Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Il s’agit d’un protocole standard pour le traitement et le stockage d’échantillons de sang pour les applications de biopsie liquide en aval basées sur l’ADN libre circulant. Il s’agit du premier protocole standard publié, bien que la technique soit utilisée depuis plusieurs années. Il est facile à suivre avec l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires translationnels ou scientifiques.

Le protocole peut être exécuté par tout le personnel du laboratoire. Le protocole aide à normaliser la façon dont nous prélevons et stockons les échantillons, ce qui aura un impact final sur la clinique et réduira la variabilité entre les différents centres effectuant la même analyse en aval ou une analyse similaire où la précision est de la plus haute importance. Cette méthode est particulièrement utile dans la recherche en oncologie et aussi dans les applications cliniques.

Cependant, il peut également être appliqué dans d’autres maladies non cancéreuses où la biopsie liquide est également utilisée. Une fois que l’échantillon de sang a été centrifugé, il peut être difficile de savoir combien de plasma ou de sérum à éliminer, mais suivre ces directives spécifiques vous aidera. Le reste du protocole est très facile à suivre avec une expérience limitée en laboratoire.

La démonstration de la procédure sera assurée par Jorge, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer, centrifuger le tube contenant du sang frais à température ambiante pendant 10 minutes à 1600 fois g, en appliquant la cassure maximale. Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse.

La phase supérieure du surnageant sérique apparaîtra claire et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse et notez la présence d’hémolyse le cas échéant. Dans une enceinte de biosécurité de classe II, transférer le sérum dans des tubes de prélèvement sous forme d’aliquotes de 250 microlitres.

Les aliquotes doivent être correctement étiquetées. Congelez immédiatement le sérum à la verticale dans la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius et notez le temps de stockage de l’échantillon. Vérifier que les échantillons ont été traités dans le délai requis de quatre heures.

Centrifuger le tube EDTA à température ambiante pendant 10 minutes à 1600 fois g, en appliquant la rupture maximale. Après centrifugation, le surnageant plasmatique apparaîtra clair et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse et transférez le plasma dans un tube centrifuge de 15 millilitres sans perturber la couche cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique jetable.

Laissez un petit volume résiduel de plasma au-dessus de la couche cellulaire à environ cinq millimètres. Si une hémolyse est observée, jeter l’échantillon pour une analyse plus approfondie. Centrifuger le plasma et un tube de centrifugation de 15 millilitres pour éliminer les cellules sanguines intactes résiduelles rapportées de la première étape de centrifugation.

Retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse, pas la pastille de cellule au fond du tube, et transférez un à quatre millilitres de plasma dans un à quatre millilitres de polypropylène bios cryogéniques ou Eppendorfs à l’aide d’une pipette sérologique jetable. Un volume résiduel de plasma doit être laissé au fond du tube pour éviter de contaminer le plasma avec des cellules sanguines. Congelez immédiatement le plasma à la verticale dans la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius et notez le temps de stockage de l’échantillon.

Vérifiez que les échantillons sont correctement étiquetés et ont été traités dans le délai requis de quatre heures. Collectez la couche cellulaire à l’aide d’un P1000 et d’une pointe filtrée et transférez-la dans un tube de deux millilitres. Congeler immédiatement et conserver à moins 80 degrés Celsius.

Un exemple d’extraction d’ADNcf de haute qualité pouvant être utilisée pour des applications en aval est présenté ici, alors que cette image graphique représente un exemple d’échantillon inapproprié avec un niveau élevé de contamination génomique. La fraction plasmatique ou sérique doit être de couleur jaune. Cela peut varier en fonction de l’échantillon individuel.

Les échantillons avec hémolyse doivent être jetés. Veillez à ne pas enlever de pastille cellulaire lors de l’élimination de la fraction plasmatique. Ce protocole peut également être utilisé pour d’autres applications à base d’acides nucléiques et de protéines, telles que la détection d’ARN ou de protéines non codants dans des échantillons de sérum et de plasma à l’aide de techniques d’immunodétection.

Il s’agit d’une technique très courante utilisée dans de nombreux laboratoires. Ce protocole aide les chercheurs à normaliser la façon dont nous effectuons notre analyse, car il s’agit d’un aspect crucial, nécessaire pour de futures applications cliniques.