Name: Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation dADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Découvrez la visualisation des protéines de réparation de l'ADN marquées au miniSOG par imagerie spectroscopique électronique. Cette méthode permet d'analyser l'ultrastructure de la chromatine endommagée à l'échelle nanométrique.

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Nous remercions le Dr Roger Tsien de nous avoir fourni les constructions miniSOG. Le Dr Xuejun Sun pour son aide avec le TEM. Lisa Lem et Peter Shipple du Cross Cancer Institute pour avoir fourni de l’oxygène. Hilmar Strickfaden est titulaire d’une bourse postdoctorale de l’Alberta Cancer Foundation et a reçu le soutien de la Bayrische Forschungsallianz. Ces travaux ont été financés par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada et de l’Alberta Cancer Foundation.

1. Génération de miniSOG lignées cellulaires <ol><li> Cultiver U2OS (de l&#39;ostéosarcome humain) des cellules dans une boîte de 35 mm contenant 2 ml de bas glucose milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), qui est complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 atmosphère. </li><li> Transfecter les cellules quand elles sont confluentes à 80% par lipofection avec la qualité de transfection purifié (A269 / rapport 280 de 1,8 à 2,0) des constructions plasmidiques contenant des séquences pour miniSOG et mCherry étiquetés protéines de réparation selon le protocole du fabricant du réactif de transfection 19. Les plasmides d&#39;expression miniSOG peuvent être commandés à partir du Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Trier les cellules exprimant la protéine recombinante avec la balise miniSOG et mCherry par fluorescence tri cellulaire activé deux jours après la transfection. Recueillir des cellulesavec l&#39;intensité de fluorescence intermédiaire afin d&#39;éviter que les cellules sont 20 surexpriment. </li><li> Culture des cellules positives sur une boîte de 10 cm dans 10 ml de milieu DMEM qui est complété avec 10% de FBS et 0,6 ug / ml de l&#39;agent de sélection G418 (généticine). </li><li> Après colonies visibles ont émergé sur les plaques, écran de colonies positives mCherry aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence et de dessiner des cercles autour d&#39;eux (sur le fond de la plaque) avec un marqueur permanent. Utilisez un objectif à faible grossissement de l&#39;air (par exemple, 10x) et ramasser clones en utilisant une technique stérile en grattant soigneusement les colonies hors et lentement les aspirant dans une pipette de 1000 pi stérile. </li><li> Développez les colonies sélectionnées et de geler les parties de bas en utilisant le milieu de croissance décrit dans l&#39;étape 1.1 complété avec 10% diméthylsulfoxyde. Testez les cellules pour la formation DRF en les cultivant sur ​​stériles 18 x 18 mm 2 lamelles et en les exposant à2 Gy de rayonnement. Les cellules irradiées exprimant de façon stable un miniSOG mCherry étiquetés protéines de réparation doit montrer le motif caractéristique typique focal CDB quand visualisée avec un microscope à fluorescence en utilisant un filtre-set pour l&#39;imagerie mCherry. </li></ol> 2. Culture cellulaire <ol><li> U2OS cellules de culture exprimant de manière stable le miniSOG et mCherry protéines marquées de réparation dans les conditions décrites dans l&#39;étape 1.1. Cultiver les cellules à 80% de confluence dans une boîte à fond de verre de 35 mm de diamètre contenant 2 ml de DMEM. Assurez-vous que la colle qui attache la lamelle à la matière plastique et le plastique utilisé est résistant aux solutions aqueuses et alcoolisées et résistant à la résine utilisée! </li><li> Avant de procéder à l&#39;expérience, définir un petit espace d&#39;environ 1 mm 2 qui contient des cellules exprimant les protéines ectopiques par grattage avec un stylo à diamant stérile en utilisant un microscope à fluorescence pour déterminer la région d&#39;intérêt. Vous pouvez également utiliser un plat de fond de verre tchapeau contient une lamelle couvre-objet avec un système de grille pré-gravé intégré dans la lamelle. NOTE: Si vous utilisez de haute qualité combinant microscopie corrélative ESI et la fluorescence images microscopiques 21, assurez-vous que l&#39;épaisseur de la lamelle est compatible avec les objectifs d&#39;immersion d&#39;huile. Il devrait avoir l&#39;épaisseur n ° 1.5 (0,16 à 0,18 mm). Choisissez une zone à proximité du centre du plat de la région à être examinée dans le TEM afin d&#39;éviter les problèmes de polymérisation de la résine qui peut se produire à proximité des bords (voir point 04.10 à 04.13). </li></ol> Dommages induction 3. d&#39;ADN <ol><li> Irradier les cellules avec des rayons gamma, en utilisant un médicament radiomimétique ou provoquer des dommages par irradiation micro laser sur un microscope confocal (par exemple, comme décrit dans 18,22 ou 23). </li><li> Dans cet exemple, les cellules à irradier 2 et 6 Gy de rayonnement gamma dans une source de césium-137 ou le rayonnement laser à l&#39;aide du sol microirradiate 405 nmIdentifiant du laser à l&#39;état d&#39;un microscope confocal après la sensibilisation des cellules pendant 20 minutes avec 0,5 ug / ml de Hoechst. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 4. <ol><li> Fixer les cellules avec 1 ml de paraformaldéhyde 4% prudence dans tampon cacodylate de sodium 0,1 M ou en tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. ATTENTION: Paraformaldéhyde et cacodylate de sodium sont toxiques! Porter des gants et d&#39;en disposer adéquatement les substances toxiques. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 4 ml de tampon cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 ou du tampon phosphate pH 7,4. </li><li> Traiter les cellules fixées avec 2 ml de glycine 50 mM, 5 mM aminotriazole et 10 mM de cyanure de potassium ATTENTION en sodium 0,1 M tampon cacodylate ou 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4) (vérifier le pH!) Pendant 30 minutes afin de bloquer n&#39;a pas réagi groupes aldéhyde et de supprimer les espèces réactives de l&#39;oxygène générés par des groupes hème, ce qui peut augmenter l&#39;arrière-plan. ATTENTION: le cyanure de potassium est extrêmement toxique! WGants de l&#39;oreille, travailler sous une hotte et évacuer adéquatement les substances toxiques. La réaction est très sensible au pH, il est important que le pH contrôlée et précise. </li><li> Notez la zone qui a été sélectionné à l&#39;étape 2.2 en 2D ou en 3D sur un microscope inversé à fluorescence, si microscopie corrélative est souhaitée. </li><li> Préparer un / ml de solution de chlorhydrate de diaminobenzidine ATTENTION 1 mg en plaçant un comprimé de chlorhydrate de diaminobenzidine 10 mg dans un tube de 2 ml à centrifuger. Ajouter 980 pi de H 2 O distillée et 20 ul d&#39;acide chlorhydrique concentré (11,65 m) et mélanger jusqu&#39;à ce que la solution est brun clair et translucide. Diluer cette solution dans 0,1 M de phosphate ou un tampon cacodylate de sodium 0,1 M à une concentration finale de 1 mg / ml alors que l&#39;ajustement du pH avec de l&#39;hydroxyde de sodium à un pH compris entre 7,0 et 7,6 (pH 7,4 est recommandée). ATTENTION: Diaminobenzidine est toxique! Porter des gants et d&#39;en disposer adéquatement les substances toxiques. </li><li> Pour la photo-oxydation, replace le tampon avec 2 ml d&#39;une solution de chlorhydrate ml 1 mg / diaminobenzidine dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium ou un tampon phosphate. Protéger cette solution de la lumière et laisser refroidir sur de la glace à 4 ° C afin d&#39;augmenter la solubilité de l&#39;oxygène. Saturer la solution avec de l&#39;oxygène par barbotage d&#39;oxygène à travers la solution (en utilisant un tuyau flexible qui est inséré dans la solution et reliée à une bouteille d&#39;oxygène). Vérifier le pH et ajustez si nécessaire. NOTE: Il est essentiel que la réaction de photo-oxydation que le pH est compris entre pH 7,0 et pH 7,6. </li><li> Monter le plat avec les cellules fixées avec précaution sur un microscope inversé à fluorescence équipé d&#39;un objectif 40x à immersion d&#39;huile et le déplacer vers la zone d&#39;intérêt. Exciter le tag miniSOG avec la lumière bleue en utilisant des cubes de filtre pour la GFP ou PCP. MiniSOG a un maximum d&#39;excitation à 448 nm avec un épaulement à 473 nm 10. </li><li> Continuer avec l&#39;illumination même après le vert miniSOG fluorescence has complètement disparu et que le produit de photo-oxydation brune de la diaminobenzidine polymérisé émerge dans le canal de lumière transmise. Lorsque le produit d&#39;oxydation est visible dans la plupart des cellules, désactiver l&#39;éclairage de fluorescence pour arrêter la photo-oxydation. REMARQUE: Photo-oxydation peut prendre plusieurs minutes en fonction de l&#39;objectif, des longueurs d&#39;onde de transmission de filtre et l&#39;efficacité, et la source d&#39;éclairage. </li><li> Postfix les cellules avec 1 ml de glutaraldéhyde à 2% dans du cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 tampon phosphate ou un tampon pH 7,4 pendant 30 min. </li><li> Fixer les membranes des cellules avec 0,1% -0,5% de tétroxyde d&#39;osmium pendant 20 minutes dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 ou dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. NOTE: Il est