Name: Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Apprenez à récolter et cultiver des cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées primaires chez la souris avec une pureté supérieure à 95 %. Cette méthode permet d'étudier leurs fonctions cellulaires et implications cliniques en neurosciences.

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L’étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81960226, 81760223), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) et de la Fondation de recherche scientifique du Département de l’éducation de la province du Yunnan (2023Y0784).

Cette recherche a reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Toutes les expériences ont respecté les lignes directrices établies en matière de soins aux animaux. Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) ont été prélevées sur des souris mâles C57Bl/6J âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 25 g. Ces souris ont été achetées à l’Université de médecine de Kunming, en Chine. L’ensemble de la procédure expérimentale s’est déroulé dans des conditions stériles strictes. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Préparation des réactifs et des instruments
REMARQUE : Toutes les étapes impliquant des solutions doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire à risques biologiques de classe II.
<ol><li>Préparez le tampon de lavage en mélangeant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du calcium et du magnésium, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux). Conservez ce tampon au froid à 4 °C. Il est indispensable de le préparer frais le jour de l’utilisation et de dégazer le tampon.</li>
	<li>Préparez les enzymes digestives en combinant 10 mL de PBS (sans calcium ni magnésium) avec 2 mL de trypsine à 0,25 %, 1 mL de papaïne à 20 mg/mL et 200 μL de collagénase I à 1 mg/mL (voir le tableau des matériaux). NOTA : S’assurer d’utiliser des aliquotes de volumes appropriés pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Conserver ces aliquotes à -20 °C.</li>
	<li>Préparez le milieu de culture à l’aide de la trousse de milieu de croissance de cellules endothéliales disponible dans le commerce, qui comprend le VEGF-C (100 ng/mL) et 1 % de P/S (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparez le tampon d’arrêt en complétant le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pour arrêter le processus de digestion.</li>
	<li>Préparez des instruments chirurgicaux stériles : ces instruments doivent inclure des ciseaux, une pince à épiler à pointe dentelée et une pince à épiler à pointe fine.</li>
</ol>2. Revêtement de flacon
<ol><li>Enduire le flacon T25 d’une solution de fibronectine à 100 μg/mL (voir tableau des matériaux) et incuber toute la nuit à 37 °C. Avant utilisation, retirez la solution de revêtement à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Lavez le flacon trois fois avec du PBS, aspirez ensuite le PBS et laissez le flacon T25 sécher à l’air libre.</li>
</ol>3. Dissociation des leptoméninges
REMARQUE : Utilisez toujours des tampons et des solutions pré-refroidis à 4 °C.
<ol><li>Anesthésiez les souris avec une inhalation excessive de 4% d’isoflurane, puis sacrifiez-les par décapitation rapide à l’aide de ciseaux préalablement nettoyés avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Incisez soigneusement la peau le long de la ligne médiane, en commençant par l’ouverture à l’arrière du crâne et en s’étendant vers la zone frontale.</li>
	<li>Retirez délicatement le crâne, en le soulevant doucement avec les ciseaux pour éviter d’endommager les leptoméninges, en veillant à ce que tout le cerveau, y compris les leptoméninges, soit obtenu.</li>
	<li>Plongez tout le cerveau dans un tampon de lavage et rincez-le doucement pour éliminer le sang de surface.</li>
	<li>Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri stérile sans le hacher et extrayez les leptoméninges de la surface du cerveau à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine sous un microscope.</li>
	<li>Coupez le tissu leptoméninges en fragments à l’aide de micro-ciseaux stériles.</li>
</ol>4. Digestion enzymatique des leptoméninges
<ol><li>Ajouter 10 mL du mélange enzymatique (étape 1.2) aux fragments et incuber à 37 °C pendant 15 min. Agitez doucement pour vous assurer que les fragments se détachent du fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 mL de tampon d’arrêt (étape 1.4) pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de PBS froid et passer le mélange à travers une passoire de 70 μm dans un tube stérile de 50 mL pour filtrer les grumeaux.</li>
</ol>5. Expansion cellulaire
