In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

Il est maintenant reconnu que les effets systémiques des tumeurs primaires jouent un rôle important dans le processus de dissémination métastatique. Cependant, cela est souvent manqué dans les tests expérimentaux de métastases. Ce modèle vise à fournir aux chercheurs un moyen d’évaluer cet effet.

Ce protocole comprend l’évaluation des métastases spontanées après l’ablation chirurgicale d’une tumeur primaire, ce qui est cliniquement pertinent. Principalement, il tire également parti de l’imagerie par bioluminescence pour surveiller la croissance des métastases pulmonaires en temps réel. Ce dispositif expérimental peut être étendu pour évaluer les interventions pharmacologiques ou génétiques pour le cancer du sein dans le cadre néoadjuvant, ainsi que la pertinence de voies de signalisation spécifiques dans le processus métastatique.

Pour commencer, récoltez les cellules en aspirant le milieu de culture cellulaire et lavez-les avec du PBS stérile. Ensuite, incubez avec deux millilitres de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant environ deux à trois minutes à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent, puis lavez avec huit millimètres de milieu complet pour éteindre la réaction. Après avoir aspiré le surnageant et lavé les cellules avec du PBS, remettre en suspension les cellules dans le PBS dans le volume calculé nécessaire pour diluer les cellules à 6 millions de cellules par millilitre.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre et conservez-la sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être injectée. Rasez les poils de l’abdomen de la souris anesthésiée à l’aide d’une tondeuse électrique, puis placez-le en position couchée. Ensuite, nettoyez la région abdominale préparée à l’aide d’éthanol à 70 % et d’une solution de povidone iodée.

À l’aide de ciseaux, faites une petite incision médiane à travers la peau abdominale au niveau du quatrième tissu mammaire, en exposant mais sans pénétrer à travers le péritoine sous-jacent. Ensuite, tenez la peau loin du péritoine à l’aide d’une pince et séparez la peau du péritoine avec des cotons-tiges stériles imbibés de solution saline, en vous déplaçant latéralement pour exposer le coussinet adipeux mammaire droit, et répétez l’opération sur le côté gauche pour exposer le coussinet adipeux mammaire gauche. Après avoir remis en suspension la suspension de la cellule E0771 à l’aide d’une pipette manuelle, transférez 100 microlitres dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ajoutez ensuite un volume égal de solution matricielle de membrane basale et mélangez bien en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Ensuite, gardez le tube sur de la glace. Tirez 100 microlitres de suspension cellulaire dans une seringue à insuline U-100 de calibre 28 de 0,5 millilitre et conservez-la sur de la glace.

À l’aide d’une pince, soulevez la peau et saisissez et exposez doucement le coussinet adipeux mammaire gauche. Ensuite, injectez 50 microlitres de suspension cellulaire dans le coussinet adipeux mammaire et attendez trois à cinq secondes avant de retirer la seringue. Relâchez ensuite la peau de la pince, lui permettant de revenir naturellement à sa position normale, et fermez l’incision cutanée en appliquant des agrafes cutanées.

Pour surveiller la croissance de la lésion tumorale orthotopique du sein, mesurez la longueur et la largeur de la tumeur primaire à l’aide d’un pied à coulisse trois fois par semaine. Après l’anesthésie, administrez 40 microlitres de méloxicam par voie sous-cutanée pour contrôler la douleur, puis placez la souris en position couchée. Ensuite, retirez les agrafes chirurgicales précédentes si nécessaire et nettoyez l’abdomen avec une solution d’éthanol à 70 % et de povidone iodée.

À l’aide de ciseaux, faites une petite incision médiane à travers la peau abdominale au niveau du quatrième tissu mammaire, en exposant mais sans pénétrer à travers le péritoine sous-jacent. Ensuite, retirez la tumeur orthotopique en coupant à travers le tissu mammaire normal, situé proximale et distale à la tumeur à l’aide de ciseaux. Jetez le tissu tumoral dans un sac à risque biologique tout en répétant la procédure avec la tumeur controlatérale.

