Name: Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Apprenez à isoler et caractériser des ovocytes antraux de souris selon leur organisation nucléolaire chromatine SN et NSN. Cette méthode permet d'évaluer la qualité ovocytaire pour la biologie du développement.

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M.M. et C.A.R. reconnaissent le soutien financier du Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 de la Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavie (I). M.M et C.A.R. tiennent à remercier Marianna Longo pour son aide dans la préparation des images.

Ce protocole est réalisée en conformité avec les principes directeurs du européenne (UE) 63/2010 et 26/2014) (lois italiennes de protection des animaux utilisés pour la recherche scientifique. Cervicale dislocation euthanasie est utilisé pour ovaires isolement et elle est effectuée par des experts et des personnes énumérées dans le protocole approuvé couvrant cette étude formé. 1. Les animaux <ol><li> Maintenir adultes 3- à des souris femelles de 6 semaines, âgé dans une salle à température contrôlée et l&#39;humidité (avec des phases de 12L: 12D et nourris ad libitum). </li><li> Injecter les souris par voie intraperitoneale avec 2,5 UI de gonadotrophine Pregnant Mare sérique (PMSG) pour stimuler la croissance folliculaire en imitant les effets de l&#39;hormone folliculo-stimulante (FSH). Isoler les ovaires pour les ovocytes antraux collecte de 48 heures plus tard. Euthanasier la souris femelle préalablement injecté avec PMSG, selon vos directives institutionnelles. </li><li> Supprimer rapidement les ovaires de la cavité du corps et placez-les dans le plat de Pétri suiteaining milieu M2 pour l&#39;isolation des ovocytes ultérieure (voir section 3). <ol><li> Faire une incision sur la peau recouvrant la paroi abdominale suivie par une incision dans le péritoine à l&#39;aide des ciseaux de dissection stériles. Ouvrir l&#39;incision pour exposer l&#39;abdomen, le cran se déplacer d&#39;un côté à l&#39;aide des pinces stériles et localiser les trompes utérines, formant une forme en V à partir de la vessie. </li><li> Respecter les ovaires situés sous les reins. Maintenez chaque tube avec pince stérile et faire une petite incision au bas des ovaires pour les libérer. Transfert des deux ovaires au fond d&#39;une boîte de Pétri contenant le milieu pré-équilibrée. </li></ol></li></ol> 2. Hormone Préparation <ol><li> Diluer PMSG (disponible en différentes concentrations sous licence) avec une solution saline isotonique stérile pour obtenir une concentration de travail de 2,5 UI d&#39;hormone par 0,1 ml pour un volume d&#39;injection approprié. REMARQUE: Les solutions d&#39;hormone doivent être aliquotées dans 0,5 ml tubes et conservés à -20 ° C jusqu&#39;au jour d&#39;utilisation. Ne gardez pas aliquotes dilué de plus de trois mois à -20 ° C. Une fois décongelé, si les injections sont effectuées en série, stocker les aliquotes de solutions d&#39;hormones à +4 ° C et les utiliser dans les 4 jours. </li></ol> 3. Antral ovocytes Isolement Pour l&#39;isolement de bon ovocytes: <ol><li> Equilibrer milieu M2 13 (M2) à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 1 heure avant de procéder à l&#39;isolement d&#39;ovocytes. Préparer deux boîtes de Petri (35 mm x 10 mm), l&#39;une avec 1 ml de M2 ​​pour ponction des ovaires et l&#39;autre avec de petites gouttes (20 ul) de M2 ​​recouvert d&#39;huile minérale (~ 1,5 ml) pour le transfert des ovocytes après isolement à partir de la ovaire (voir 3,4-3,6). Gardez les deux boîtes de Pétri dans l&#39;incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C jusqu&#39;à ce que prêt à être utilisé. </li><li> Utilisez un stéréomicroscope pendant les procédures d&#39;isolement de ovocytes. </li><li> Préparer fines pipettes bouche de verre pour recueillir les ovocytes par la stretchhing pipettes Pasteur en verre maintenues horizontalement (en maintenant les extrémités de la pipette avec les deux mains), au cours d&#39;une flamme verticale venant du brûleur Bunsen (figure 1). <ol><li> Une fois le verre commence à fondre, prendre la pipette de la flamme et effectuer un mouvement de traction rapide pour obtenir la pipette souhaitée. Fermement couper le verre dépassement