Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

Ce protocole est important car le travail réussi avec les organoïdes réside dans les détails, et le champ manque de protocoles détaillés clairs à partir desquels les autres peuvent construire. Le plus grand avantage de cette technique est l’échelle de temps, les faibles besoins en biomasse et l’évolutivité à faible coût. Bien que beaucoup plus de travail soit nécessaire, cette technique pourrait aider à améliorer le traitement du cancer du poumon en permettant de tester des thérapies individuelles ou combinées plus précises qui pourraient être traduites cliniquement.

Le plus grand défi consiste à manipuler BME2, largement connu sous le nom de Matrigel. Je recommande fortement de pratiquer le pipetage et la manipulation de BME2 liquide avant d’introduire vos précieux organoïdes. Commencez par dissocier la culture organoïde BME2 immergée en aspirant soigneusement le milieu des plaques de culture en évitant de toucher la culture.

Trypsiniser la culture organoïde BME2 immergée avec une enzyme recombinante appropriée en ajoutant deux millilitres d’enzyme recombinante par puits dans une plaque de six puits. Briser mécaniquement le BME2 en piquant à plusieurs reprises de haut en bas et incuber des plaques à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifuger à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.

Aspirer soigneusement le surnageant enzymatique recombinant sans toucher la pastille organoïde et remettre en suspension la pastille organoïde dans un milieu de croissance. Après avoir ajouté la DNase 1, incuber la suspension pendant cinq minutes à température ambiante et centrifuger à 600 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Jetez soigneusement le support sans toucher la pastille organoïde et remettez-la en suspension dans un milieu de croissance frais.

Préchauffez une nouvelle plaque de fond 96 puits noir clair à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 minutes, puis préparez une suspension cellulaire dans PBS pour compter les cellules à l’aide d’un analyseur cellulaire. Après avoir calculé le volume de suspension cellulaire requis pour l’expérience, aliquoter les cellules de la suspension unicellulaire et les granuler par centrifugation comme démontré précédemment. Une fois le milieu jeté, conservez les cellules sur la glace pendant environ une minute avant de les remettre en suspension dans BME2.

Inclinez la plaque de fond 96 de fond clair noir préchauffée vers le corps et ensemencez cinq microlitres de suspension cellulaire par puits, puis ensemencez les dômes cellulaires à la position de six heures du puits. Remplissez les puits extérieurs au bord de la plaque de 96 puits avec du PBS et ensemencez les dômes cellulaires dans les puits intérieurs restants. Incuber des dômes cellulaires fraîchement ensemencés dans la hotte à flux laminaire de culture cellulaire pendant cinq minutes sans déplacer la plaque, puis transférer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pour une incubation à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ajouter soigneusement 100 microlitres de milieu de croissance par puits à tous les puits contenant des organoïdes et 100 microlitres de PBS aux puits extérieurs au bord de la plaque. Cultivez les organoïdes à 37 degrés Celsius pendant sept jours, changez de support selon les instructions mentionnées dans le manuscrit du texte, inspectez régulièrement la croissance des organoïdes au microscope optique. Préparer une dilution de médicament en série dans un milieu à faible facteur de croissance pour l’osimertinib afin de traiter les organoïdes du cancer du poumon non petites cellules mutants de l’EGFR.

Inclure un contrôle négatif en ajoutant un milieu à faible facteur de croissance et 0,1 % de DMSO. Faites pivoter la plaque organoïde dans le sens des aiguilles d’une montre de 180 degrés de sorte que les organoïdes soient maintenant en position à 12 heures et aspirez soigneusement le milieu de croissance à l’aide d’un appareil multicanal de préférence. Ajouter 100 microlitres de solution témoin ou médicamenteuse par puits.

Incuber à nouveau des organoïdes traités à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours. Commencez à effectuer le test de survie en décongelant le réactif pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Équilibrer le réactif au bain-marie à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation et mélanger en inversant.

Ajouter 100 microlitres du réactif à chaque puits et bien mélanger en pipetant de haut en bas avec l’embout de la pipette placé à la position du dôme organoïde. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer environ 150 microlitres du lysat dans une nouvelle plaque de fond 96 puits blanche opaque, puis incuber la plaque pendant 25 minutes supplémentaires à température ambiante dans l’obscurité.

Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA. Enregistrez les données dans un format de tableau de données approprié contenant toutes les lectures brutes et les enregistrements de la disposition des plaques et des médicaments utilisés. Les organoïdes TH107 positifs mutants EGFR ont montré une sensibilité au traitement par osimertinib avec une concentration inhibitrice demi-maximale de 56 nanomolaires tandis que les organoïdes TH116 positifs mutants EGFR étaient résistants au traitement par osimertinib avec une concentration inhibitrice demi-maximale supérieure à un micromolaire.

La sensibilité des cellules cancéreuses du poumon non petites cellules EGFR-positives s’est accompagnée de changements transcriptionnels importants, notamment une réduction de l’expression des signatures génétiques associées au cycle cellulaire et une augmentation de l’expression de la signature génétique associée à l’apoptose. La réponse du mutant EGFR sensible au TH330 positif aux inhibiteurs ciblés est significativement affectée dans les milieux de croissance par rapport aux milieux à faible facteur de croissance. Les traitements combinatoires dans le TH330 positif au mutant EGFR ont entraîné une augmentation de la réponse au traitement.

Cette approche améliore les stratégies personnalisées pour la thérapie moléculaire ou les schémas thérapeutiques combinatoires. Ce dernier aide à cibler les mécanismes de tolérance et de résistance aux médicaments à un stade précoce afin d’approfondir la réponse clinique et d’améliorer les résultats pour les patients.