<ol><li>Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm 2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine (étape2) avec5 mL de milieu de culture.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h. Ensuite, retirez le milieu pour éliminer les cellules non attachées.</li>
	<li>Maintenir la culture en remplaçant 50 % du milieu tous les deux jours. Répétez ce processus deux ou trois fois.</li>
</ol>6. Sélection des cellules magnétiques
REMARQUE : Travaillez rapidement, maintenez la froideur des cellules et utilisez des solutions pré-refroidies pour éviter le marquage non spécifique des cellules.
<ol><li>Préparation des instruments et des réactifs : fixer un séparateur magnétique sur un support de séparateur magnétique (voir tableau des matériaux). Connectez une colonne de sélection au séparateur magnétique et positionnez une crépine de cellules de 70 μm au sommet de la colonne de sélection. Placez un tube de 50 ml sous la colonne de sélection pour recueillir le débit.</li>
	<li>Digestion enzymatique : une fois que les cellules ont atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Arrêtez la digestion en ajoutant le tampon d’arrêt. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.</li>
	<li>Incubation des anticorps : remettre en suspension 1 x 107 cellules au total dans 100 μL de PBS et ajouter 10 μL d’anticorps LYVE-1 (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.<ol><li>Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Rincez les cellules en introduisant 1 mL de PBS et en centrifugeant à 300 x g pendant 5 min. Retirez complètement le surnageant.</li>
	</ol></li>
	<li>Marquage des microbilles : remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 20 μL de microbilles (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.<ol><li>Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et décanter le surnageant. Ensuite, nettoyez les cellules avec 1 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Enfin, retirez complètement le surnageant.</li>
	</ol></li>
	<li>Exclusion magnétique négative : remettre les cellules en suspension dans 4 mL de PBS. Passez les cellules à travers une crépine de 70 μm pour éliminer les grumeaux. Préparez la colonne de sélection (voir Tableau des matériaux) en la rinçant avec 3 mL de PBS, puis appliquez la suspension cellulaire dans la colonne de sélection.<ol><li>Effectuez les étapes de lavage avec 3 mL de PBS et collectez les cellules LYVE-1-négatives dans un tube de 50 mL positionné sous la colonne de sélection pour les laisser passer.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélection magnétique positive : pipeter 6 mL de PBS dans la colonne de sélection. Rincez instantanément les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne de sélection pour obtenir des LLEC LYVE-1-positifs. REMARQUE : Attendez toujours que le réservoir de la colonne de sélection soit vide avant de passer à l’étape suivante.</li>
</ol>7. La culture des LLEC
<ol><li>Centrifuger les LLEC LYVE-1-positives à 300 x g pendant 5 min, puis retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine avec5 mL de milieu de culture.</li>
	<li>Entretenez la culture en remplaçant 50 % du support tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine et effectuez le passage cellulaire. Utilisez les cellules pour les expériences suivantes après 2-3 passages.</li>
</ol>8. Analyse par cytométrie en flux
REMARQUE : L’analyse par cytométrie en flux a été effectuée selon la procédure décrite précédemment15.
<ol><li>Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez le tampon d’arrêt pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension 1 x 106 cellules dans 100 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 μL d’anticorps LYVE-1. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de tampon PBS pour analyse à l’aide de la cytométrie en flux et du logiciel FlowJo (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>9. Coloration immunofluorescente
REMARQUE : La coloration par immunofluorescence a été effectuée selon la procédure décrite précédemment16.
<ol><li>Lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante. Jetez le PFA et lavez les cellules avec du PBS trois fois.</li>
	<li>Appliquer le tampon de bloc pendant 1 h à température ambiante. Retirez le tampon de bloc des lamelles.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps LYVE-1 dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Ajouter un anticorps secondaire approprié (voir le tableau des matériaux) dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Contre-coloration avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie d’immunofluorescence.</li>
</ol>