Ensuite, fermez le site chirurgical à l’aide d’une à trois agrafes et transférez la souris dans une cage de récupération propre avec un coussin chauffant chaud en dessous. Injectez aux animaux 100 microlitres de solution de D-luciférine en utilisant une injection rétroorbitaire en insérant l’aiguille dans le canthus médial de l’œil à un angle de 45 degrés par rapport au nez jusqu’à ce qu’une résistance osseuse soit ressentie, en veillant à ce que l’aiguille soit placée dans le sinus veineux rétroorbitaire. Confirmez la réussite de l’injection par l’absence de rinçage du liquide lors de l’administration et attendez deux minutes avant l’imagerie.

Pendant ce temps, transférez les animaux dans les cônes nasaux situés à l’intérieur de l’imageur bioluminescent en position couchée. Pour mesurer le flux de photons, créez un ROI carré pour chaque animal représenté dans l’image à partir du menu déroulant de l’outil ROI en cliquant sur le bouton ROI carré. Repositionnez le ROI généré automatiquement sur le thorax de chaque animal en cliquant et en faisant glisser avec la souris.

Et puis cliquez sur le bouton de mesure du retour sur investissement. Faites une incision médiane sous le processus xiphoïde, en coupant la peau, la musculature et le péritoine pour exposer la partie inférieure de la cavité thoracique à l’aide de ciseaux jusqu’à ce que le diaphragme soit visible. Ensuite, perforez le diaphragme pour affaisser les poumons, puis coupez à travers le diaphragme.

Coupez la cage thoracique sur les côtés droit et gauche, puis utilisez un hémostat pour saisir le processus xiphoïde et écartez la cage thoracique, exposant le cœur et les poumons. Ensuite, coupez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux. Ensuite, perfuser l’animal avec 10 millilitres de PBS glacé à travers le ventricule gauche, et évaluer la complétude de la perfusion en confirmant que le liquide s’écoulant de l’oreillette droite devient clair et que le foie prend une couleur jaune pâle.

Ensuite, identifiez la trachée et insérez une seringue à aiguille de calibre 22 avec trois millilitres de paraformaldéhyde à 4 %, en la tenant parallèlement à la trachée. Ensuite, administrez la solution à un rythme lent jusqu’à ce que les poumons soient complètement gonflés. Continuez à tenir doucement la trachée.

Coupez-le avec des ciseaux au-dessus de la pince et commencez à soulever soigneusement le tissu tout en retirant tout le tissu conjonctif. Ensuite, disséquez le cœur loin des poumons. Ensuite, placez le tissu pulmonaire dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant la nuit et stockez-le à quatre degrés Celsius pour la fixation.

En utilisant des souris C57 black 6, un signal significatif de bioluminescence des métastases pulmonaires est généralement détecté environ deux semaines après la résection tumorale primaire et peut être suivi au fil du temps, bien que certaines variations puissent être trouvées en fonction du type de rapporteur de la luciférase et de la souche de souris. L’imagerie par bioluminescence ex vivo du tissu pulmonaire au point final fournit une quantification précise et sensible de la charge métastatique pulmonaire qui peut être tracée pour être comparée à d’autres traitements. Le comptage des nodules pulmonaires sous stéréoscope et l’analyse histologique de l’hématoxyline et de l’éosine peuvent être utilisés pour compléter les études de quantification.

Retarder légèrement le retrait de l’aiguille après l’injection du coussinet adipeux mammaire permet à la solution matricielle de se gélifier, ce qui est essentiel pour prévenir la fuite de la suspension cellulaire et le développement de tumeurs extra-mammaires. Nous utilisons maintenant cette technique en combinaison avec divers modèles de souris knock-out et knockin génétiques pour étudier plus en détail la cascade métastatique, en particulier le développement de la niche pré-métastatique.