Étiquetage des xénogreffes de patients dérivés cancer du sein avec traçables Reporters pour la croissance tumorale et la métastase études

L’objectif global de ce protocole de transduction est d’introduire de manière stable des gènes rapporteurs dans les xénogreffes dérivées de patients, ou PDX, afin de faciliter leur utilisation dans des modèles expérimentaux et spontanés de métastases. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer, telles que l’étendue des métastases excutanées provenant de xénogreffes dérivées de patients. Le principal avantage de cette technique est que les PDX marqués peuvent être suivis, à l’aide de l’imagerie in vivo, ce qui facilite l’évaluation de métastases spécifiques organisées sans l’analyse histologique post-mortem approfondie.

Jessica Finlay-Schultz, post-doc, fera la démonstration de ce protocole, et l’appliquera régulièrement pour l’étiquetage des xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein. En utilisant une technique aseptique, commencez par utiliser un scalpel pour couper la peau autour de la tumeur. Ensuite, tirez la peau avec une pince et utilisez un scalpel propre pour séparer la peau de la tumeur.

Lorsque la tumeur est complètement exposée, utilisez une pince et un scalpel propres pour transférer le tissu dans cinq millilitres de produit de lavage sur de la glace. Ensuite, jetez le milieu et lavez la tumeur deux fois avec 10 millilitres de HBSS, complété par HEPES. Placez la tumeur rincée dans une plaque de culture tissulaire stérile et pré-pesée de 60 centimètres et pesez la plaque pour estimer la masse tumorale.

À l’aide d’un scalpel, coupez la tumeur en deux. Ensuite, coupez un disque de trois millimètres dans l’une des moitiés et placez le disque dans du formol à 10 % pendant 24 heures. Ajoutez 200 microlitres de HBSS avec HEPES au reste de la tumeur et utilisez une pince et un scalpel propre pour hacher le tissu en petits morceaux possibles.

Transférez les fragments dans un tube conique stérile de 50 millilitres et ajoutez au moins un millilitre de tampon de digestion, complété par des antimicotiques et des antibiotiques pour 100 milligrammes de tumeur. Après trois heures à 30 degrés Celsius et une rotation de 125 à 200 par minute, ajoutez 35 millilitres de produit de lavage pour arrêter la digestion et filtrez la boue tissulaire résultante à travers un treillis en nylon de 70 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, pour éliminer tout tissu non digéré. Recueillez les cellules par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges, pendant cinq minutes à température ambiante.

À la fin de la lyse, restaurez la tonicité avec 10 millilitres de tampon de lavage, et filtrez les cellules à travers un filtre de 40 microns pour éliminer les grumeaux. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de lavage sur de la glace. Comptez ensuite le nombre de cellules viables en excluant le bleu trypan.

Pour enrichir les cellules cancéreuses épithéliales humaines en utilisant la déplétion des cellules de lignée et de Mel, transférez jusqu’à une fois dix à la septième cellules dans un nouveau tube en polypropylène de cinq millilitres et ajoutez deux millilitres de tampon d’enrichissement épithélial aux cellules. Prélevez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette pour éliminer complètement le surnageant. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 40 microlitres de tampon d’enrichissement épithélial glacé et ajoutez 10 microlitres de cocktail d’anticorps à la biotine par un fois dix aux septièmes cellules.

Mélangez par pipetage doux et incubez la solution cellulaire pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, mélangez les cellules avec 30 microlitres de tampon d’enrichissement épithélial par une fois dix jusqu’aux septièmes cellules. Suivi de l’ajout de 20 microlitres de microbilles d’antibiotine avec mélange doux.

Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules dans trois millilitres de tampon d’enrichissement épithélial froid et aspirez soigneusement le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon d’enrichissement épithélial sur de la glace et placez une colonne dans un séparateur magnétique. Rincez la colonne avec 0,5 millilitre de tampon d’enrichissement épithélial.

