Name: Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez le profilage de sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR. Cette méthode permet d'évaluer la réponse à l'osimertinib et d'améliorer les stratégies de traitement personnalisé.

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Nous remercions les laboratoires de Jeroen P Roose (UCSF) et Calvin J Kuo (Stanford) pour leur contribution concernant la culture organoïde et le développement de protocoles. Nous remercions également Oghenekevwe M. Gbenedio (Laboratoire Roose, UCSF) pour les protocoles et la saisie d’échantillons dans l’établissement. Ce projet de recherche a été mené avec le soutien du NIH [U54CA224081]. F. Haderk a été soutenu par la bourse postdoctorale Mildred Scheel de l’Aide allemande contre le cancer.

Pour la recherche sur des sujets humains, le consentement éclairé a été obtenu et la collecte de tissus a été effectuée selon les protocoles approuvés par le Comité d’examen interne de l’UCSF (CISR, protocole no : no 13-12492, ou CC no 17-23309). L’établissement de cultures organoïdes à partir d’échantillons cliniques anonymisés a été réalisé en collaboration avec des partenaires de recherche selon des méthodes précédemment publiées13,14,15,16. Des cultures organoïdes ont été prélevées pour des expériences d’entretien et d’escalade de médicaments au passage trois ou plus tard. Tous les protocoles suivants ont été réalisés dans des conditions aseptiques dans un environnement de laboratoire de culture de tissus de mammifères.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg"> Figure 1 : Schéma de protocole du flux de travail et des étapes critiques de la technique. (A) Flux de travail expérimental comprenant l’ensemencement d’organoïdes au format 96 puits, le traitement avec escalade de médicaments 7 jours après l’ensemencement et la lecture de la survie cellulaire basée sur la luminescence 5 jours après le traitement à l’aide d’un lecteur de plaque ELISA. (B) Un exemple d’image des cultures organoïdes EGFRdel19-positives TH107 et EGFRL858R-positives TH330 NSCLC. Les cultures originales, les cellules au moment de l’ensemencement (jour 0) et les organoïdes au début du traitement 7 jours après l’ensemencement (jour 7) sont montrés. Barre d’échelle = 100 μm. Les changements de diamètre organoïde au cours de la période de culture initiale de 7 jours sont quantifiés et indiquent &gt;2 fois plus de taille organoïde. Les changements relatifs de taille au jour 7 par rapport à la taille moyenne au jour 0 sont présentés sous les images représentatives. Pour TH107, un changement de pli de 2,38 sur 7 jours est observé, indiquant un temps de doublement de 5,88 jours (141,12 h). Pour TH330, un changement de pli de 2,41 sur 7 jours est observé, indiquant un temps de doublement de 5,81 jours (139,42 h). La quantification des changements dans la taille des organoïdes et l’évaluation statistique sont présentées (à droite). La signification statistique est calculée par test t non apparié, p &lt; 0,0001. (C) Schéma de traitement pour l’escalade des médicaments dans le format de plaque organoïde à 96 puits. Le nombre de répétitions techniques et de doses exemplaires est indiqué, y compris un contrôle négatif. Les schémas sont créés avec BioRender, un outil d’illustration basé sur le Web. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Préparations expérimentales
<ol><li>Préparer le milieu de croissance (GM) tel que rapporté précédemment15 : Mélange de nutriments F12 (DMEM/F-12) de Dulbecco avec de la L-alanyl-L-glutamine, complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 10 mM d’HEPES, 25 nM d’hRspondine, 1x B27, 5 mM de nicotinamide, 1,25 mM de N-acétylcystéine, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/mL Primocine, 100 ng/mL hNoggin, 100 ng/mL hFGF-10, 25 ng/mL hFGF-7 (voir tableau des matériaux). REMARQUE: Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse et filtrer à travers un système de filtrage de 0,22 μm. Faire chauffer le milieu à 37 °C dans les 1 h avant utilisation.</li>
	<li>Préparer un milieu à faible facteur de croissance (LGM) comme indiqué précédemment16 sans ajout de facteur de croissance épidermique (EGF) : Mélange de nutriments F12 (DMEM/F-12) de Dulbecco modifié de Dulbecco, complété par 1 mM d’HEPES, 1x L-alanyl-L-glutamine, 1x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine, 10 mM de nicotinamide, 1 mM de N-acétylcystéine, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin. REMARQUE: Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Faire chauffer le milieu à 37 °C dans les 1 h avant utilisation.</li>
	<li>Décongeler BME2 (Extrait de membrane basale à facteur de croissance réduit, type 2, voir tableau des matériaux) sur de la glace, à 4 °C, pendant la nuit.</li>
</ol>2. Génération d’une suspension unicellulaire et ensemencement de cellules
<ol><li>Dissocier la culture organoïde BME2 immergée comme décrit dans les étapes suivantes (2.1.1-2.1.6).<ol>
<li>Aspirer soigneusement les milieux des plaques de culture. Évitez de toucher la culture organoïde BME2 submergée. REMARQUE: L’aspiration du média peut être effectuée comme le chercheur le préfère, par exemple avec un système d’aspiration de fluide de base ou à l’aide d’une pipette. Évitez de toucher les organoïdes incorporés BME2, car cela pourrait entraîner une perte de biomasse organoïde.</li>
		<li>Trypsiniser la culture organoïde BME2 immergée avec une enzyme recombinante appropriée (voir tableau des matériaux). En format plaque à 6 puits, ajouter 2 mL par puits. Briser mécaniquement le BME2 en pipetant à plusieurs reprises de haut en bas. Incuber des plaques à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 5 min.</li>
		<li>Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer soigneusement l’enzyme recombinante sans toucher la pastille organoïde. REMARQUE : L’EMB2 résiduelle peut être présente. Répétez la digestion enzymatique si nécessaire.</li>
		<li>Remettre en suspension la pastille organoïde dans GM (étape 1.1). Ajouter la DNase I 1x 100 U/mL et incuber pendant 5 min à température ambiante (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Centrifuger à 600 x g pendant 3 min à température ambiante. Pipettez soigneusement le support sans toucher la pastille organoïde et jetez-la. Remettre en suspension dans des OGM frais.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemencement d’une suspension monocellulaire organoïde<ol><li>Préchauffez une nouvelle plaque noire à fond clair de 96 puits à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 min. REMARQUE: L’utilisation de plaques inférieures transparentes est essentielle pour surveiller la croissance organoïde et la réponse aux médicaments.</li>
		<li>Pour le comptage, préparer une dilution 1:5 de la suspension cellulaire dans du PBS (volume total : 500 μL) et compter la suspension cellulaire à l’aide d’un analyseur cellulaire (voir tableau des matériaux). REMARQUE: Assurez-vous de multiplier par le facteur de dilution (x 5) pour obtenir la concentration cellulaire finale. D’autres méthodes de comptage telles qu’un hémocytomètre peuvent être utilisées. La viabilité cellulaire doit être surveillée à l’aide d’un test de coloration de viabilité (p. ex., avec Trypan Blue17). À l’aide d’un analyseur de cellules, la viabilité est évaluée automatiquement. La viabilité des suspensions organoïdes unicellulaires évaluée par l’analyseur cellulaire doit être ≥95 % (figure supplémentaire 1).</li>
		<li>Calculer le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer pour l’expérience. REMARQUE: La concentration d’ensemencement est de 1500 cellules / μL BME2, avec 5 μL BME2 nécessaires par puits (Nombre total: 7500 cellules / puits). Pour une plaque de 96 puits, 6 cellules 10E5 sont nécessaires. Cela comprend l’ensemencement de 60 puits avec des dômes organoïdes (4,5 x 10E5) et un surplus expérimental (calcul pour un total de 80 puits).</li>
