Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d'ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

L’objectif global de l’expérience suivante est de cartographier la distribution des protéines de réparation de l’ADN autour des cassures d’ADN double brin à l’échelle nanométrique. Afin d’étudier l’ultrastructure de la chromatine endommagée en cours de réparation à l’aide de l’imagerie spectroscopique électronique. Ceci est réalisé en générant des constructions d’expression de l’ADN codant pour les protéines de fusion des protéines de réponse aux dommages de l’ADN à l’aide d’une protéine fluorescente et de la mini balise SOG.

Dans un deuxième temps, les constructions sont introduites dans les cellules par transfection, puis les cellules sont endommagées par l’irradiation laser ou gamma. Ensuite, les cellules irradiées et fixées subissent des étapes de préparation en microscopie électronique afin de rendre visible au microscope électronique la distribution de la protéine de réparation marquée mini SOG. L’imagerie spectroscopique électronique qui en résulte fournit des images détaillées qui permettent d’analyser l’ultrastructure de la chromatine et la relation entre des protéines spécifiques et les foyers de réparation de l’ADN.

Le principal avantage de cette technologie par rapport à d’autres technologies existantes comme le marquage ImmunoGold, est qu’elle ne dépend pas de l’accessibilité des anticorps et qu’elle marque les structures d’intérêts de manière assez dense. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la photo-oxydation est très sensible au pH, à l’intensité lumineuse et à la saturation en oxygène. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de photo-oxydation, de saturation en oxygène et d’éclairage sont sensibles à de très petits changements, et il est donc important d’illustrer comment la méthode est réalisée afin de la reproduire.

Le Dr Hilmar Fadden, post-doctorant dans mon laboratoire, fera une démonstration de la méthode pour vous. Les cellules d’ostéosarcome humain qui expriment de manière stable les protéines de réparation marquées mini SOG et M cherry comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Après avoir séparé les cellules d’une boîte de 10 centimètres, faites croître les cellules jusqu’à ce qu’elles aient une fluidité de 80 %.

Ensuite, placez les cellules sous un microscope à fluorescence et utilisez un stylo diamant stérile pour délimiter une petite zone d’environ un millimètre carré qui contient des cellules exprimant les protéines ectopiques une fois marquées, sensibilisez les cellules en ajoutant herx à la solution de sorte que la concentration finale soit de 0,5 microgramme par millilitre, puis placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, le laser micro-irradie les cellules à l’aide du laser à semi-conducteurs de 405 nanomètres d’un microscope confocal afin d’induire des dommages à l’ADN suite à des dommages à l’ADN, fixer les cellules dans l’obscurité à l’aide d’un millilitre d’aldéhyde paraforme à 4 % dans 0,1 molaire de sodium. Tamponner à température ambiante après 30 minutes.

Lavez les cellules deux fois avec quatre millilitres de tampon Cate de sodium 0,1 molaire à un pH de 7,4. Ensuite, traitez les cellules fixées avec deux millilitres d’une solution contenant 50 millimolaires de glycine, cinq millimolaires d’amino triazole et 10 millimolaires de cyanure de potassium à un pH de 7,4 pendant 30 minutes. Remplacer le tampon par deux millilitres de tampon de photo-oxydation à un pH de 7,4, qui a été préparé comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité sur de la glace tout en faisant bouillonner de l’oxygène dans la solution pour la maintenir saturée en oxygène. Ensuite, montez soigneusement la parabole avec les cellules fixes sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 40x et déplacez-la vers la zone d’intérêt décrite précédemment. Excissez la mini balise SOG avec de la lumière bleue en utilisant des cubes de filtre pour la protéine fluorescente verte.

Continuez l’éclairage même après que la mini fluorescence SOG verte ait complètement disparu. Et jusqu’à ce que le produit de photo-oxydation brun de la dia amino benadine polymérisée émerge dans le canal de lumière transmise. Ensuite, postfixez les cellules avec un millilitre de glutaraldéhyde à 2 % dans un tampon Cate de sodium à 0,1 molaire à pH 7,4 pendant 30 minutes.

Ensuite, fixez les membranes cellulaires avec 0,1 à 0,5 % de tétroxyde d’osmium dans un tampon Cate de sodium 0,1 molaire pendant 20 minutes à un pH de 7,4. Une fois fixées, déshydratez les cellules par une série de lavages à l’éthanol. Ensuite, incubez les cellules dans un mélange individuel d’éthanol à 100 % et de résine acrylique sur un agitateur pendant quatre heures.

Ensuite, retirez le mélange et ajoutez de la résine 100 % acrylique aux échantillons pendant quatre heures supplémentaires. Afin de polymériser la résine, coupez le couvercle d’un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres étiqueté avec une lame de rasoir et enduisez le bord d’un accélérateur de résine acrylique. Remplissez soigneusement le tube aux deux tiers environ avec de la résine blanche LR à l’aide d’un tampon de tuyau de pâturage.

