau distillée double dans 50 microlitres de 10 micromolaires d’un étalon interne dans chaque tube à essai. Bouchez les tubes et agitez-les vigoureusement à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite un millilitre supplémentaire de chloroforme et un millilitre d’eau distillée double dans chaque tube.Encore une fois, faites tourbillonner vigoureusement les tubes à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez les échantillons afin de séparer complètement les phases aqueuse et organique. Transférez la phase inférieure dans des tubes en verre jetables.Ajoutez deux millilitres de chloroforme dans les tubes à essai. Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement les tubes à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante pour les mélanger suffisamment avec la phase supérieure et les peluches interphasaires. Après une deuxième centrifugation, transférez la phase inférieure modifiée dans les tubes en verre jetables avec la phase inférieure initiale.Placez maintenant les tubes de verre sous un jet d’azote pendant environ 60 minutes et éliminez complètement les solvants organiques dans la phase inférieure collectée. Enfin, reconstituez les échantillons avec 500 microlitres de méthanol ou d’éthanol. Filtrez le mélange obtenu avec un filtre de 0,02 micron dans des flacons en verre.Conservez ensuite l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Effectuez des dilutions en série du composé standard et ajoutez 50 microlitres de chaque concentration dans des tubes à essai séparés. Ensuite, préparez trois échantillons de contrôle qualité en ajoutant une quantité dans les trois fois la limite inférieure de la courbe standard au premier échantillon, une quantité près du centre de la courbe pour le deuxième échantillon et une quantité près de la limite supérieure de la courbe standard pour le troisième échantillon.Ajoutez ensuite l’homogénat cellulaire dans un millilitre de méthanol dans chaque tube à essai et extrayez la fraction lipidique totale de chaque échantillon en utilisant la méthode qui vient d’être montrée. Pour commencer, préparez la phase mobile. Mélangez de l’acétonitrile, du méthanol et de l’eau distillée à un rapport de deux à deux pour un pour la phase aqueuse.Utilisez de l’isopropanol pour la phase organique dans des bouteilles en verre avec des bouchons à vis doublés de téflon. Ensuite, sonicez les deux phases mobiles pendant cinq minutes dans un sonicateur de type bain. Ajoutez ensuite de l’acide formique à une concentration finale de 26,4 millimolaires et de l’hydroxyde d’ammonium à 14,9 millimolaires dans chaque phase mobile.Pour une analyse qualitative, activez le système de chromatographie liquide à haute performance. Placez les tubes d’entrée dans les bouteilles en verre qui contiennent les phases mobiles et purgez les lignes HPLC. Reliez ensuite une colonne HPLC C18 au système HPLC.Maintenez la température dans le four à colonne à 50 degrés Celsius et conditionnez la colonne avec la phase mobile aqueuse à 100 microlitres par minute. Pendant le cycle, placez les échantillons dans un support d’échantillons de l’échantillonneur automatique. Définir les paramètres du système de spectrométrie de masse à piège ionique linéaire triple, quadruple et quadruple pour l’analyse par spectrométrie de masse en trois étapes, comme indiqué dans le tableau un et le tableau deux du protocole de texte ci-joint.De plus, il faut définir les paramètres pour les premier et deuxième ions précurseurs de l’espèce d’intérêt SM, comme décrit plus en détail dans le protocole de texte d’accompagnement. Créez un fichier de lot et soumettez-le pour obtenir les données des spectres d’ions de produit MS trois de chaque espèce de Sphingomyéline par chromatographie liquide, ionisation par ionisation par électronébulisation, analyse spectrométrique de masse en tandem. Obtenir les spectres d’ions de produit MS triphasé de l’espèce d’intérêt Sphingomyelin par chromatographie liquide, ionisation par électronébulisation, analyse par spectrométrie de masse en tandem.Ensuite, attribuez à chaque MS trois spectres d’ions produits de la Sphingomyéline en comparant le rapport masse/charge des spectres d’ions produits dans la masse exacte de la base à longue chaîne du sphingoïde et de la fraction n-acyle d’intérêt. Analyser quantitativement la sphingomyéline à l’aide de la chromatographie liquide, de l’ionisation par ionisation par électronébulisation, de l’analyse par spectrométrie de masse en tandem, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Traitez ensuite les données de surveillance des réactions multiples à l’aide du logiciel d’intégration des données afin d’obtenir les données de la zone du pic pour le chromatogramme ionique extrait de chaque espèce de Sphingomyeline.Quantifiez chaque espèce de Sphingomyelin et construisez les courbes standard comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Le spectre de la sphingomyéline synthétisée chimiquement et de la sphingomyéline dans des échantillons lipidiques extraits de cellules HeLa est montré ici. Il convient de noter que l’intensité spectrale de la sphingosylphosphorylcholine déméthylée est supérieure à celle de la fraction n-acyle SM dans les deux échantillons.Il est également intéressant de noter que le spectre correspondant à la sphingosine-1-phosphate est utile pour spéculer sur le nombre de carbones et de doubles liaisons de la base à longue chaîne sphingoïde de la sphingomyéline. Dans la méthode quantitative actuelle, il est essentiel de préparer avec précision les échantillons pour construire la courbe d’étalonnage afin de valider cette méthode. La courbe d’ajustement de la faible concentration a été nettement améliorée en utilisant le facteur de pondération égal à un sur x au carré par rapport à celui utilisant le facteur de pondération de un ou un sur x.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie et de l’industrie pour caractériser une variété d’espèces de Sphingomyelin dans des échantillons biologiques et des produits industriels tels que les cosmétiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser avec précision la quantité et la structure de chaque espèce de Sphingomyéline dans des échantillons biologiques. N’oubliez pas que travailler avec des absorbants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une usure appropriée du verre doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.De plus, il est important de porter des gants pour éviter la contamination des lipides dérivés de vos mains.

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Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces (Vidéo) | JoVE Journal

Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

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