Et placez un nouveau tube de collecte en polypropylène sous la colonne. Ajoutez ensuite lentement les cellules étiquetées sur la colonne. Collecte de la fraction de cellules tumorales enrichie, non marquée, négative à la lignée, suivie de trois rinçages en colonne avec 500 microlitres de tampon d’enrichissement épithélial frais.

Pour transduire les cellules tumorales, centrifugez les cellules isolées pour les remettre en suspension dans deux millilitres de milieu de mammosphère. Après avoir compté, centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans 2 millilitres de milieu de mammosphère, complété par 20 microlitres de polybrène. Ensuite, plaquez deux fois dix à la cinquième cellules tumorales viables par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits à très faible adhérence, et ajoutez des particules lentivirales aux cellules à une multiplicité d’infection de 10.

Faites tourner la plaque pour mélanger le virus avec les cellules. Et incubez les co-cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 96 heures. Ajout de 500 microlitres de milieu de mammosphère frais après les premières 24 heures.

Lorsqu’au moins 10 % des cellules sont positives à la GFP, transférez les cellules de transduction d’au moins un puits dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace et lavez le puits avec un millilitre de milieu de mammographie. Mettez le lavage en commun avec les cellules et centrifugez les cellules tumorales dans 10 millilitres de HBSS plus HEPES. Enfin, remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres d’extrait de matrice de socle sur de la glace.

Et chargez les cellules intégrées dans une seringue à insuline de 0,5 millilitre pour la réimplantation. Certains vecteurs fioles à titre élevé expriment un marqueur fluorescent qui permet d’estimer l’efficacité de la transduction in vitro, dès 24 heures après l’infection. Pour la plupart des PDX, l’expression de la GFP sera retardée jusqu’à 72 heures après l’infection.

À ce moment-là, la formation d’agrégats cellulaires est couramment observée. Après la suspension de la matrice extracellulaire et la réimplantation, les cellules tumorales marquées régénèrent des tumeurs qui peuvent être suivies à l’aide de la bioluminescence ou de la fluorescence. Un PDX étiqueté avec succès sera positif à près de 100 % à la GFP de la première génération après la transduction, et le restera dans les passages suivants.

Cependant, certains PDX présenteront une distribution inégale de cellules GFP positives, indiquant une transduction in vitro sous-optimale. La coloration immunohistochimique du tissu tumoral révèle que l’expression de marqueurs critiques, tels que le récepteur du facteur de croissance épidermique et les cytokératines pan, est conservée même après plusieurs passages et réimplantations. Les modèles expérimentaux de métastases offrent une alternative à l’étude du tropisme des organes et des étapes de colonisation des organes dans la cascade métastatique.

En effet, un PDX transduit injecté à 2,5 fois dix à la cinquième cellules par souris, forme des métastases dans le foie qui sont facilement identifiables par imagerie luciférase in vivo. Et dans les poumons, cela peut être visualisé par microscopie à fluorescence ex vivo. Une fois maîtrisés, la dissociation et le marquage des PDX prennent environ 4 heures.

L’expansion réelle de la tumeur peut prendre 8 à 12 semaines selon la tumeur et le système utilisé. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important d’utiliser un virus à titre élevé avec un gène rapporteur, afin de pouvoir surveiller à la fois l’efficacité de la transfection et la croissance tumorale in vivo. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que des études de métastases in vivo peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur la progression tumorale, les métastases et la réponse aux traitements.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs sur le cancer du sein pour explorer de multiples aspects de la progression tumorale, en utilisant de nouveaux modèles PDX qui représentent mieux l’hétérogénéité tumorale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les cellules tumorales dissociées avec des particules lentivirales à titre élevé. Ce qui vous permettra à la fois de tracer les cellules tumorales in vivo et potentiellement de manipuler l’expression des gènes d’intérêt.

N’oubliez pas que travailler avec des particules lentivirales peut être extrêmement dangereux et que vous devez toujours prendre les précautions appropriées lors de l’exécution de cette procédure.