Etablissement de cultures LLEC in vitro à l’aide de la sélection cellulaire magnétique

<ol><li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li>
<li>Suárez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+with+many+talents%3A+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799(2021).</li>
<li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li>
<li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics%3A+A+techniques+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778(2023).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Identification%2C+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691(2015).</li>
<li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li>
<li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li>
<li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li>
<li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964(2022).</li>
<li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965(2016).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+lymphatic+vasculature%3A+From+development+to+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+%28VEGF-C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li>
<li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li>
<li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949(2023).</li>
<li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le protocole actuel pour la récolte et la culture in vitro des LLEC n’a pas encore été rapporté. Cette étude présente un protocole multiprocédural reproductible pour la récolte et la culture des LLEC à partir de leptoméninges de souris.
Bien que ce protocole multiprocédural soit reproductible, il y a plusieurs considérations clés. Par exemple, les flacons T25 enrobés de fibronectine favorisent l’adhésion des LLEC et leur fonction en éliminant les cellules non adhérentes, assurant ains...

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) nouvellement découvertes forment un maillage de cellules individuelles à l’intérieur des leptoméninges, présentant un modèle de distribution distinct par rapport aux cellules endothéliales lymphatiques périphériques 1,2. Les fonctions cellulaires et les implications cliniques associées aux LLEC restent en grande partie un territoire inexploré. Afin d’ouvrir la voie à la recherche fonctionnelle sur les LLECs, il est impératif d’établir un modèle in vitro pour leur étude. Par conséquent, cette étude a mis au point un protocole complet pour l’isolement et la culture primaire des LLECs.
Les souris sont le modèle animal préféré en raison de leur aptitude à la manipulation génétique dans la recherche sur les maladies. Des études antérieures ont réussi à isoler des cellules endothéliales lymphatiques de divers tissus de souris, notamment les ganglions lymphatiques3, le tissu mésentérique4, le tissu dermique5, les lymphatiques collecteurs6 et le tissu pulmonaire7. Ces procédures d’isolement se sont principalement appuyées sur des techniques telles que le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) et le tri par cytométrie en flux 8,9,10. De plus, les efforts de recherche ont conduit à l’établissement de lignées cellulaires arachnoïdiennes de rat et de lignées cellulaires capillaires lymphatiques de rat11,12. Malgré l’existence de techniques de culture d’explants pour les leptoméninges13, il existe un besoin urgent d’un protocole normalisé pour l’isolement et la culture des LLECs. Par conséquent, cette étude a permis de récolter et de cultiver avec succès des LLEC en dissociant méticuleusement les leptoméninges sous la direction d’un microscope et en favorisant l’expansion des LLEC grâce à l’utilisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C). Le marqueur distinctif des cellules endothéliales lymphatiques est le récepteur hyaluronique du vaisseau lymphatique-1 (LYVE-1)14. Ce protocole en plusieurs étapes isole sélectivement les LLEC LYVE-1-positives à l’aide de MACS et vérifie ensuite leur pureté par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente.
Les principales étapes de ce protocole en plusieurs étapes peuvent être résumées comme suit : enrobage du flacon, dissociation des leptoméninges, digestion enzymatique des leptoméninges, expansion cellulaire, sélection magnétique des cellules et culture ultérieure des LLECs. Enfin, la pureté des LLEC isolées est confirmée par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente. L’objectif principal de cette étude est de présenter un protocole reproductible en plusieurs étapes pour l’isolement des LLEC à partir de leptoméninges de souris et leur culture in vitro ultérieure. Ce protocole est sur le point de faciliter grandement les recherches sur les fonctions cellulaires et les implications cliniques des LLECs.

<table><tbody><tr><td>Tampon de bloc</td><td>Beyotime</td><td>P0102</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Solarbio</td><td>C8140</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1041</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>C-3202</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Solarbio</td><td>S9010</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Solarbio</td><td>F8180&nbsp ;</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>V10.8.1</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 anticorps</td><td>eBioscience</td><td>12-0443-82</td><td>Stocker les aliquotes sur &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Séparateur magnétique</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>Stérile avant utilisation</td></tr><tr><td>Support séparateur magnétique</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>Stérile avant utilisation</td></tr><tr><td>Microbilles</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Solarbio</td><td>G8430-25g</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>PDPN anticorps</td><td>Santa</td><td>sc-53533</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; Anticorps C</td></tr><tr><td>PROX1</td><td>Santa</td><td>sc-81983</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Colonne de sélection&nbsp ;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Stérile avant utilisation</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>VEGF-C&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab51947</td><td>Stocker les aliquotes chez &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>VEGFR-3 anticorps</td><td>Santa</td><td>sc-514825</td><td>Stocker les aliquotes à &ndash ; 4 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) sont une population cellulaire intracrânienne récemment découverte avec une distribution unique clairement distincte des cellules endothéliales lymphatiques périphériques. Leur fonction cellulaire et leurs implications cliniques restent largement inconnues. Par conséquent, la disponibilité d’un approvisionnement en LLEC est essentielle pour mener une recherche fonctionnelle in vitro. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole pour la récolte et la culture des LLEC in vitro.
Cette étude a permis de récolter avec succès les LLEC à l’aide d’un protocole en plusieurs étapes, qui comprenait l’enrobage de la fiole de fibronectine, la dissection des leptoméninges à l’aide d’un microscope, la digestion enzymatique des leptoméninges pour préparer une suspension unicellulaire, l’induction de l’expansion des LLEC avec le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C) et la sélection des cellules positives du récepteur hyaluronique des vaisseaux lymphatiques-1 (LYVE-1) par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Ce processus a finalement conduit à l’établissement d’une culture primaire. La pureté des LLEC a été confirmée par coloration par immunofluorescence et analyse par cytométrie en flux, avec un niveau de pureté supérieur à 95 %. Ce protocole en plusieurs étapes a démontré sa reproductibilité et sa faisabilité, ce qui facilitera grandement l’exploration de la fonction cellulaire et des implications cliniques des LLECs.