Veillez à ce que la résine n’entre pas en contact avec l’accélérateur sur la jante. Retirez la résine qui s’est infiltrée dans les cellules de la boîte et placez la boîte à l’envers sur le tube de micro-centrifugeuse vertical de sorte que la largeur du tube remplisse presque complètement la fenêtre d’observation recouverte de verre du poids de la parabole. Une à deux minutes pour que l’accélérateur scelle le tube et la lamelle.

Ensuite, retournez le tube de sorte que la résine dans le tube recouvre maintenant les cellules. Placez le plat avec le tube dans un four à 60 degrés Celsius et faites-le durcir pendant 12 heures. Lorsque le bloc est durci, retirez du four le plat avec le microtube de centrifugation rempli de résine et séparez le microtube de centrifugation du plat.

Jetez le plat à fond de verre et ouvrez soigneusement le tube de micro-centrifugeuse avec une lame de rasoir afin de libérer le bloc. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez le bloc de manière à ce qu’il ne reste que la zone d’un millimètre carré qui contient la zone précédemment marquée avec le stylo en diamant ou en tungstène. Ensuite, montez le bloc dans un ultra microtome et coupez le bloc avec un couteau de coupe jusqu’à ce que les cellules soient approchées.

Ensuite, passez à un couteau en diamant et coupez des sections ultra minces d’environ 50 nanomètres à travers les cellules. Ramassez les sections sur des grilles à mailles 300 à haute transmission. Ensuite, placez les grilles dans un cône de carbone et enduisez les sections d’environ 0,2 à 0,4 nanomètre de carbone pour aider à les stabiliser sous le faisceau d’électrons du microscope électronique à transmission.

Chargez les grilles dans un microscope électronique à transmission équipé d’un filtre d’énergie. Inspectez les cellules des sections à l’aide du mode de transmission normal à faible grossissement et comparez-les aux images de fluorescence prises précédemment. Une fois qu’un noyau avec une piste de dommages à l’ADN ou des foyers de réparation de l’ADN est trouvé, passez en mode de filtrage d’énergie et enregistrez l’échantillon avec une carte d’épaisseur.

Ensuite, enregistrez les images de bord de la carte du phosphore à une perte d’énergie de 175 électrons avec une largeur de fente de 20 électronvolts. Enregistrez également des images de préed à une perte d’énergie de 120 électronvolts, également avec une largeur de fente de 20 électronvolts pour l’enregistrement des cartes d’azote. Affichez des images de bord à 447 électronvolts avec une largeur de fente de 35 électronvolts et des images prédéfinies à 358 électronvolts.

Également avec une largeur de fente de 35 électronvolts. Ouvrez les cartes de rapport élémentaire dans un logiciel de traitement d’image tel que celui-ci. Copiez la carte de l’azote dans le canal rouge et la carte du phosphore dans le canal vert d’une image RVB.

Ensuite, superposez et alignez les cartes. Exportez l’image composite sous la forme d’un fichier image balisé, puis ouvrez-la dans un logiciel de traitement d’image capable d’utiliser des calques. Ensuite, ajustez la plage dynamique de chaque canal en redimensionnant les valeurs minimale et maximale de l’image en un ensemble de données de huit bits.

Soustrayez ensuite la teneur en phosphore de la carte d’azote dans la fenêtre des couches. Convertissez l’image en couleur indexée et créez une table de correspondance jaune dans l’espace colorimétrique CMJN pour la carte montrant la distribution des acides nucléiques et une table de correspondance cyan pour afficher la carte des protéines non chromatiniennes. Ensuite, créez une nouvelle image et importez les cartes montrant les distributions du phosphore et des protéines non chromatiniennes sous forme de couches différentes.

Utilisez le mode transparence de l’écran afin de voir les deux calques superposés l’un sur l’autre. Voici des cartes de rapport par spectroscopie d’électrons de l’intérieur d’un noyau cellulaire montrant l’emplacement du phosphore et de l’azote lorsque les deux cartes de rapport sont superposées l’une sur l’autre dans l’espace colorimétrique RVB. Une image comme celle montrée ici est obtenue dans cette image.

Les structures jaunes représentent des protéines nucléaires reflétant la présence de phosphore et d’azote. Ici, l’imagerie par spectroscopie électronique est utilisée pour visualiser les changements dans la structure des foyers après l’irradiation gamma dans les cellules U2 OS. Les protéines de réparation marquées M cherry exprimant de manière stable dans la rangée supérieure sont des images de cellules qui n’ont pas été irradiées.

La deuxième rangée montre les cellules qui ont été fixées trois heures après la radiothérapie. La troisième rangée montre les cellules fixées six heures après la radiothérapie. L’imagerie spectroscopique électronique révèle que la structure des foyers semble se réorganiser au fil du temps car la quantité relative de 53 BP une protéine au foyer indiquée par l’augmentation du signal d’azote semble augmenter tandis que la chromatine indiquée par le signal de phosphore prend une position plus périphérique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des cellules irradiées exprimant des protéines mini so repair pour analyser l’ultra structure de la chromatine dans les foyers de réparation DA à l’aide de l’imagerie spectroscopique électronique. N’oubliez pas que travailler avec du sodium corrélé du sodium, du cyanure de potassium et de l’oxyde d’osmium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte et le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.