		<li>Préparer une aliquote de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL par plaque de 96 puits prévue pour être ensemencée si plusieurs plaques de 96 puits sont incluses dans l’expérience. NOTE : Un surplus expérimental et des aliquotes distinctes par plaque de 96 puits ensemencée sont nécessaires pour tenir compte de l’augmentation du biais expérimental dû à la manipulation de l’EMB2.</li>
		<li>Cellules aliquotes de la suspension monocellulaire calculée (étape 2.2.3) après remise en suspension soigneuse par pipetage de haut en bas. Cellules à granulés à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez soigneusement le support à l’aide d’une pipette P200 sans toucher la pastille de cellule. Placez la pastille de cellule sur la glace sous peu (~1 min) et remettez en suspension la pastille de cellule dans BME2. REMARQUE: Les milieux résiduels peuvent compromettre la structure et la rigidité de BME2. Pipettez soigneusement tous les supports. Placez les cellules sur la glace rapidement pour acclimater la pastille cellulaire et permettre aux cellules d’être remises en suspension dans BME2 sans s’agglutiner. Gardez BME2 sur la glace en permanence pour qu’il reste à l’état liquide. Pour une plaque de 96 puits, 400 μL de BME2 sont nécessaires pour la remise en suspension de la pastille de cellule. Remettez en suspension les granulés de cellules avec soin, en évitant l’introduction de bulles.</li>
		<li>Inclinez votre plaque de 96 puits noire à fond clair préchauffée vers vous. Cellules à plaques utilisant 5 μL de suspension cellulaire par puits et ensemencement de dômes cellulaires à la position 6 heures de chaque puits (Figure 1A).  Ensemencez les dômes cellulaires dans les puits intérieurs restants (colonnes 2 à 10 et rangées B à G d’une plaque de 96 puits). REMARQUE : Le pipetage inversé18 est recommandé lors de la manipulation de BME2.</li>
		<li>Ne déplacez pas la plaque de 96 puits et n’incubez pas les dômes cellulaires fraîchement ensemencés dans la hotte à flux laminaire de culture cellulaire pendant 5 minutes à température ambiante. Déplacez ensuite la plaque vers l’incubateur de culture cellulaire et incurez-la pendant 10 min à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter soigneusement 100 μL de GM par puits à tous les puits contenant des organoïdes (colonnes 2 à 10 et rangées B-G d’une plaque de 96 puits). Ajouter 100 μL de PBS aux puits extérieurs au bord de la plaque.</li>
		<li>Culture BME2 a incorporé des organoïdes dans des milieux GM à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire pendant un total de 7 jours. Inspectez régulièrement la croissance des organoïdes au microscope optique. REMARQUE : Veuillez consulter la figure 1B et le tableau supplémentaire 1 pour obtenir un exemple des progrès de croissance prévus depuis l’ensemencement jusqu’au jour du traitement.</li>
		<li>Changez le support une fois après 3-4 jours de culture: faites pivoter la plaque dans le sens des aiguilles d’une montre de 180 ° (organoïdes maintenant à la position 12 heures), aspirez soigneusement GM de la position opposée au dôme organoïde à l’aide d’un appareil multicanal si disponible, puis ajoutez du GM frais.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Traitement de la toxicomanie
<ol><li>Préparer une dilution de médicament en série dans LGM pour le médicament de votre choix, par exemple l’osimertinib, afin de traiter les organoïdes du CPNPC mutants de l’EGFR. Inclure un témoin négatif (média LGM + 0,1 % de DMSO). Préparer suffisamment d’aliquotes de médicaments de toutes les doses en fonction du nombre de puits ensemencés plus le surplus expérimental. REMARQUE: Une série de dilution comprenant des doses de ≥8 et allant de 1 nM à 10 μM est recommandée pour les inhibiteurs ciblés.</li>
	<li>Faites pivoter la plaque organoïde dans le sens des aiguilles d’une montre de 180° (organoïdes maintenant à 12 heures). Aspirer soigneusement GM à l’aide d’un appareil multicanal de préférence. REMARQUE: Évitez de toucher le dôme organoïde tout en aspirant le GM, car cela pourrait entraîner une perte de biomasse organoïde et des résultats d’impact.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de témoin (p. ex. milieu LGM + 0,1 % de DMSO) ou une solution médicamenteuse par puits. REMARQUE : Veuillez vous référer à la Figure 1C pour le schéma de traitement de l’escalade de la toxicomanie en format plaque à 96 puits.</li>
	<li>Incuber des organoïdes traités à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 5 jours.</li>
</ol>4. Lecture par test de survie basé sur la luminescence
<ol><li>Lecture de la récolte et de la survie<ol>
<li>Effectuer le test de survie conformément à la référence 19.<ol>
<li>Réactif de décongélation (voir tableau des matières) pendant la nuit à 4 °C. Équilibrer le réactif au bain-marie à température ambiante pendant 30 min avant utilisation et mélanger en inversant.</li>
			<li>Ajouter un volume égal de réactif à chaque puits (100 μL par puits). Bien mélanger en pipetant de haut en bas, avec l’embout de la pipette placé à la position du dôme organoïde. Incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
			<li>À l’aide d’une pipette multicanal, transférer environ 75 % (150 μL) du lysat (étape 4.1.1.2) sur une nouvelle plaque blanche à fond opaque de 96 puits. REMARQUE: Le transfert de 75% des lysats dans une nouvelle plaque garantit l’absence de bulles dans la lecture ultérieure sans affecter la sensibilité du test.</li>
			<li>Incuber pendant 25 minutes supplémentaires à température ambiante dans l’obscurité.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA (temps d’intégration de 0,25-1 s/par puits) (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Enregistrez les données dans un format approprié, par exemple, un tableau de données contenant toutes les lectures brutes et l’enregistrement de la disposition des plaques et des médicaments utilisés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse de données à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique (voir Tableau des matières)<ol>
<li>Créez un nouveau tableau XY et insérez des données dans un format XY : les lignes (X) sont un contrôle négatif suivi d’une augmentation des doses de médicaments, avec des doses comme log [Inhibiteur] dans la concentration molaire. Les colonnes (Y) sont des valeurs de lecture qui incluent des répliques empilées avec des colonnes. REMARQUE: La concentration du témoin négatif doit être indiquée comme une valeur minimale (étant donné que 0 n’est pas possible dans l’échelle logarithmique), par exemple, log [Inhibiteur], M = -10.</li>
		<li>Normaliser les valeurs en sélectionnant Analyser &gt; Normaliser et en utilisant les paramètres suivants : normaliser chaque sous-colonne séparément, Y = 0 comme 0 %, « dernière valeur dans chaque sous-colonne (ou première, selon la plus grande des deux) » comme 100 %, donne des pourcentages, graphique les résultats.</li>
		<li>Ajuster la courbe de régression non linéaire sur les données normalisées en sélectionnant Analyser &gt; analyses XY &gt; Régression non linéaire &gt; Réponse dose - Inhibition &gt; log (inhibiteur) vs . réponse normalisée - Pente variable.</li>
		<li>Rapportez les résultats sous la forme d’un tableau des valeurs IC50 produites après une analyse de régression non linéaire et d’un graphique de la courbe de réponse, y compris les points de données normalisés sous forme d’écart-type moyen +/- et de courbe de régression ajustée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