proche de la pointe de la pipette avec les ongles pour ajuster la longueur et le diamètre du capillaire interne étroite. Assurez-vous que le capillaire mince a un diamètre interne de 100 um ~, légèrement plus grande que le diamètre de l&#39;ovocyte (~ 80 um). </li><li> Pour la bouche pipette, connectez une extrémité du tube d&#39;aspiration à la pipette tiré par aide d&#39;une pointe appropriée et placer l&#39;autre extrémité dans la bouche, en le fixant avec les dents. </li></ol></li><li> Recueillir les ovaires en utilisant des pinces stériles et les déposer au fond d&#39;une boîte de culture cellulaire de Petri (35 mm x 10 mm). Couvrir avec 1 ml de M2 ​​préalablement équilibrées à 37 ° Cet 5% de CO 2 (Figure 2). </li><li> Percer délicatement les follicules antraux des ovaires avec une aiguille insuline seringue stérile pour libérer ovocytes antraux en M2 (figure 3). </li><li> Doucement bouche Déposer le ovocytes à travers une pipette Pasteur étroite pour éliminer les cellules folliculaires et tout autre débris de tissu possible (figure 4A), puis de les régler au fond de petites gouttes (20 pi) de M2 couverts avec de l&#39;huile minérale approprié pour la culture d&#39;embryons (précédemment préparé; figure 4B). NOTE: Il est important d&#39;enlever toutes les cellules du cumulus attachés à la zone pellucide des ovocytes par pipetage continu à travers plusieurs et différentes gouttes de M2. Effectuer cette étape aussi vite que possible pour éviter des modifications du pH du milieu. </li></ol> 4. Antral ovocytes coloration avec Hoechst33342 REMARQUE: ovocytes antraux peut être distinguée de SN (Entouré Nucléole), NSN (Non Entouré Nucléole) oude toute autre forme intermédiaire, en fonction de leur organisation de la chromatine après coloration avec la concentration de supravital Hoechst33342 (ou d&#39;autres marqueurs spécifiques pour les bases AT) 14. En fait, les ovocytes SN montrent un anneau Hoechst positif autour de la nucléole tandis que le NSN ne le font pas, d&#39;où son nom. Pour la coloration de ovocytes appropriée: <ol><li> Transférer les ovocytes en utilisant une pipette en bouche gouttes de Hoechst33342 (20 pi) dilué dans M2 à la concentration supravital de 50 ng / ul pendant 10 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Après l&#39;incubation avec Hoechst33342, transférer chaque ovocyte unique avec une pipette de la bouche au bas de petites gouttes (5 pi) de M2 ​​couverts avec de l&#39;huile minérale, pour le tri sur la base organisation de la chromatine (SN ou NSN). Utilisez toute microscope à fluorescence équipé d&#39;un filtre Hoechst33342 (d&#39;onde d&#39;émission 486 nm) pour visualiser la configuration de la chromatine des ovocytes. REMARQUE: Selon le type de microscope à fluorescence utilisé, it peut devenir impératif d&#39;utiliser à fond de verre boîte de Pétri pour l&#39;acquisition d&#39;image. La microscopie confocale Olympus Fluoview Fv10i lorsqu&#39;il est équipé d&#39;un porte-échantillon pour boîte de 35 mm nécessite verre seulement bas-plats pour l&#39;acquisition d&#39;image, avec une épaisseur standard 0,17 mm et une gamme de 0,13 à 0,21 mm acceptables. </li><li> Exciter les ovocytes pour pas plus de 5-10 secondes, probablement assez de temps pour visualiser la présence ou l&#39;absence d&#39;un anneau autour de la nucléole (Figure 5). </li><li> Après le tri, la culture de la SN de l&#39;antre et ovocytes RSN en M2 à 5% de CO 2 et 37 ° C pour induire la maturation in vitro ou les conserver dans des tampons appropriés pour des analyses moléculaires ou cellulaires. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
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<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Ce protocole décrit la méthode utilisée pour isoler et classer l&#39;antre de la souris ovocytes GV. Il n&#39;y a pas des étapes cruciales notamment pour souligner, à quelques exceptions près. Premièrement: cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible à: a) maintenir la vitalité des ovocytes et b) d&#39;éviter les changements de pH dans le moyen utilisé. Deuxièmement: ovocytes doivent être brièvement excité (5-10 sec) pour Hoechst33342 pour éviter les dommages de la chromatine et la mort subséquente...

