Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie tumorale sur les micrométastases trouvées chez les patients atteints d’un cancer du côlon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une détection très sensible avec des micrométastases induites par des organoïdes de cancer du côlon marqués à la GFP et dérivés de patients chez la souris. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il peut être difficile de détecter les micrométastases dérivées d’organoïdes de tumeurs du côlon dans des organes distants chez la souris.

Kosuke Mizukoshi et Yu Koyama, tous deux doctorants et chirurgiens de mon groupe, feront la démonstration de la procédure avec Yu Okazawa. Pour générer des organoïdes de cellules cancéreuses colorectales humaines, ajoutez d’abord 150 microlitres de matrice extracellulaire artificielle par puits à une plaque de 12 puits sur glace. Lorsque tous les puits ont été revêtus, incubez la plaque pendant 30 à 60 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pour solidifier les gels.

Ensuite, réintroduisez une pastille de cellules de xénogreffe tumorale dérivée d’un patient dans un milieu de culture organoïde de cancer colorectal frais complété par 5 % de sérum de veau fœtal, ou FCS, pour atteindre une concentration de trois fois 10 à cinq cellules par millilitre, et ensemencez un millilitre de cellules dans chaque matrice extracellulaire artificielle. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, transférez soigneusement les surnageants de culture, y compris les cellules flottantes, dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour leur centrifugation, et remettez les granulés en suspension dans 70 microlitres de matrice extracellulaire artificielle fraîche sur de la glace.

Pour augmenter la viabilité des cellules cancéreuses colorectales, superposez la cellule tumorale flottante contenant de la matrice extracellulaire artificielle sur les puits recouverts de matrice extracellulaire artificielle et incubez les cultures de cellules tumorales pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque le nouveau gel de matrice extracellulaire s’est solidifié, nourrissez les cultures avec un millilitre de milieu de culture de cellules organoïdes de cancer colorectal frais complété par 1 % de FCS, et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire. Après sept à 10 jours de culture, détachez mécaniquement les organoïdes à l’aide d’un grattoir cellulaire stérile et transférez les organoïdes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour leur centrifugation.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de PBS avec un léger tapotement pour une autre centrifugation. Pour dissocier les organoïdes du cancer colorectal, ajoutez 500 microlitres de solution d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques dans les tubes, et mélangez en tapotant doucement. Après 10 minutes à température ambiante, ajoutez 500 microlitres de milieu complété par 1 %FBS aux cellules, et pipetez très doucement la suspension cellulaire plusieurs fois pour briser les organoïdes.

Le pipetage en douceur des organoïdes humains du CCR pendant le traitement est essentiel pour maintenir une formation de sphéroïdes intacte en culture. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez les granules en suspension dans 100 microlitres de stock de lentivirus 5X GFP et 400 microlitres de milieu de culture organoïde frais du cancer colorectal. Il est essentiel d’infecter les organoïdes humains du CCR avec un titre élevé de lentivirus GFP, en particulier pour obtenir une infection de près de 100 % du CCR.

Ajustez le volume dans chaque tube pour obtenir une quintuple de 10 à cinq cellules tumorales dissociées par 500 microlitres de concentration moyenne, et placez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle à 12 puits, comme démontré. Après 18 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, transférez les surnageants flottants contenant des cellules dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation, suivie d’une remise en suspension des granulés dans 70 microlitres de matrice extracellulaire artificielle par tube sur de la glace. Pour améliorer la viabilité des cellules cancéreuses colorectales, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les organoïdes tumoraux dans la plaque à 12 puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.

Lorsque l’enrobage artificiel de la matrice extracellulaire s’est solidifié, nourrissez les cultures avec un millilitre de milieu de culture organoïde CRC frais complété par 1 % de FCS, et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Ensuite, observez les cellules infectées par microscopie à fluorescence pour confirmer une positivité de la GFP de près de 100 %, et renvoyez les cellules dans l’incubateur pendant quatre à six jours supplémentaires. Établir un modèle murin de métastases spontanées de xénogreffes tumorales dérivées de patients atteints de CCR, dissocier les organoïdes marqués à la GFP comme démontré et diluer les suspensions de cellules tumorales uniques à cinq fois 10 pour cinq cellules tumorales par 50 microlitres de PBS complétées par une concentration de matrice extracellulaire artificielle de 50 %.

Chargez 50 microlitres de cellules par souris dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 22 et placez les cellules tumorales sur de la glace. Ensuite, confirmez une absence de réponse au pincement de l’orteil et placez la première souris NOG anesthésiée en position couchée sur la paillasse du laboratoire. À l’aide d’une pince à épiler stérile, retirez doucement la muqueuse rectale de l’anus et injectez immédiatement les cellules tumorales dans la sous-muqueuse rectale.

Pour établir un modèle expérimental de métastases de xénogreffes tumorales dérivées de patients atteints de CCR, diluez les suspensions de cellules tumorales uniques à quatre fois 10 pour une concentration de quatre cellules par 50 microlitres, et chargez 50 microlitres de cellules par souris dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 22. Placez la première souris NOG anesthésiée en position couchée sur le banc et faites une petite incision dans la région inférieure du flanc gauche. Utilisez des ciseaux et une pince à épiler stériles pour couper soigneusement le péritoine et exposer la rate, et utilisez la pince à épiler pour saisir la graisse attachée à la rate.

Ensuite, injectez lentement 50 microlitres de suspension de cellules tumorales dans la rate, en veillant à ce qu’aucune fuite ne soit observée. Une fois que toutes les souris ont été injectées et suturées si nécessaire, retournez les animaux dans leurs cages d’origine et vérifiez la fuite de suture et la viabilité un jour après la livraison des cellules tumorales. Utilisez des pieds à coulisse pour mesurer les tumeurs chaque semaine, en récoltant les tumeurs primaires et les tissus pertinents jusqu’aux critères expérimentaux appropriés.

Transférez les tumeurs et les organes disséqués dans cinq millilitres de PBS glacé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres sur de la glace, et observez les tissus disséqués au microscope à stéréofluorescence pour évaluer leur expression GFP. L’infection organoïde du CCR par le lentivirus GFP, comme démontré, entraîne l’expression d’une GFP très brillante chez presque tous les organoïdes. L’injection orthotopique et intrasplénique des organoïdes marqués à la GFP chez des souris NOG receveuses secondaires révèle la formation de tumeurs primaires positives à la GFP au niveau du site orthotopique, ainsi que dans les poumons de la majorité des souris examinées à 2,5 mois après l’injection.

De plus, des métastases hépatiques sont observées chez les animaux NOG receveurs un mois après l’injection intrasplénique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les micrométastases des organoïdes de cellules cancéreuses colorectales humaines marquées à la GFP après leur introduction chez les souris receveuses. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’efficacité de localisation des tumeurs et des métastases des organoïdes de cellules cancéreuses du côlon humain chez la souris dépend en grande partie de la variabilité interpatiente des cellules tumorales d’origine.