Quantification des coûts de la condition physique chez les moustiques transgéniques Aedes aegypti

Le présent protocole décrit comment mesurer les données des paramètres de vie communs chez les moustiques Aedes aegypti , y compris la fécondité, la taille des ailes, la fertilité, le rapport des sexes, la viabilité, les temps de développement, la contribution des mâles et la longévité des adultes. Ces mesures peuvent être utilisées pour évaluer la valeur adaptative des moustiques transgéniques.

Ce protocole démontre des mesures standard, reflétant la valeur adaptative, chez les moustiques aedes aegypti, ces paramètres de valeur adaptative ont été choisis parce qu’ils reflètent le succès de la reproduction, sont simples à mesurer et sont couramment rapportés dans la littérature. Pour commencer, placez les papiers d’œufs dans de l’eau stérile pendant la nuit dans l’insectorie pour faire éclore des moustiques transgéniques et sauvages. Laissez les larves se nourrir à volonté en fournissant plusieurs gouttes de lisier de nourriture pour poissons moulus.

Pour vous assurer que les adultes sont vierges, séparez les pupes par sexe une fois qu’elles émergent, déplacez la chrysalide sur une lame de microscope en verre et retirez l’excès d’eau avec du tissu pour immobiliser la nymphe. Sous un stéréoscope à un grossissement de deux à quatre fois, à l’aide d’un pinceau à pointe fine, positionnez la chrysalide face vers le haut. Ensuite, analysez visuellement la queue pour détecter les différences de forme du lobe génital.

Placez les pupes mâles et femelles dans des gobelets d’eau séparés dans un confinement approprié. Pour croiser un robot de forage génétique ou transgénique un ou deux mâles en masse avec des femelles vierges de type sauvage, ajoutez des moustiques anesthésiés dans des proportions de cinq mâles pour une femelle dans des boîtes à moustiques contenant environ 150 moustiques. Après deux à trois jours, fournissez une source de sang sur la cage pour nourrir les femelles en suivant les pratiques d’élevage habituelles.

Triez les femelles nourries au sang des femelles non nourries en dépistant visuellement leur abdomen pour l’engorgement et en jetant les femelles non nourries partiellement, nourries et les mâles. Remettez les femelles engorgées dans leurs cages respectives. Après deux à trois jours, placez les femelles individuelles dans des tubes coniques de 50 millilitres tapissés de papier filtre pré-étiqueté avec un crayon.

Remplissez tous les tubes avec cinq millilitres d’eau du robinet. Placez un petit morceau de boule de coton imbibée de raisins secs ou de sucre sur chaque tube conique. Laissez les femelles dans l’insectoire pendant un à deux jours et laissez-les pondre.

Comptez ensuite le nombre d’œufs sur chaque papier et calculez la fécondité moyenne, c’est-à-dire le nombre d’œufs comptés sur chaque papier divisé par le nombre de femelles dépistées. Pour sécher les feuilles d’œufs, égouttez l’eau des tubes et remettez-les dans l’intérieur. Pour congeler les femelles nourries de sang de l’étude de fécondité terminée, placez les cages à moustiques à moins 20 degrés Celsius pendant environ 15 minutes.

Disséquez l’aile gauche de chaque moustique, en excisant l’articulation de l’aile et du thorax et en enlevant toute l’aile. À l’aide d’une pince, placez l’aile à plat sur une lame de verre, puis ajoutez une goutte de la solution mère de 15 millilitres comprenant 70 % d’éthanol et une goutte de savon à vaisselle sur l’aile de la lame à l’aide d’une pipette de transfert. Ensuite, ajoutez une goutte de glycérol à 80 % dans la lamelle et placez-la sur le dessus de l’aile dans la solution de savon à l’éthanol.

Photographiez les ailes montées sur les toboggans à l’aide d’un appareil photo avec un objectif de 65 millimètres. Utilisez le logiciel TpsDig pour identifier les coordonnées cartésiennes bidimensionnelles des points de repère. Calculez la longueur et la surface de l’aile à l’aide de l’écriture R fournie dans le manuscrit.

Calculez la taille du centroïde de l’aile, qui est une mesure de la taille, statistiquement indépendante de la forme définie comme la racine carrée de la somme des distances carrées de chaque point de repère à partir du point central de l’aile Éclore des œufs individuels F1 des papiers collectés sur des femelles individuelles dans des récipients de charcuterie transparents en polypropylène contenant 100 millilitres d’eau déminéralisée fraîchement stérilisée. Deux à trois jours après l’éclosion, retirez les papiers d’œufs de l’eau et laissez-les sécher pendant la nuit. Faites éclore à nouveau les papiers d’œufs dans les mêmes contenants dans lesquels ils ont été initialement éclos.

