Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

L’objectif global de cette procédure est de détailler toutes les étapes nécessaires à la caractérisation des ovocytes antraux de souris en fonction de leur organisation chromainienne, en fonction de leur capacité à soutenir pleinement un développement embryonnaire prospectif. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que la distinction et l’isolement de deux types différents d’ooyctes antraux, SN, nucléole entouré, et NSN, nucléole non entouré, résidant dans le compartiment antral de l’ovaire de mammifère. Pour récolter les ovaires, commencez par injecter chez des souris femelles de trois à six semaines IP 2,5 unités internationales de gonadotrophine sérique de jument gravide.

Deux jours plus tard, environ une heure avant la récolte, remplissez une boîte de Pétri stérile avec du milieu M2 et ajoutez plusieurs gouttes de 20 litres de milieu M2 à une deuxième boîte de Pétri, en recouvrant chaque goutte de 1,5 millilitre d’huile minérale. Transférez ensuite toutes les boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pour permettre au milieu de s’équilibrer. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection stériles pour faire une incision dans la peau recouvrant la paroi abdominale, suivie d’une incision dans le péritoine de la première souris injectée d’hormone.

Utilisez une pince à épiler stérile pour écarter les intestins afin de localiser les trompes utérines, qui forment une forme en V à partir de la vessie. Après avoir localisé les ovaires sous les reins, saisissez une trompe utérine et libérez l’ovaire correspondant avec une petite incision au bas du tissu. Répétez le processus pour récolter l’autre ovaire, puis placez les deux ovaires dans la boîte de Pétri remplie de milieu M2 pré-équilibré.

Avant d’isoler l’ovocyte antral, fabriquez des pipettes à bouche en verre en saisissant les deux extrémités d’une pipette Pasteur en verre et en tenant la pipette horizontalement au-dessus d’une flamme de bec Bunsen. Lorsque le verre commence à fondre, retirez la pipette de la flamme et séparez rapidement l’instrument. À l’aide d’un ongle, coupez fermement l’excédent de verre près de la pointe étroite de la pipette pour raccourcir la pointe et obtenir un diamètre capillaire interne d’environ 100 microns.

Il est important d’avoir le bon diamètre de pipette. S’il est trop étroit, les ooyctes seront coincés, fragmentés et mourront. Connectez ensuite l’extrémité non modifiée de la pipette à un tube d’aspiration.

Ensuite, transférez les ovaires dans la boîte de Pétri contenant un millilitre de milieu M2 pré-équilibré et utilisez une aiguille de seringue à insuline stérile pour percer doucement les follicules antraux des ovaires. Au fur et à mesure que les ovocytes sont libérés, prélevez-les doucement à l’aide d’une pipette buccale, en prenant soin de ne pas aspirer de cellules folliculaires ou d’autres débris tissulaires. Ensuite, pipetez rapidement chaque ovocyte à travers plusieurs gouttes de milieu M2 pré-équilibré pour éliminer toutes les cellules du cumulus attachées à la zone pellucide des ovocytes.

Une fois les ovocytes dénudés, déposez soigneusement les ovocytes au fond de gouttes individuelles de milieu M2 frais équilibré. Pour colorer les ovocytes, à l’aide d’une pipette buccale, transférez les cellules dans des gouttes de 20 microlitres de Hoechst 33342, diluées dans un milieu M2. Transférez ensuite les ovocytes dans une nouvelle boîte de Pétri contenant cinq gouttes d’un microlitre de milieu M2 recouvert d’huile minérale, en prenant soin de déposer les ovocytes individuellement au fond de chaque goutte.

Lorsque tous les ovocytes ont été transférés, placez la boîte sous le microscope fluorescent et excitez les cellules juste assez longtemps pour visualiser la présence ou l’absence d’un anneau autour du nucléole. Veillez à ne pas trop exposer les ovocytes, car la chromatine peut être endommagée et les ovocytes peuvent mourir s’ils sont exposés trop longtemps. Une fois que les ovocytes SN et NSN ont été identifiés, triez les cellules dans la boîte de Pétri correspondante appropriée dans le réactif approprié pour l’analyse en aval souhaitée, en fonction de leur organisation chromatinienne.

La coloration Hoechst 33342 pour l’organisation de la chromatine est probablement l’étape la plus critique de la procédure. Cinq à 10 secondes d’excitation devraient être suffisantes pour trier les ovocytes en fonction de la présence ou de l’absence de chromatine entourant le nucléole de chaque ovocyte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de travailler à température ambiante et de ne pas oublier de traiter les ovaires et les ovocytes en douceur. À la suite de cette procédure, les ovocytes peuvent ensuite être utilisés pour la maturation in vitro et la fécondation in vitro. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour répondre à une question encore ouverte, savoir comment reconnaître et distinguer deux types d’ovocytes antraux résidant dans les ovaires de mammifères.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la fabrication et de l’utilisation de votre propre pipette buccale, de l’isolement et du tri des ovocytes antraux au moyen de la coloration Hoechst 33342. N’oubliez pas que le travail avec des animaux et des cellules nécessite des précautions particulières, comme le port de votre équipement de protection individuelle et l’utilisation d’instruments stérilisés.