Antraux ovocytes entièrement développés (GV, vésicule germinale) isolés du compartiment de l&#39;antre de l&#39;ovaire sont couramment utilisés à des fins différentes, tels que, par exemple, l&#39;étude des mécanismes moléculaires et cellulaires derrière la maturation in vitro jusqu&#39;au stade métaphase II. Malgré leurs belles apparence ovocytes plus antre, mais pas tous, sont en mesure de compléter la méiose et atteindre le stade de blastocyste; En fait, dans de nombreuses espèces de mammifères, dont les humains 1,2, environ 30% d&#39;entre eux arrêter leur développement au stade 2 cellules, si la fécondation se produit 3-5. À ce jour, peu de paramètres sont utilisés pour distinguer entre les ovocytes capables de soutenir le développement embryonnaire de ceux qui sont incapables de le faire. Par exemple, crésyle coloration au bleu (BCB) est une méthode valide pour trier les ovocytes sur la base de l&#39;activité de glucose-6-phosphate déshydrogénase, bien que l&#39;utilité de cette méthode de tri associées à la coloration ou + BCB est BCB-encore dépendants 6-8 laboratoire. Une autre méthode bien établie réside dans leur organisation de la chromatine: si colorées avec des colorants intercalants de l&#39;ADN (comme Hoechst33342), 70% des ovocytes antraux montre un anneau de colorant positive autour du nucléole et sont appelés Entouré Nucléole (SN), tandis que les 30% restants montrer un des signaux positifs plus tachetées et sont appelés pas entouré Nucléole (NSN) 3-5. Récemment, nous avons montré que l&#39;absence de réseaux cytoplasmiques 9 (de CPL, sites de stockage importants pour l&#39;ARNm et des ribosomes d&#39;origine maternelle dans les deux ovocytes et des embryons de mammifères) 10 et la régulation à la baisse de MATER (essentiel pour la formation CPL 11), avec la présence de gouttelettes de lipides dans leur cytoplasme 9,12, peuvent être d&#39;autres causes liées à l&#39;incapacité des ovocytes NSN à aller au-delà du stade 2 cellules. Malheureusement, quelques techniques peuvent être appliquées pour trier SN antre et ovocytes RSN et,pour cette raison, le développement d&#39;une méthode moins invasive (sans coloration nucléaire, les procédures de fixation ou de manipulation aux pipettes bouche) pourrait devenir très important d&#39;augmenter les taux de développement de l&#39;embryon à la fois humaine et animale. Dans cet article, nous détaillons le protocole simple et rapide utilisé pour isoler annonce SN de tri et RSN ovocytes antre de souris femelles et elle est adressée à tous les scientifiques intéressés par l&#39;étude de la gamétogenèse femelle, la maturation des ovocytes et le développement de l&#39;embryon.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-Dish 35mm, fond haut en verre</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur Borosilicate</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’aspirateur pour pipettes micropiliers calibrées</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation de souris antral ovocytes basé sur nucleolar organisation chromatine