Trois à cinq jours après l’éclosion initiale, inspectez visuellement les larves à la recherche d’un marqueur transgénique. Notez le nombre de larves transgéniques positives ou négatives. Jetez les larves négatives.

Calculez la fertilité en divisant le nombre de larves transgéniques ou témoins par le nombre total d’œufs. Pour déterminer le rapport de masculinité, ajoutez le nombre de femelles ou le nombre de mâles collectés au cours de la période d’étude par moustique femelle adulte. Divisez ce nombre par le nombre de pupes collectées pour la même lignée de moustiques générée par une seule femelle.

Pour déterminer la viabilité des larves, ajoutez le nombre total de pupes collectées au cours de la période d’étude par moustique femelle adulte. Divisez ce nombre par le nombre de larves comptées par moustique femelle adulte pour la même ligne comptée précédemment. Calculez le temps moyen de développement des larves aux pupes après l’éclosion.

Pour déterminer la contribution mâle, croisez 50 mâles transgéniques ou témoins avec 100 femelles témoins dans des cartons de 64 onces de sorte qu’il y ait 50 mâles avec 100 femelles. Après l’accouplement, offrez aux moustiques un repas de sang, en suivant les pratiques d’élevage standard. Ensuite, séparez les femelles individuelles complètement engorgées en tubes coniques de 50 millilitres tapissés de papier filtre blanc pré-étiqueté.

Laissez les femelles pendant un à deux jours dans l’insectoire et laissez-les pondre. Laissez les papiers sécher en tubes dans l’insectorice pendant au moins cinq jours. Utilisez une pince pour retirer les papiers et les placer pour les hachure.

Deux à trois jours après l’éclosion, retirez les papiers d’œufs de l’eau et laissez-les sécher. Faites éclore à nouveau les feuilles d’œufs dans les mêmes récipients. Trois à cinq jours après l’éclosion initiale, inspectez visuellement les larves à la recherche d’un marqueur transgénique.

Calculez la contribution des mâles en divisant le nombre de larves transgéniques F2 par le nombre total de larves par ligne de moustique. Transférez 50 moustiques mâles et 50 femelles de type sauvage ou transgénique non nourri au sang dans un enclos approprié. Suivez le nombre de moustiques mâles et femelles morts chaque jour.

Calculez la longévité comme le nombre moyen de jours écoulés avant que les moustiques ne meurent dans les cages, en omettant les moustiques qui meurent de causes non informatives. Les temps de développement entre les larves et les pupes adultes et entre les pupes et les adultes ont été évalués à l’aide d’une ANOVA de Kruskal-Wallis et de comparaisons post-hoc de Dunn. Les moustiques mâles de type sauvage avaient un temps de nymphose plus court que les femelles de type sauvage, tandis que les mâles de D7L1 ne différaient pas significativement dans leur temps de nymphose par rapport aux femelles D7L1.

Les femelles D7L1 ont mis plus de temps à atteindre la nymphose que les femelles de type sauvage, tout comme les mâles de type D7L1, par rapport aux mâles de type sauvage. En ce qui concerne le temps de développement des pupes à l’âge adulte, les femelles de type sauvage et D7L1 ne différaient pas significativement, les mâles de type sauvage se nymphosent plus rapidement que les femelles de type sauvage et les mâles de type D7L1. Les moustiques femelles de type sauvage n’ont jamais atteint leur temps de survie médian au cours de l’étude.

Tous les autres groupes ont atteint leur survie médiane avant 40 jours, avec une séparation temporelle distincte des temps de survie médians. Les moustiques D7L1 avaient une surface alaire significativement plus petite que leurs homologues de type sauvage, mais il n’y avait aucune différence dans la taille des ailes ou du centroïde. Les moustiques hébergeant une copie d’une cassette de forçage génétique sous l’expression des promoteurs nanos ou ZPG n’avaient pas de valeur adaptative significativement différente par rapport à la ligne large de l’œil de Higgs, à l’exception notable de la viabilité des larves.

Les données de fitness collectées ici peuvent être utilisées dans des applications en aval telles que la modélisation mathématique. Pour les études évaluant de nouvelles stratégies de contrôle génétique, des études plus importantes en cage dans des conditions semi-naturelles seraient nécessaires après les études de condition physique de petites compétences décrites ici. Les études de condition physique en laboratoire aident à identifier les effets non intentionnels des knock-outs ou knock-ins.

L’élimination d’une protéine salivaire peut induire un stress développemental, tandis que le forçage génétique chez les moustiques de forçage génétique un et deux a montré des taux de survie des larves plus faibles. La mesure de la valeur adaptative du forçage génétique a fortement influencé sa persistance dans la simulation des populations après modélisation mathématique.