T.G.B. est conseiller chez Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences, et reçoit des fonds de recherche de Novartis, Strategia, Kinnate et Revolution Medicines.

Ce manuscrit développe et décrit un protocole normalisé pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans les modèles d’AOP 3D dérivés du CPNPC. En plus des études de sensibilité aux médicaments, une caractérisation plus approfondie des modèles organoïdes disponibles est nécessaire pour déterminer les causes sous-jacentes des différences de sensibilité aux médicaments. Cela peut inclure le profilage génétique des organoïdes et des échantillons de patients et d’autres analyses disponibles pour les organoïdes, telles que la coloration immunohistochimique pour les marqueurs de différenciation et les biomarqueurs et la physiologie de la signalisation cellulaire générale13,29.
Étapes critiques du protocole Le protocole décrit ici fournit un flux de travail normalisé qui permet des analyses précises et reproductibles de la sensibilité aux médicaments lorsqu’elles sont suivies attentivement. Des précautions particulières doivent être prises dans les étapes suivantes: digestion trypLE et DNAse I pendant la génération de suspensions unicellulaires, ensemencement de suspensions unicellulaires dans BME2, surveillance de la croissance organoïde jusqu’au traitement, changements de milieu et perturbation et lyse des organoïdes incorporés BME2 pendant la lecture de la survie cellulaire basée sur la luminescence. (1) Bien qu’une digestion supplémentaire du DNAse I après dissociation des organoïdes à base de TrypLE ne soit pas essentielle pour l’expansion des modèles organoïdes lors de la maintenance régulière de la culture, la digestion DNAse I ne doit pas être omise lors de l’ensemencement pour les expériences d’escalade de médicaments, car elle assure une meilleure séparation des amas organoïdes en suspensions unicellulaires et un comptage précis des cellules. (2) L’ensemencement d’une suspension monocellulaire dans BME2 représente une étape critique compte tenu de la solidification de BME2 à température ambiante. Ainsi, un maximum de 1 à 2 rangées doit être ensemencé à la fois, et les échantillons doivent être placés sur la glace avant que des rangées supplémentaires ne soient ensemencées. Il convient de noter que les cellules doivent être pipetées de haut en bas lorsque l’ensemencement se poursuit pour permettre une suspension cellulaire homogène. (3) La croissance des organoïdes doit être surveillée attentivement pendant l’expansion de 7 jours, de l’ensemencement au traitement. Un exemple de l’évolution attendue est donné à la figure 1B et au tableau supplémentaire 1. Il convient de noter que l’évaluation des changements de taille des organoïdes par microscopie en champ clair et analyse d’images, comme présenté à la figure 1B , peut permettre une évaluation précise des différences de croissance des organoïdes et de temps de doublement. Les temps de doublement peuvent avoir un impact sur les réponses aux médicaments, comme on l’a récemment vu dans la littérature30. Si le taux de croissance organoïde dépasse de manière significative l’exemple présenté, un temps d’expansion plus court jusqu’au début du traitement et une durée de traitement plus courte peuvent être envisagés. (4) En outre, des précautions particulières doivent être prises lors du changement de support pour éviter d’aspirer les organoïdes. La position d’ensemencement des organoïdes incorporés BME2 à la position de 6 heures permet une aspiration sûre du support lorsque les plaques sont tournées dans le sens des aiguilles d’une montre de 180 ° et que le support est aspiré à la position opposée des organoïdes. (5) Enfin, une lyse approfondie des organoïdes incorporés dans la BME2 pendant la lecture de survie est essentielle pour enregistrer des résultats précis. Selon les instructions du fabricant, les échantillons doivent être pipetés de haut en bas à plusieurs reprises, idéalement à l’aide d’embouts non filtrés, pour assurer une lyse appropriée. Les temps d’incubation doivent être suivis comme décrit. De plus, le transfert de 75 % du lysat (au lieu du volume total) sur une plaque blanche opaque de 96 puits pour la lecture finale à l’aide d’un lecteur de plaque ELISA permet une évaluation appropriée, car cela garantit le même volume dans chaque puits et l’absence de bulles d’air qui peuvent être introduites par un pipetage vigoureux.
Il convient de noter que le profilage des réponses aux médicaments dans les cultures organoïdes incorporées dans la BME2 peut montrer un écart-type plus élevé que celui observé dans les cultures régulières de lignées cellulaires (figure 2, figure 3A). L’écart-type plus élevé est basé sur plusieurs facteurs, y compris une probabilité accrue de variations mineures dans l’ensemencement lors du travail avec BME2 et des différences dans les taux de croissance organoïdes individuels entre les puits au cours de la période de croissance initiale de 7 jours. Ainsi, des répétitions techniques égales ou supérieures à quatre répétitions techniques par concentration de médicament doivent être ensemencées.
Plus important encore, la présence de cellules malignes porteuses de la mutation du conducteur oncogène et la contamination limitée par les cellules épithéliales normales des voies respiratoires doivent être soigneusement évaluées. Les défis dans l’établissement du CPNPC peuvent favoriser l’excroissance des cellules épithéliales normales des voies respiratoires7. Le profilage des numéros de copie ou les approches basées sur la PCR et le séquençage pour confirmer la présence des mutations du pilote oncogène sont les méthodes de choix pour assurer la qualité des cultures organoïdes du CPNPC.
