Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d'ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

L'objectif général de l'expérience suivante est de cartographier la distribution des protéines de réparation de l'ADN autour des cassures double brin de l'ADN à l'échelle nanométrique. Pour étudier l'ultrastructure de la chromatine endommagée en cours de réparation, on utilise l'imagerie spectroscopique électronique. Ceci est réalisé en générant des constructions d'expression d'ADN codant pour des protéines de fusion de protéines de réponse aux dommages de l'ADN, associées à une protéine fluorescente et au mini-tag SOG.

Ensuite, les constructions sont introduites dans les cellules par transfection, puis les cellules sont endommagées soit par un laser, soit par une irradiation gamma. Ensuite, les cellules irradiées et fixées subissent des étapes de préparation à la microscopie électronique afin de rendre visible la distribution de la protéine de réparation marquée avec le mini SOG au microscope électronique. L'imagerie spectroscopique électronique obtenue fournit des images détaillées permettant l'analyse de l'ultrastructure de la chromatine et de la relation entre protéines spécifiques et foyers de réparation de l'ADN.

Le principal avantage de cette technologie par rapport à d'autres technologies existantes, comme l'étiquetage par ImmunoGold, est qu'elle ne dépend pas de la disponibilité des anticorps et qu'elle marque de manière assez dense les structures d'intérêt. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car l'oxydation photochimique est très sensible au pH, à l'intensité lumineuse et à la saturation en oxygène. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'oxydation photochimique, de saturation en oxygène et d'illumination sont sensibles à de très petites variations ; il est donc important d'illustrer précisément la manière dont la méthode est réalisée afin de permettre sa reproduction.

Le Dr Hilmar Fadden, postdoctorant dans mon laboratoire, vous démontrera la méthode de culture. Des cellules d'ostéosarcome humain exprimant de façon stable les protéines de réparation marquées par le mini SOG et M cherry, comme décrit dans le protocole accompagnant. Après avoir divisé les cellules provenant d'une boîte de 10 centimètres, faire pousser les cellules jusqu'à une confluence de 80 %.

Ensuite, placer les cellules sous un microscope à fluorescence et utiliser un stylet stérile en diamant pour délimiter une petite zone d’environ un millimètre carré contenant des cellules exprimant les protéines ectopiques. Une fois marquée, sensibiliser les cellules en ajoutant du herx à la solution afin d’obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre, puis les placer dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, irradier les cellules par micro-irradiation laser en utilisant le laser à état solide de 405 nanomètres d’un microscope confocal afin d’induire un dommage de l’ADN. Après le dommage de l’ADN, fixer les cellules à l’abri de la lumière en utilisant un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon au citrate de sodium 0,1 molaire, à température ambiante, après 30 minutes.

Lavez les cellules deux fois avec quatre millilitres de tampon de Cate de sodium 0,1 molaire à un pH de 7,4. Ensuite, traitez les cellules fixées avec deux millilitres d'une solution contenant 50 millimolaires de glycine, 5 millimolaires d'aminotriazole et 10 millimolaires de cyanure de potassium à un pH de 7,4 pendant 30 minutes. Remplacez le tampon par deux millilitres de tampon d'oxydation photochimique à un pH de 7,4, préparé comme décrit dans le protocole accompagnant le texte.

Incubez ensuite l'échantillon à l'abri de la lumière sur de la glace tout en faisant barboter de l'oxygène dans la solution pour la maintenir saturée en oxygène. Ensuite, montez soigneusement la boîte contenant les cellules fixées sur un microscope à fluorescence inversé équipé d'un objectif à immersion huile de 40 x, puis déplacez-la vers la zone d'intérêt qui avait été délimitée précédemment. Excitez la mini-étiquette SOG avec de la lumière bleue en utilisant des cubes de filtres destinés à la protéine verte fluorescente.

Poursuivez l'illumination même après la disparition complète de la fluorescence verte du mini SOG. Et jusqu'à l'apparition du produit brun d'oxydation photochimique du dia-aminobenzidine polymérisé dans le canal de lumière transmise. Ensuite, post-fixez les cellules avec un millilitre de 2 % de glutaraldéhyde dans un tampon de sodium catécholique 0,1 molaire à pH 7,4 pendant 30 minutes.

Ensuite, fixer les membranes cellulaires avec du tétraoxyde d'osmium à 0,1 à 0,5 % dans un tampon de catéchol de sodium 0,1 molaire pendant 20 minutes à pH 7,4. Une fois fixées, déshydrater les cellules par une série de lavages à l'éthanol. Puis incuber les cellules dans un mélange un-à-un d'éthanol à 100 % et de résine acrylique sur un agitateur pendant quatre heures.

Ensuite, retirez le mélange et ajoutez de la résine acrylique à 100 % aux échantillons pendant quatre heures supplémentaires. Afin de polymériser la résine, coupez le couvercle d'un tube microcentrifuge de deux millilitres étiqueté à l'aide d'une lame de rasoir et enduisez le bord d'accélérateur de résine acrylique. Remplissez soigneusement le tube aux deux tiers environ avec de la résine LR white à l'aide d'une pipette Pasteur.