Cette étude présente un protocole reproductible en plusieurs étapes pour le prélèvement de cellules endothéliales lymphatiques (LLECs) chez la souris et l’établissement ultérieur de leur culture primaire in vitro. Les étapes clés comprennent la préparation du flacon et l’enrobage de la fibronectine, la dissociation des leptoméninges, l’obtention d’une suspension unicellulaire par digestion enzymatique et l’induction de l’expansion des LLEC avec le VEGF-C. Les LLEC LYVE-1-positives sont ensuite isolées sélectivem...

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Ce protocole est conçu pour les zones de par d’autres chercheurs uniquement intéressés là où a établi la procédure multi et les zones primaires culturelles Notre protocole a finalement conduit à l’établissement de notre culture primaire de la zone CS avec un niveau de pureté supérieur à 95%Il n’existe actuellement aucun protocole existant pour la récolte et la culture Nos résultats ont ouvert la voie à une étude plus approfondie de la fonction similaire de LLECS dans le virtuel. À RUC, notre récente découverte de la population cellulaire intracrânienne, la signification biologique de RUC Nous mènerons d’autres recherches sur la fonction cellulaire et examinerons son implication clinique.

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Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Le protocole de culture leptoméninge explant de post-mortem du cerveau humain est un moyen techniquement robuste et simple pour obtenir des fibroblastes méningées fibronectine positifs dans les 6-8 semaines et cryoconservation environ 20-30000000 cellules.

Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.

Induction de modification des cellules leptomeningeales par injection intracisterale

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

Le protocole décrit ici met en évidence les principales étapes de la différenciation des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, de la préparation de Neisseria meningitidis pour l’infection et de la collecte d’échantillons pour d’autres analyses moléculaires.

Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Cet article décrit un protocole pour la propagation des cellules tumorales circulantes dans le liquide céphalo-rachidien (CTC-LCR) collectées chez des patients atteints de leptoméningée associée au mélanome (M-LMD) afin de développer des modèles précliniques pour étudier M-LMD.

Ex vivo Culture de cellules tumorales circulantes dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de mélanome pour étudier la maladie leptoméningée associée au mélanome

Ici, un protocole est présenté pour évaluer les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) de la souris, qui jouent un rôle important dans de multiples maladies neurologiques. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode intégrée permettant à la fois l’évaluation fonctionnelle du drainage des traceurs et la caractérisation morphologique détaillée du réseau dorsal des MLV.

Protocole intégré pour l’évaluation des lymphatiques méningées : injection de cisterna magna, imagerie des ganglions lymphatiques, dissection méningée et coloration totale

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à disséquer, transfecter par électroporation et de neurones de souris de la culture de l'hippocampe et du cortex. Cultures à court terme peut être utilisé pour des études d'excroissance axonale et d'orientation, tout en cultures à long terme peut être utilisé pour des études de la synaptogenèse et l'analyse des épines dendritiques.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Apprenez à récolter et cultiver des cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées primaires chez la souris avec une pureté supérieure à 95 %. Cette méthode permet d'étudier leurs fonctions cellulaires et implications cliniques en neurosciences.

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

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