Modifications et dépannage de la méthode Les milieux et les facteurs de croissance respectifs ajoutés aux solutions de milieux de base peuvent avoir un impact significatif sur la réponse des médicaments aux inhibiteurs ciblés. Ils activent les récepteurs de dérivation et les voies de signalisation qui influencent et limitent la réponse aux médicaments (par exemple, FGF, HGF, EGF)26. Bien qu’un milieu riche en facteur de croissance et adapté puisse être optimal pour l’expansion de la culture organoïde, les évaluations de l’escalade et de la sensibilité des médicaments doivent être effectuées dans un milieu à facteur de croissance réduit, comme indiqué ci-dessus. Ceci est basé sur l’expérience interne de comparaison de différentes formulations de milieux et de données sur la réponse aux médicaments (Figure 3C). Alors que les solutions de milieux peuvent affecter le degré de sensibilité à certains traitements médicamenteux et peuvent modifier les valeurs de la CI50, des phénotypes robustes de sensibilité ou de résistance sont apparents quelle que soit la formulation du milieu (Figure 3C,D). En outre, la cohérence générale dans la formulation du milieu et le profilage des réponses médicamenteuses entre les cultures organoïdes sont recommandés, et un nombre égal ou supérieur à quatre répétitions techniques par concentration doit être ensemencé. Ceci est particulièrement important pour comparer les plages de sensibilité par rapport à. résistance à l’inhibiteur d’intérêt.
Limites de la méthode Le protocole présenté ici décrit la sensibilité des modèles organoïdes cancéreux 3D du CPNPC aux inhibiteurs ciblés lorsque des cellules cancéreuses dérivées de patients sont cultivées. Des expériences supplémentaires, y compris l’analyse pharmacodynamique concernant l’inhibition des voies et l’analyse du séquençage de la présence de l’oncogène conducteur et des mutations secondaires, sont nécessaires pour une caractérisation détaillée de la résistance aux médicaments et de la sensibilité. En outre, les facteurs de spectateur tels que les stimuli microenvironnementaux dérivés d’interactions ou les facteurs sécrétés par des cellules non cancéreuses dans le microenvironnement tumoral ne sont pas pris en compte, et de nouveaux protocoles sont nécessaires lorsque des modèles organoïdes de co-culture avec des cellules immunitaires ou stromales sont tentés. Des travaux récents ont mis en évidence l’utilisation de modèles organoïdes pour récapituler les interactions du microenvironnement tumoral et profiler les réponses aux inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, tels que le traitement anti-PD-L113,31.
L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes / alternatives Les modèles organoïdes cancéreux 3D récapitulent la diversité génétique et les déterminants de la réponse au traitement présents dans la tumeur d’origine4,5,6. Notamment, l’hétérogénéité spatiale et temporelle peut favoriser l’évolution tumorale, et l’émergence parallèle et le développement séquentiel de sous-clones tumoraux peuvent se produire32,33. L’hétérogénéité intratumorale est significative pour la sélection de cellules tumorales plus résilientes sous pression thérapeutique9,34,35. Le protocole fourni ici permet une évaluation rapide des sensibilités au traitement par inhibiteurs ciblés dans des échantillons proches du patient. Ainsi, les modèles organoïdes présentent des avantages par rapport aux modèles de lignées cellulaires homogènes plus conventionnels dépourvus de diversité génétique ou d’études à long terme utilisant des lignées cellulaires ou des xénogreffes dérivées de patients. De plus, le protocole actuel permet de passer à plusieurs branches de traitement et d’approches de traitement combinées avec peu de limitations en termes de coût et de capacité d’analyse. En tant que tel, l’ajout d’un deuxième médicament d’intérêt à une dose fixe tout en augmentant l’inhibiteur principalement ciblé et en le comparant à l’escalade de l’inhibiteur principalement ciblé seul permet d’évaluer efficacement les effets combinatoires potentiels et avec un minimum de biomasse supplémentaire requise (figure supplémentaire 3). Comparé aux évaluations basées sur l’imagerie utilisées pour surveiller le développement des organoïdes et la réponse aux médicaments, le test de survie cellulaire basé sur la luminescence décrit ici présente une sensibilité similaire avec un minimum d’équipement et de formation requis.
Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques Le développement d’un pipeline standardisé qui permet d’établir des modèles organoïdes cancéreux à partir d’échantillons de patients et le profilage ultérieur des sensibilités médicamenteuses présente un potentiel d’applicabilité clinique important. Le profilage pharmacologique ex vivo a été reconnu dans la détection des vulnérabilités et des caractéristiques associées à la résistance dans les tumeurs, en corrélation avec la réponse au traitement chez les patients36,37. De manière significative, le profilage ex vivo des sensibilités aux médicaments peut aider à la sélection du traitement en clinique et à la conception de traitements combinatoires rationnels traitant des mécanismes de résistance. Dans l’ensemble, cette approche pourrait aider à améliorer les stratégies personnalisées pour la thérapie moléculaire ou les schémas thérapeutiques combinatoires. Ce dernier peut aider à cibler les mécanismes de tolérance et de résistance aux médicaments à un stade précoce et à approfondir la réponse clinique afin d’améliorer les résultats pour les patients à l’avenir.