Veillez à ce que la résine n'entre pas en contact avec l'accélérateur sur le rebord. Retirez la résine ayant pénétré dans les cellules de la boîte et placez la boîte à l'envers sur un tube de microcentrifugeuse tenu verticalement, de sorte que le diamètre du tube remplisse presque entièrement la fenêtre d'observation recouverte de verre du poids de la boîte. Laissez 1 à 2 minutes à l'accélérateur pour sceller le tube et la lame de couverture.

Ensuite, retourner le tube afin que la résine recouvre maintenant les cellules. Placer la boîte contenant le tube dans un four à 60 degrés Celsius et polymériser pendant 12 heures. Une fois le bloc polymérisé, retirer la boîte contenant le tube de centrifugation microfuge rempli de résine du four et séparer le tube de centrifugation microfuge de la boîte.

Jetez la boîte en verre à fond plat et ouvrez soigneusement le tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un scalpel afin de libérer le bloc. À l’aide d’un scalpel, taillez le bloc de manière à ne conserver qu’un carré d’un millimètre carré contenant la zone précédemment marquée au stylo en diamant ou en tungstène. Ensuite, fixez le bloc sur un ultramicrotome et taillez-le à l’aide d’un couteau de parage jusqu’à approcher les cellules.

Ensuite, passez à un couteau en diamant et taillez des sections ultramince d'environ 50 nanomètres à travers les cellules. Récupérez les sections sur des grilles à haute transmission de 300 mesh. Puis placez les grilles dans une chambre de dépôt de carbone et recouvrez les sections d'environ 0,2 à 0,4 nanomètre de carbone afin de les stabiliser sous le faisceau électronique du microscope électronique en transmission.

Chargez les grilles dans un microscope électronique en transmission équipé d'un filtre énergétique. Examinez les cellules sur les coupes en utilisant le mode de transmission normal à faible grossissement et comparez-les aux images de fluorescence prises précédemment. Une fois un noyau présentant une trace de dommage de l'ADN ou des foyers de réparation de l'ADN identifié, passez en mode de filtrage énergétique et enregistrez l'échantillon avec une carte d'épaisseur.

Ensuite, enregistrez les images de la carte de phosphore post-seuil à une perte d'énergie électronique de 175 avec une largeur de fente de 20 électronvolts. Enregistrez également les images pre-seuil à une perte d'énergie de 120 électronvolts, également avec une largeur de fente de 20 électronvolts pour l'enregistrement des cartes d'azote. Enregistrez les images post-seuil à 447 électronvolts avec une largeur de fente de 35 électronvolts et les images pre-seuil à 358 électronvolts.

Aussi avec une largeur de fente de 35 volts électroniques. Ouvrir les cartes de rapports élémentaires dans un logiciel de traitement d'image tel que celui-ci. Copier la carte d'azote dans le canal rouge et la carte de phosphore dans le canal vert d'une image RVB.

Ensuite, superposez et alignez les cartes. Exportez l'image composite au format de fichier TIFF, puis ouvrez l'image dans un logiciel de traitement d'image capable d'utiliser des calques. Ajustez ensuite la plage dynamique de chaque canal en recalculant les valeurs minimale et maximale de l'image sur un jeu de données de huit bits.

Ensuite, soustrayez la teneur en phosphore de la carte d'azote dans la fenêtre des couches. Convertissez l'image en une couleur indexée et créez une table de correspondance jaune dans l'espace colorimétrique CMJN pour la carte montrant la distribution des acides nucléiques, et une table de correspondance cyan pour représenter la carte des protéines non chromatiennes. Créez ensuite une nouvelle image et importez les cartes montrant les distributions du phosphore et des protéines non chromatiennes comme couches différentes.

Utilisez le mode de transparence de l'écran afin de visualiser les deux couches superposées l'une sur l'autre. On montre ici des cartes de rapports spectroscopiques électroniques provenant de l'intérieur d'un noyau cellulaire, illustrant les emplacements du phosphore et de l'azote lorsque les deux cartes de rapports sont superposées dans l'espace colorimétrique RVB. Une image telle que celle présentée ici est obtenue dans cette image.

Les structures jaunes représentent des protéines nucléaires reflétant la présence de phosphore et d'azote. Ici, l'imagerie spectroscopique électronique est utilisée pour observer les changements de la structure des foyers après une irradiation gamma dans des cellules U2 OS. La rangée supérieure montre des images de cellules exprimant de façon stable des protéines de réparation marquées avec M cherry et qui n'ont pas été irradiées.

La deuxième ligne montre des cellules fixées trois heures après l'irradiation. La troisième ligne montre des cellules fixées six heures après l'irradiation. L'imagerie spectroscopique électronique révèle que la structure des foyers semble se réorganiser au fil du temps, car la quantité relative de la protéine 53BP1 dans le foyer, indiquée par l'augmentation du signal azoté, semble augmenter, tandis que la chromatine, indiquée par le signal phosphoré, occupe une position plus périphérique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des cellules irradiées exprimant des protéines de réparation mini so afin d'analyser la structure ultrafine de la chromatine dans les foyers de réparation de l'AD à l'aide de l'imagerie spectroscopique électronique. N'oubliez pas que l'utilisation de tampon au cyanure de potassium, de corrélatif au sodium et d'oxyde d'osmium peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que de travailler sous hotte aspirante et de porter des gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.