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Ce protocole décrit une méthode simple et rapide pour isoler et caractériser les ovocytes antraux GV (Germinal Vesicle) de souris comme capables (SN, nucléole entouré) ou incapables (NSN, non entouré nucléole) de se développer jusqu’au stade de blastocyste après maturation in vitro (IVM) et fécondation in vitro (FIV). Il utilise le Hoeschst33342 (ou tout autre colorant intercalateur d’ADN) capable de se lier à l’hétérochromatine du nucléole montrant un anneau dans les ovocytes SN ou non, comme dans les ovocytes NSN. Il s’agit du moyen le plus simple et le plus rapide de trier les deux ovocytes antraux qui peuvent éventuellement être utilisés pour les procédures de MIV ou de FIV. 
En bref, le protocole comprend les étapes suivantes : injection d’hormones pour stimuler la croissance folliculaire ; isolement des ovocytes au stade GV à partir du compartiment antral par perforation de l’ovaire avec une aiguille stérile ; préparation de fines pipettes en verre pour le pipetage buccal des ovocytes ; tri des ovocytes avec Hoechst33342 préparé à une concentration supravitale ; IVM, FIV ou toute autre analyse moléculaire/cellulaire.
Malheureusement, il existe encore peu de preuves pour trier les ovocytes SN et NSN en utilisant des techniques moins invasives. Si et une fois qu’ils seront identifiés, ils pourraient être appliqués aux technologies de procréation assistée humaine, bien qu’avec plusieurs aspects qui devraient être modifiés. À ce jour, cette technique a des implications potentielles pour augmenter considérablement les procédures de MIV et de FIV réussies chez les espèces menacées et les espèces présentant un intérêt économique.

Les images suivantes montrent la méthode utilisée pour isoler les ovocytes antraux à partir d&#39;ovaires de souris, à partir de pipettes préparation au tri des ovocytes au moyen d&#39;Hoechst33342. Cette méthode est assez simple et peut être effectuée dans n&#39;importe quel laboratoire équipé d&#39;un incubateur à CO 2, un stéréomicroscope et un microscope à fluorescence équipé du filtre adapté à l&#39;observation de la Hoechst33342 La figure 1 représente l&...

Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.

Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

L'objectif général de cette procédure est de détailler toutes les étapes nécessaires à la caractérisation des ovocytes antraux de souris en fonction de leur organisation de la chromatine et de leur capacité à soutenir pleinement un développement embryonnaire potentiel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que la distinction et l'isolement de deux types différents d'ovocytes antraux, les SN (entourés de nucléoles) et les NSN (non entourés de nucléoles), présents dans le compartiment antral de l'ovaire des mammifères. Pour prélever les ovaires, commencez par injecter par voie intrapéritonéale à des souris femelles âgées de trois à six semaines 2,5 unités internationales de gonadotrophine sérique de jument pleine.Deux jours plus tard, environ une heure avant la récolte, remplir une boîte de Pétri stérile avec du milieu M2 et ajouter plusieurs gouttes de 20 microlitres de milieu M2 dans une seconde boîte de Pétri, en recouvrant chaque goutte de 1,5 millilitre d’huile minérale. Puis transférer toutes les boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre l’équilibration du milieu. Ensuite, utiliser des ciseaux de dissection stériles pour pratiquer une incision dans la peau recouvrant la paroi abdominale, suivie d’une incision dans le péritoine de la première souris injectée avec l’hormone.Utilisez des pinces stériles pour déplacer les intestins afin de localiser les trompes utérines, qui forment une forme en V partant de la vessie. Après avoir localisé les ovaires situés sous les reins, saisissez une trompe utérine et libérez l'ovaire correspondant à l'aide d'une petite incision à la base du tissu. Répétez le processus pour prélever l'autre ovaire, puis placez les deux ovaires dans la boîte de Pétri remplie de milieu M2 pré-équilibré.Avant d'isoler l'ovocyte antral, fabriquez des pipettes buccales en verre en tenant les deux extrémités d'une pipette de Pasteur en verre et en la maintenant horizontalement au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen. Lorsque le verre commence à fondre, retirez la pipette de la flamme et tirez rapidement l'instrument en deux. À l'aide d'un ongle, coupez fermement l'excédent de verre près du point étroit de la pipette pour raccourcir la pointe et obtenir un diamètre interne de capillaire d'environ 100 microns.Il est important d'avoir un diamètre de pipette adapté. S'il est trop étroit, les ovocytes resteront bloqués, se fragmenteront et mourront. Ensuite, reliez l'extrémité non modifiée de la pipette à un tube d'aspiration.Ensuite, transférez les ovaires dans la boîte de Pétri contenant un millilitre de milieu M2 pré-équilibré, et utilisez une aiguille stérile de seringue à insuline pour percer délicatement les follicules antraux des ovaires. Au fur et à mesure que les ovocytes sont libérés, collectez-les doucement à l’aide d’une pipette à aspiration buccale, en prenant soin de ne pas aspirer de cellules folliculaires ni de débris tissulaires. Puis, aspirez rapidement chaque ovocyte à travers plusieurs gouttes de milieu M2 pré-équilibré afin d’éliminer toutes les cellules du cumulus attachées à la zone pellucide des ovocytes.Une fois les ovocytes dénudés, déposer délicatement les ovocytes au fond de gouttes individuelles de milieu M2 frais équilibré. Pour colorer les ovocytes, utiliser une pipette à bouche pour transférer les cellules dans des gouttes de 20 microlitres d’Hoechst 33342 dilué dans le milieu M2. Ensuite, transférer les ovocytes dans une nouvelle boîte de Pétri contenant des gouttes de 5 microlitres de milieu M2 recouvertes d’huile minérale, en prenant soin de déposer individuellement chaque ovocyte au fond de chaque goutte.Une fois tous les ovocytes transférés, placer la boîte sous le microscope fluorescent et exciter les cellules juste assez longtemps pour visualiser la présence ou l'absence d'un anneau autour du nucléole. Veiller à ne pas surexposer les ovocytes, car la chromatine pourrait être endommagée et les ovocytes pourraient mourir en cas d'exposition trop prolongée. Après identification des ovocytes SN et NSN, trier les cellules dans la boîte de Pétri appropriée contenant le réactif correspondant nécessaire à l'analyse en aval souhaitée, en fonction de leur organisation de la chromatine.La coloration par l’Hoechst 33342 pour l’organisation de la chromatine est probablement l’étape la plus critique du protocole. Une excitation de cinq à dix secondes devrait suffire pour trier les ovocytes selon la présence ou l’absence de chromatine entourant le nucléole de chaque ovocyte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de travailler à température ambiante et de manipuler délicatement les deux ovaires et les ovocytes. Après cette procédure, les ovocytes peuvent être utilisés pour la maturation in vitro et la fécondation in vitro. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement de répondre à une question encore ouverte : comment reconnaître et distinguer deux types d'ovocytes antraux présents dans les ovaires des mammifères.Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la fabrication et de l'utilisation de votre propre pipette buccale, ainsi que de l'isolement et du tri des ovocytes antraux à l'aide de la coloration au Hoechst 33342. N'oubliez pas que le travail avec des animaux et des cellules exige des précautions particulières, telles que le port d'équipements de protection individuelle et l'utilisation d'instruments stérilisés.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Cette vidéo décrit l’isolement d’ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés. Ces ovocytes antraux peuvent être utilisés pour d’autres études de caractérisation et de développement.

Isolement d’ovocytes antraux de souris : une méthode pour isoler des ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Nous présentons ici un protocole pour une évaluation non invasive de la compétence du développement ovocytes effectué au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinative au stade métaphase II. Cette méthode combine l’imagerie Time-lapse avec vélocimétrie par image de particules (PIV) et les analyses de réseau neuronal.

Une Identification sur le réseau neuronale d’ovocytes adulte souris développemental compétent ou incompétent

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Apprenez à isoler et caractériser des ovocytes antraux de souris selon leur organisation nucléolaire chromatine SN et NSN. Cette méthode permet d'évaluer la qualité ovocytaire pour la biologie du développement.

Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

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