Les thérapies personnalisées contre les facteurs oncogènes ont révolutionné le traitement du cancer, améliorant la survie des patients et réduisant les effets secondaires médiés par le traitement1. Les progrès récents dans les technologies de diagnostic moléculaire et de séquençage ont mis en évidence la complexité des tumeurs humaines, l’hétérogénéité spatiale et temporelle ayant un impact sur la réponse au traitement2. La récapitulation de ces différences sous-clonales dans les modèles de culture cellulaire s’est longtemps limitée à l’étude de certaines altérations d’intérêt dans des lignées cellulaires par ailleurs uniformes. Les modèles d’AOP 3D nouvellement développés générés à partir de biopsies tumorales ou de résections chirurgicales de tumeurs permettent une meilleure représentation de la complexité cellulaire et de la diaphonie de signalisation dans le tissu tumoral dérivé du patient3. En tant que tels, des organoïdes tumoraux dérivés du cancer gastro-intestinal et du pancréas ont été générés avec succès et récapitulent la diversité génétique et les déterminants de la réponse au traitement4,5,6. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), les défis liés au développement et à l’établissement d’organoïdes sont reconnus, et l’optimisation des techniques de culture et des facteurs de milieux sélectifs est nécessaire pour permettre une utilisation plus large et plus systématique des AOP du CPNPC à l’avenir7,8.
Le développement de thérapies combinatoires ciblant les cellules tumorales résiduelles qui résistent au traitement médicamenteux initial est essentiel pour inhiber le développement de la résistance et, en fin de compte, améliorer la survie des patients9. Compte tenu de la complexité architecturale des cultures organoïdes, les paramètres classiques de réponse aux médicaments doivent être optimisés pour permettre des tests précis et reproductibles des sensibilités aux médicaments. Des lectures basées sur l’imagerie10,11 et des tests classiques de viabilité cellulaire mesurant l’abondance cellulaire de l’ATP6,12, entre autres techniques, sont disponibles pour profiler les réponses aux médicaments dans les cultures aOP. Ici, nous développons et décrivons un protocole standardisé pour évaluer les sensibilités médicamenteuses au traitement ciblé par rapport aux facteurs cliniques connus dans les modèles d’AOP du CPNPC.

<table><tbody><tr>Tubes de <td></td><td></td><td></td><td>1,5 mL</td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td><td>à centrifuger de 15 mL</td></tr><tr><td>Système de filtre/bouteille de stockage sous vide de 500 mL, 0,2 & micro ; m Pore 33.2 cm2 Membrane en nylon</td><td>Corning</td><td>430773</td><td>pour les deux milieux</td></tr><tr><td>96 puits, traité par culture cellulaire, plat à fond transparent Microplaque noire</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96 puits, traitée pour culture cellulaire, solide blanc Microplaque à fond plat</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>pour les deux milieux</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>pour LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>pour les deux médias</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>logiciel d’illustration scientifique en ligne</td></tr><tr><td>BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)</td><td>R& D Systems</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire (37 &deg ; C, 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire 3D</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>Réactif de lecture 3D-CTG</td></tr><tr><td>Centrifugeuse contenant des tubes</td><td></td><td></td><td></td>de centrifugation de 15 mL</tr><tr><td>Désoxyribonucléase I (DNAse I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>pour LGM</td></tr><tr><td>Logiciel GraphPad Prism (version 9.2.0)</td><td>Logiciel d’analyse statistique</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>pour les deux milieux</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>pour les deux supports</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à faible rétention, 20 & micro ; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à faible rétention, 200 & micro ; L (P200)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de longueur régulière, 1000 & micro ; L (P1000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td>multicanaux</tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-424-777</td><td>pour les deux milieux</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>pour les deux milieux</td></tr><tr><td>Osimertinib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>pour LGM</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV30010</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>Pipettes (différentes tailles)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Équipement SpectraMax M5</td><td>, des lecteurs alternatifs peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck Chem</td><td>S1077</td><td>pour GM</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide et tubes Vi-CELL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XR Analyseur de cellules Beckman</td><td>Coulter</td><td>Vi-CELL XR</td><td>analyseur / compteur de cellules</td></tr></tbody></table>

profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de cpnpc mutants egfr

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

De nouvelles cultures organoïdes cancéreuses 3D dérivées d’échantillons cliniques de patients représentent un système modèle important pour évaluer l’hétérogénéité intratumorale et la réponse au traitement aux inhibiteurs ciblés dans le cancer. Les travaux pionniers dans les cancers gastro-intestinaux et pancréatiques ont mis en évidence la promesse des organoïdes dérivés du patient (PDO) en tant que système de culture proche du patient, avec un nombre croissant de modèles émergents. De même, les travaux dans d’autres types de cancer se sont concentrés sur l’établissement de modèles organoïdes et l’optimisation des protocoles de culture. Notamment, les modèles organoïdes 3D du cancer maintiennent la complexité génétique des échantillons tumoraux originaux et traduisent ainsi les données de séquençage dérivées de la tumeur en traitement avec des thérapies ciblées génétiquement informées dans un cadre expérimental. En outre, les PDO pourraient favoriser l’évaluation de traitements combinés rationnels pour surmonter l’adaptation des tumeurs associée à la résistance à l’avenir. Ce dernier se concentre sur des efforts de recherche intenses dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), car le développement de la résistance limite finalement le succès du traitement des inhibiteurs ciblés. Une évaluation précoce des mécanismes thérapeutiquement ciblables à l’aide de PDO CPNPC pourrait aider à éclairer des traitements combinés rationnels. Ce manuscrit décrit un protocole normalisé pour l’évaluation sur plaque de culture cellulaire des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs ciblés dans les AOP 3D dérivées du CPNPC, avec une adaptabilité potentielle aux traitements combinés et à d’autres modalités de traitement.

Des défis considérables dans l’établissement d’organoïdes du CPNPC ont été notés7. Ainsi, il est passionnant de voir des travaux récents établissant des organoïdes du cancer du poumon et les utilisant pour des tests de traitement médicamenteux20,21,22. Les mutations egfr représentent 11,3 % des cas de CPNPC23. Le traitement ciblé par des inhibiteurs de l’EGFR représente l’option de traitement de première intention dans le CPNPC mutant de l’EGFR et a amélioré la survie globale et l’innocuité du traitement chez les patients24. Ce travail a déterminé la sensibilité à l’inhibiteur de la tyrosine kinase EGFR approuvé par la FDA osimertinib24,25 dans les organoïdes du CPNPC mutants EGFR. Les organoïdes du CPNPC mutants de l’EGFR ont été générés à partir d’échantillons de résection chirurgicale ou de biopsie tumorale de patients atteints de CPNPC et il a été confirmé qu’ils hébergeaient la mutation oncogène indiquée par séquençage de l’ADN. Comme indiqué ci-dessus, des modèles organoïdes de CPNPC mutants egFR ont été traités avec des doses croissantes d’osimertinib et la viabilité de l’AOP évaluée par lecture de la survie cellulaire basée sur la luminescence cinq jours après le début du traitement. Alors que les organoïdes TH107 positifs au mutant EGFR (EGFRdel19) présentaient une sensibilité au traitement par osimertinib avec une concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) de 56 nM (Figure 2A), les organoïdes TH116 positifs par mutant EGFR (EGFRL858R) étaient résistants au traitement par osimertinib avec une CI50 supérieure à 1 μM (Figure 2B). La sensibilité du CPNPC TH107 EGFRdel19 positif s’est accompagnée de changements transcriptionnels significatifs, notamment une réduction de l’expression des signatures génétiques associées au cycle cellulaire et une augmentation de l’expression des signatures génétiques associées à l’apoptose (figure supplémentaire 2A, B). À titre de référence, les données de réponse pour la lignée cellulaire sensible du CPNPC EGFRdel19 positif PC9 sont présentées (figure 3A,B). Ce dernier comprend l’analyse de survie à l’augmentation des doses d’osimertinib par un test de survie basé sur la luminescence 2D (Figure 3A) et l’étude de la suppression de la signalisation au niveau de la signalisation EGFR-MAPK par transfert Western (Figure 3B). Dans l’ensemble, ces données mettent en évidence l’exactitude du protocole actuel pour déterminer la réponse aux médicaments et faire la distinction entre les modèles d’AOP sensibles et résistants du CPNPC. D’autres analyses de l’organoïde EGFRL858R-positif TH116 et des échantillons cliniques disponibles sont nécessaires pour déterminer d’éventuelles altérations associées à la résistance.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg"> Figure 2 : Courbe de réponse au traitement des modèles organoïdes du CPNPC mutants de l’EGFR à l’escalade de l’osimertinib. (A) Réponse de l’osimertinib dans le modèle organoïde sensible EGFRdel19-positif TH107 NSCLC. (B) Réponse de l’osimertinib dans le modèle organoïde résistant EGFRL858R-positif TH116 NSCLC. Les points de données sont présentés sous forme de valeurs normalisées montrant l’écart-type moyen +/-, avec une courbe de régression non linéaire ajustée à travers les données. TH107, n = 6 réplications techniques par point de données. TH116, n = 4 réplications techniques par point de données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg"> Figure 3 : Données comparatives pour la réponse au traitement à l’osimertinib dans une lignée cellulaire sensible du CPNPC mutante de l’EGFR et des modèles organoïdes cultivés dans différents milieux. (A) Réponse à l’osimertinib dans la lignée cellulaire sensible du CPNPC PC9 positif à l’EGFRdel19, déterminée par un essai 2D-CTG standard. (B) Suppression de la signalisation dans les cellules PC9 après un traitement de deux jours par l’osimertinib (2 μM). (C) Réponse de l’osimertinib dans la culture sensible du modèle organoïde TH330 NSCLC EGFRL858R positif dans les milieux LGM et GM. (D) Réponse de l’osimertinib dans le modèle organoïde résistant AZ021 NSCLC dans les milieux LGM et GM. La confirmation de la mutation oncogène EGFRL858R dans AZ021 a échoué et peut être à l’origine de l’absence de réponse à l’osimertinib. Pour A et C-D, les points de données sont présentés sous forme de valeurs normalisées montrant l’écart-type moyen +/- avec une courbe de régression non linéaire ajustée à travers les données. PC9, n = 3 réplications techniques par point de données. TH330, n = 5 réplications techniques par point de données. AZ021, n = 6 réplications techniques par point de données. Un test de rang de Wilcoxon a été effectué sur des données normalisées pour déterminer la signification statistique. Pour TH330 (C), LGM vs GM, ** p = 0,0078. Pour AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Résultats représentatifs des analyseurs cellulaires pour le comptage et l’évaluation de la viabilité des modèles organoïdes mutants EGFR. TH107 et TH107BC se réfèrent à différents modèles organoïdes et A et B à des répliques biologiques. Pour chaque modèle et réplique biologique, trois répliques techniques sont comptées; tous affichent une viabilité ≥95 %. Une image représentative lors du comptage cellulaire est présentée à droite, montrant une viabilité robuste et une dissociation unicellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Analyse de l’enrichissement de l’ensemble de gènes (GSEA) à l’aide de données de séquençage de l’ARN en vrac obtenues pour les organoïdes du CPNPC TH107 mutants de l’EGFR, en comparant des témoins non traités (DMSO) et des cellules traitées avec osimertinib pendant 3 jours (OSI_D3).. (A-B) Après un traitement ciblé, les cellules sensibles subiront un arrêt du cycle cellulaire G1 et cesseront leur prolifération active. Comme une expression des gènes du cycle cellulaire G2M est associée à une prolifération active, un enrichissement nominal de l’expression dans le groupe témoin non traité (DMSO) est attendu. Pour les gènes liés à l’apoptose, un enrichissement nominal dans les cellules traitées (OSI_D3) est attendu. Les deux ont été confirmés dans le modèle organoïde du CPNPC TH107 mutant egFR traité avec l’osimertinib : (A) GSEA pour la signature d’expression Hallmark G2M (à gauche) montre un enrichissement dans les cellules traitées au DMSO. Score d’enrichissement nominal (NES): +1,708, FDR &lt; 0,0001. (B) GSEA pour hallmark Apoptosis expression signature (à droite) montre un enrichissement dans les cellules traitées à l’osimertinib. NES: -1,075, FDR: ns, 0,3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Traitement médicamenteux combinatoire dans un modèle organoïde TH330 mutant EGFR traité par escalade d’osimertinib en présence d’un deuxième inhibiteur additif à une concentration fixe. Les altérations associées à la résistance dans le CPNPC mutant EGFR, c’est-à-dire l’activation du SRC et de l’AXL26,27,28, ont été pharmacologiquement ciblées par traitement combinatoire avec l’inhibiteur du SRC Saracatinib (100 nM) ou l’inhibiteur de l’AXL R428 (500 nM), n = 6 répliques techniques par point de données. Les deux traitements combinatoires ont entraîné une augmentation de la réponse au traitement, ce qui est significatif pour l’association de l’osimertinib avec l’inhibiteur du SRC Saracatinib. La signification statistique a été évaluée par le test de rang de Wilcoxon : Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195 ; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Changement de la taille des organoïdes de l’ensemencement (d0) à 7 jours après le traitement (d7). (A) Développement de la croissance de l’organoïde TH107 du CPNPC EGFRdel19 positif. (B) Développement de la croissance de l’organoïde TH330 egFRL858R-positif au CPNPC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ce protocole décrit une évaluation standardisée des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs de signalisation ciblés dans des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC.

Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Ce protocole est important car le travail réussi avec les organoïdes réside dans les détails, et le champ manque de protocoles détaillés clairs à partir desquels les autres peuvent construire. Le plus grand avantage de cette technique est l’échelle de temps, les faibles besoins en biomasse et l’évolutivité à faible coût. Bien que beaucoup plus de travail soit nécessaire, cette technique pourrait aider à améliorer le traitement du cancer du poumon en permettant de tester des thérapies individuelles ou combinées plus précises qui pourraient être traduites cliniquement.Le plus grand défi consiste à manipuler BME2, largement connu sous le nom de Matrigel. Je recommande fortement de pratiquer le pipetage et la manipulation de BME2 liquide avant d’introduire vos précieux organoïdes. Commencez par dissocier la culture organoïde BME2 immergée en aspirant soigneusement le milieu des plaques de culture en évitant de toucher la culture.Trypsiniser la culture organoïde BME2 immergée avec une enzyme recombinante appropriée en ajoutant deux millilitres d’enzyme recombinante par puits dans une plaque de six puits. Briser mécaniquement le BME2 en piquant à plusieurs reprises de haut en bas et incuber des plaques à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifuger à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Aspirer soigneusement le surnageant enzymatique recombinant sans toucher la pastille organoïde et remettre en suspension la pastille organoïde dans un milieu de croissance. Après avoir ajouté la DNase 1, incuber la suspension pendant cinq minutes à température ambiante et centrifuger à 600 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Jetez soigneusement le support sans toucher la pastille organoïde et remettez-la en suspension dans un milieu de croissance frais.Préchauffez une nouvelle plaque de fond 96 puits noir clair à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 minutes, puis préparez une suspension cellulaire dans PBS pour compter les cellules à l’aide d’un analyseur cellulaire. Après avoir calculé le volume de suspension cellulaire requis pour l’expérience, aliquoter les cellules de la suspension unicellulaire et les granuler par centrifugation comme démontré précédemment. Une fois le milieu jeté, conservez les cellules sur la glace pendant environ une minute avant de les remettre en suspension dans BME2.Inclinez la plaque de fond 96 de fond clair noir préchauffée vers le corps et ensemencez cinq microlitres de suspension cellulaire par puits, puis ensemencez les dômes cellulaires à la position de six heures du puits. Remplissez les puits extérieurs au bord de la plaque de 96 puits avec du PBS et ensemencez les dômes cellulaires dans les puits intérieurs restants. Incuber des dômes cellulaires fraîchement ensemencés dans la hotte à flux laminaire de culture cellulaire pendant cinq minutes sans déplacer la plaque, puis transférer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pour une incubation à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ajouter soigneusement 100 microlitres de milieu de croissance par puits à tous les puits contenant des organoïdes et 100 microlitres de PBS aux puits extérieurs au bord de la plaque. Cultivez les organoïdes à 37 degrés Celsius pendant sept jours, changez de support selon les instructions mentionnées dans le manuscrit du texte, inspectez régulièrement la croissance des organoïdes au microscope optique. Préparer une dilution de médicament en série dans un milieu à faible facteur de croissance pour l’osimertinib afin de traiter les organoïdes du cancer du poumon non petites cellules mutants de l’EGFR.Inclure un contrôle négatif en ajoutant un milieu à faible facteur de croissance et 0,1 % de DMSO. Faites pivoter la plaque organoïde dans le sens des aiguilles d’une montre de 180 degrés de sorte que les organoïdes soient maintenant en position à 12 heures et aspirez soigneusement le milieu de croissance à l’aide d’un appareil multicanal de préférence. Ajouter 100 microlitres de solution témoin ou médicamenteuse par puits.Incuber à nouveau des organoïdes traités à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours. Commencez à effectuer le test de survie en décongelant le réactif pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Équilibrer le réactif au bain-marie à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation et mélanger en inversant.Ajouter 100 microlitres du réactif à chaque puits et bien mélanger en pipetant de haut en bas avec l’embout de la pipette placé à la position du dôme organoïde. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer environ 150 microlitres du lysat dans une nouvelle plaque de fond 96 puits blanche opaque, puis incuber la plaque pendant 25 minutes supplémentaires à température ambiante dans l’obscurité.Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA. Enregistrez les données dans un format de tableau de données approprié contenant toutes les lectures brutes et les enregistrements de la disposition des plaques et des médicaments utilisés. Les organoïdes TH107 positifs mutants EGFR ont montré une sensibilité au traitement par osimertinib avec une concentration inhibitrice demi-maximale de 56 nanomolaires tandis que les organoïdes TH116 positifs mutants EGFR étaient résistants au traitement par osimertinib avec une concentration inhibitrice demi-maximale supérieure à un micromolaire.La sensibilité des cellules cancéreuses du poumon non petites cellules EGFR-positives s’est accompagnée de changements transcriptionnels importants, notamment une réduction de l’expression des signatures génétiques associées au cycle cellulaire et une augmentation de l’expression de la signature génétique associée à l’apoptose. La réponse du mutant EGFR sensible au TH330 positif aux inhibiteurs ciblés est significativement affectée dans les milieux de croissance par rapport aux milieux à faible facteur de croissance. Les traitements combinatoires dans le TH330 positif au mutant EGFR ont entraîné une augmentation de la réponse au traitement.Cette approche améliore les stratégies personnalisées pour la thérapie moléculaire ou les schémas thérapeutiques combinatoires. Ce dernier aide à cibler les mécanismes de tolérance et de résistance aux médicaments à un stade précoce afin d’approfondir la réponse clinique et d’améliorer les résultats pour les patients.

