Isolement de l’ADN libre circulant (cfDNA) : une procédure membranaire à base de silice pour extraire l’ADNcf du plasma sanguin de patients atteints de cancer

Les ADNcf circulants sont de courts fragments d’ADN principalement libérés par les cellules cancéreuses subissant l’apoptose. Les cfDNA sont des biomarqueurs prometteurs du cancer et peuvent être isolés à partir de fluides corporels tels que le plasma.

Pour isoler l’ADNcf, prélevez d’abord un échantillon de plasma d’un patient cancéreux. Ensuite, traitez le plasma avec un tampon de lyse contenant de la protéinase K, des sels chaotropes et de l’ARN porteur. Les sels chaotropiques dénaturent les protéines, libérant des ADNcf liés à partir des protéines. La protéinase K inactive les nucléases, minimisant ainsi la dégradation de l’ADNcf.

Ensuite, ajoutez le tampon de liaison souhaité à l’échantillon. Assemblez une colonne de centrifugation contenant une matrice de silice en phase solide sur l’appareil à vide. Chargez l’échantillon dans la colonne. Appliquez le vide pour faire passer l’échantillon à travers la membrane de silice.

L’ARN porteur se lie de manière non spécifique aux parois du tube. Cette liaison non spécifique ainsi que la présence de sels dans le tampon facilitent la liaison de l’ADNcf à la membrane de silice, augmentant ainsi la récupération des ADNcf. Les protéines et autres contaminants ne retiennent pas la membrane.

Maintenant, placez la colonne de centrifugation sur un tube de collecte. Centrifugeuse pour éliminer tout lysat résiduel. Ajoutez un tampon de lavage approprié et une centrifugeuse pour éliminer les sels et tous les contaminants restants de la colonne. Enfin, transférez la colonne dans un tube de collecte frais et ajoutez un tampon d’élution approprié. Centrifugeuse pour éluer les acides nucléiques, y compris les cfDNA dans le tube.

Pour isoler l’ADN acellulaire circulant à partir d’un échantillon de plasma de patient, ajoutez 100 microlitres de protéinase K et 800 microlitres de tampon de lyse complétés par un microgramme d’ARN porteur à 1 millilitre de plasma de patient. Pulsez soigneusement la solution pendant 30 secondes avant de l’incuber pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 1,8 millilitre de tampon de liaison dans le tube et mélangez soigneusement avec 15 à 30 secondes de vortex pulsé.

Après une incubation de 5 minutes sur de la glace, insérez une colonne à membrane de silice dans un appareil à vide relié à une pompe à vide et insérez fermement un prolongateur de tube de 20 millilitres dans la colonne ouverte pour éviter les fuites d’échantillon. À la fin de l’incubation, versez délicatement le mélange dans le prolongateur de tube et allumez la pompe à vide. Lorsque tout le lysat a complètement coulé à travers les colonnes, éteignez la pompe à vide, relâchez la pression à zéro millibar et jetez soigneusement le prolongateur de tube sans contaminer les colonnes adjacentes.

Transférez la colonne dans un tube de collecte pour la centrifugation afin d’éliminer tout lysat résiduel. Après avoir jeté le flux, ajoutez 600 microlitres de Wash Buffer-1 dans la colonne pour une deuxième centrifugation. Après avoir jeté le flux, centrifugez à nouveau la colonne avec 750 microlitres de Wash Buffer-2. Après avoir jeté le flux, ajoutez 750 microlitres d’éthanol à 96 % à 100 % dans la colonne pour une centrifugation supplémentaire.

Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 millilitres pour une autre centrifugation avant de placer l’ensemble de la colonne à membrane dans un nouveau tube de collecte de 2 millilitres à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, transférez la colonne dans un nouveau tube d’élution de 1,5 millilitre et ajoutez 50 microlitres de tampon d’élution dans la colonne pour une incubation de 3 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger la solution récupérée pendant 1 minute à 20 000 x g pour éluer les acides nucléiques.

• Circulating cell-free DNA (cfDNA) - Short DNA fragments mainly released by apoptosing cancer cells.
• Apoptosis - A cellular process that results in cell death, releasing cfDNA into the bloodstream.
• Plasma - A component of blood from which cfDNA can be isolated.
• Lysis buffer - A solution used to denature proteins and release bound cfDNA.
• Silica membrane - A component of spin column used to separate cfDNA from contaminants.

• Circulating cell-free DNA (cfDNA) is a cancer biomarker found in body fluids such as plasma (e.g., cfDNA).
• Apoptosis results in the release of cfDNA (e.g., apoptosis).
• The lysis buffer helps in the separation of cfDNA from proteins and other contaminants (e.g., lysis buffer).
• The cfDNA binds to silica membrane in the presence of salts and carrier RNA.
• This process involves a vacuum apparatus and centrifugation to ensure efficient recovery and purification of cfDNA.

• What is circulating cell-free DNA (cfDNA) and how is it related to cancer?
• How does apoptosis contribute to the presence of cfDNA in the bloodstream?
• What role does a lysis buffer play in the process of cfDNA isolation?

• CfDNA isolation has practical applications in cancer diagnosis and monitoring (e.g., cfDNA).
• This technology impacts healthcare, especially oncology, by providing a non-invasive method for cancer detection (e.g., healthcare).
• It's important for personalized cancer treatment, improving patient outcomes and quality of life (e.g., personalized medicine).
• The method can also be used for isolating other nucleic acids, presenting new possibilities for scientific research.