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Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Une méthode est décrite pour créer des organoïdes à l’aide de xénogreffes dérivées du patient (PDX) pour le dépistage in vitro, ce qui donne des paires appariées de modèles in vivo/in vitro. Des tumeurs de PDX ont été moissonnes/traitées en petits morceaux mécaniquement ou enzymatiquement, suivies du Clevers' méthode pour cultiver des organoids de tumeur qui ont été passaged, cryopreserved et caractérisés contre le PDX original.

Création de paires de modèles appariés in vivo/in vitro dérivés du patient d’organoïdes dérivés de PDX et de PDX pour la recherche en pharmacologie du cancer

Un système de dosage in vitro à haut débit très précis a été développé pour évaluer les médicaments anticancéreux utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDO), similaires aux tissus cancéreux, mais ne conviennent pas aux systèmes de dosage in vitro à haut débit avec des plaques de 96 puits et 384 puits.

Test in vitro à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient

Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

Ce protocole décrit les étapes clés pour générer et caractériser les organoïdes 3D murins oraux-œsophagiens qui représentent les lésions de carcinome épidermoïde normal, prénéoplasique et épidermoïde induites par cancérogenèse chimique.

Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D

L’augmentation du nombre de biomarqueurs moléculaires à tester pour la prise en charge du cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-NSCLC) a entraîné la mise au point de méthodes de détection moléculaire rapides et fiables. Nous décrivons un flux de travail pour l’évaluation de l’altération génomique chez les patients atteints de NS-CPNPC à l’aide d’une approche de séquençage ultra-rapide de nouvelle génération (NGS).

Séquençage ultra-rapide de nouvelle génération basé sur l’amplicon dans le cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules

Ici, nous décrivons un protocole complet pour générer et utiliser des organoïdes de glioblastome modifiés en laboratoire (LEGO) pour étudier les dépendances génotype-phénotype et cribler des médicaments potentiels pour le traitement du glioblastome.

Culture organoïde de glioblastome conçue en laboratoire et criblage de médicaments

Ce protocole décrit une méthode simplifiée pour générer des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, appliquer un traitement médicamenteux et effectuer un séquençage d’ARN unicellulaire avant et après le traitement afin de caractériser les changements transcriptionnels associés au traitement.

Génération et analyse transcriptomique unicellulaire des organoïdes du carcinome hépatocellulaire après un traitement médicamenteux

Utilisant des tumeurs provenant de patients dans un modèle préclinique sous-cutanée est une excellente façon d'étudier l'efficacité de nouvelles thérapies, la découverte de biomarqueurs prédictifs et les voies résistantes aux médicaments. Ce modèle, dans le processus de développement de médicaments, est essentielle pour déterminer le sort de nombreuses thérapies anticancéreuses avant investigation clinique.

Développement et maintenance d&#39;une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l&#39;enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

Le protocole suivant est axé sur la mise en place d’une culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de patient (STS). Ce modèle pourrait nous aider à mieux comprendre la base moléculaire et le profil pharmacologique de ces tumeurs malignes rares et pourrait constituer un point de départ pour poursuivre les recherches visant à améliorer la gestion de STS.

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

Découvrez le profilage de sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR. Cette méthode permet d'évaluer la réponse à l'osimertinib et d'améliorer les stratégies de traitement personnalisé.

Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

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