recommandé d&#39;utiliser la concentration la plus basse possible de tétroxyde d&#39;osmium nécessaire pour stabiliser les membranes. Étant donné que les précipités DAB polymérisés ont une densité élevée de l&#39;azote, qui peut être détectée directement par ESI, une forteosmium coloration est pas nécessaire d&#39;identifier la protéine miniSOG-marqués et pourrait être préjudiciable à l&#39;ESI. Tétroxyde d&#39;osmium est très toxique! Travailler dans une hotte et d&#39;en disposer de façon adéquate les déchets toxiques. </li><li> Déshydrater, les cellules à travers une série d&#39;éthanol à l&#39;aide de 30%, 50%, 70%, 90%, 98% à 100% des étapes de l&#39;éthanol (5 min chacun). Par la suite, incuber les cellules dans un mélange 1: 1 d&#39;éthanol à 100% et de résine acrylique (LR Blanc) et mettre le plat sur un shaker pendant 4 heures pour faciliter l&#39;infiltration dans les cellules avant incubation des cellules pendant au moins un autre 4 heures dans 100 résine acrylique% (LR Blanc). </li><li> Afin de polymériser la résine, couper le couvercle 2 ml d&#39;un tube de microcentrifugation marquée avec une lame de rasoir et la couche jante avec accélérateur de résine acrylique. Assurez-vous que l&#39;accélérateur ne couvre que la jante et ne coule pas dans le tube. Par la suite, remplissez soigneusement le tube environ les deux tiers avec de la résine LR Blanc aide d&#39;une pipette Pasteur. Veillez à ce que la résine ne soit pas en contact l&#39;esprith l&#39;accélérateur sur la jante! </li><li> Retirer la résine qui a infiltré les cellules dans le plat et placer le plat à l&#39;envers sur le tube vertical microcentrifuge permanente afin que la largeur du tube remplit presque entièrement la fenêtre de la boîte d&#39;observation de verre recouverte. </li><li> Attendre 1 à 2 minutes pour l&#39;accélérateur pour sceller le tube et la lamelle couvre-objet, puis inverser le tube de sorte que la résine dans le tube couvre maintenant les cellules. </li><li> Placer le plat avec le tube dans un four à 60 ° C et le guérir pendant 12 heures. </li><li> Lorsque le bloc est guéri, retirez le plat avec le tube à centrifuger de résine rempli joint du four et séparer le tube de microcentrifugation de l&#39;antenne. Faciliter la séparation par les cycles de gel-dégel dans l&#39;azote liquide et de l&#39;eau chaude. </li><li> Jeter le plat à fond de verre et soigneusement ouvrir le tube à centrifuger avec une lame de rasoir afin d&#39;éliminer le bloc. </li><li> Marquez le bloc avec un marqueur permanent. </li><li> Utiliser une lame de rasoir à trim le bloc de sorte que rien d&#39;autre que la région de 1 mm 2 qui contient la zone préalablement marqué avec le stylet de diamant ou de tungstène (ou la zone contient des cellules d&#39;intérêt) demeure. </li><li> Monter le bloc dans un ultramicrotome, couper le bloc avec un couteau de rognage et couper des sections ultra-minces d&#39;environ 50 nm à l&#39;aide d&#39;un couteau de diamant. </li><li> Ramassez les sections sur une transmission élevée de 300 grilles de maille. Ces grilles ont de très petits barreaux de grille et portent donc moins de cellules dans la zone d&#39;intérêt. </li><li> Enduire les sections sur les grilles avec environ 0,2-0,4 nm du carbone à l&#39;aide d&#39;une coucheuse de carbone pour aider à stabiliser les sous le faisceau d&#39;électrons du TEM. </li></ol> 5. Electron Microscopy <ol><li> Charger les grilles dans un TEM qui est équipé d&#39;un filtre d&#39;énergie. Après mise au point du microscope et le filtre d&#39;énergie selon les instructions du fabricant, inspecter les cellules sur les articles dans le mode de grossissement faible (transmission normale) et comparerleur fluorescence données le cas échéant (obtenu à l&#39;étape 4.4). </li><li> Une fois un noyau avec des caractéristiques intéressantes (dommages à l&#39;ADN de la piste ou de réparation de l&#39;ADN foyers) est trouvé, passez en mode de filtrage d&#39;énergie et d&#39;enregistrer une carte d&#39;épaisseur. Remarque: Cette procédure comprend l&#39;enregistrement d&#39;un-zéro perte et une image non filtrée. Épaisseurs allant jusqu&#39;à 0,3 libre parcours moyen (30% des électrons du faisceau incident se diffusée par l&#39;échantillon) sont suffisamment minces pour générer de bonnes cartes élémentaires. </li><li> Rapport de la fiche de carte de l&#39;azote et du phosphore des éléments en utilisant le logiciel qui commande le filtre d&#39;énergie du microscope utilisé. Enregistrez la carte de phosphore après pointe images à 175 eV perte d&#39;énergie avec une largeur de fente de 20 eV et pré-gardistes images à 120 eV perte d&#39;énergie, également avec une largeur de fente de 20 eV. Pour les cartes d&#39;azote, d&#39;enregistrer des images après de pointe à 447 eV avec une largeur de fente de 35 eV et pré-garde des images à 358 eV, également avec une largeur de fente de 35 eV. NOTE: Comme le contenu des éléments imagés (phosphOrus et d&#39;azote) est relativement faible (env. 1%), choisissez &quot;Rapport d&#39;image&quot; (carte élémentaire qualitative) sur la «méthode 3 de fenêtre&quot; (quantifier carte élémentaire) dans le but de générer des images avec un meilleur rapport signal sur bruit. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image <ol><li> Ouvrez les cartes de rapport élémentaires dans un logiciel de traitement d&#39;image qui peut gérer le format de fichier des images acquises (par exemple, Microscopie numérique). Copiez la carte de l&#39;azote dans le canal rouge et le plan de phosphore dans le canal vert d&#39;une image RVB, puis superposer et aligner les cartes. </li><li> Exporter l&#39;image composite comme un format de fichier d&#39;image étiqueté (TIFF) fichier. Ouvrez l&#39;image dans un logiciel de traitement d&#39;image qui peut utiliser des couches (par exemple, Photoshop). </li><li> Ajustez la plage dynamique de chaque canal en rééchelonnant le minimum et maximum dans l&#39;image à un ensemble de données de 8 bits (0 à 255). </li><li> Soustraire la teneur en phosphore à partir de la carte d&#39;azote (en utilisant leFenêtre &quot;Layers&quot;) afin de générer une carte qualitative qui montre la répartition des protéines. </li><li> Convertir les cartes de l&#39;acide nucléique (phosphore) et la protéine (azote) créé à l&#39;étape précédente en «couleurs indexées&quot; et de créer une table de consultation jaune dans l&#39;espace de couleur CMYK pour voir la carte montrant la répartition de l&#39;acide nucléique et une table cyan de recherche montrer la carte non-nucléoprotéine. Les couleurs sont choisies pour produire un contraste maximal entre les deux cartes élémentaires. </li><li> Créer une nouvelle image et d&#39;importer les cartes montrant les distributions de phosphore et de protéines que les différentes couches. Utilisez le mode de la transparence &quot;de l&#39;écran&quot; afin de voir les deux couches superposées les unes aux autres. </li><li> Ouvrez l&#39;image sans perte acquise dans l&#39;étape 5.2. Cette image représente une image de la zone enregistrée qui ressemble à une image TEM classique, mais ne contient que les électrons qui ont traversé l&#39;échantillon sans entrer en collision avec le spécimen. Exportcette image comme une image TIFF. </li><li> Ouvrez l&#39;image exportée de zéro perte dans un éditeur de photo et copiez-le dans la couche supérieure de l&#39;image montrant la carte élémentaire. Alignez l&#39;image en utilisant le mode de la transparence &quot;de l&#39;écran&quot;. </li><li> Facultativement, le seuil de l&#39;image sans perte de segmenter le signal qui provient de la miniSOG. Ajouter l&#39;image résultante comme une couche séparée comme décrit ci-dessus. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

ESI peut servir comme un excellent outil pour examiner les différents états de la chromatine et ribonucléoprotéines dans le noyau, car il est capable de cartographier précisément les zones qui sont riches en phosphore. Il augmente profondément la quantité de détails qui peut être obtenue par un microscope électronique et ne dépend pas de méthodes non spécifiques contrastées. Un inconvénient de ESI est qu&#39;il nécessite des sections plus minces que TEM conventionnelle à la même tension d&#39;accélération. Ceci peut êtr...

Malgré les avancées significatives dans la microscopie optique au cours des dernières années 1, biologistes cellulaires souffrent encore d&#39;une lacune dans la résolution. Cela limite la compréhension des relations structure-fonction dans les processus cellulaires fondamentaux qui impliquent l&#39;interaction coordonnée entre les complexes macromoléculaires (par exemple, dans le remodelage de la chromatine, la réparation d&#39;ADN, la transcription d&#39;ARN et la replication d&#39;ADN). Bien que des microscopes électroniques à transmission (MET) s fournir la résolution requise, il a été difficile de définir ces processus structurellement en raison de l&#39;incapacité à marquer les protéines spécifiques tout en étant capable de déterminer la composition biochimique des structures visualisées. En l&#39;absence de membranes internes pour aider à différencier les structures nucléaires, le noyau a été particulièrement difficile. Electron imagerie spectroscopique (ESI) permet de résoudre certaines de ces limitations en permettant la détection simultanée et la différenciation de l&#39;ADN, de l&#39;ARN, et protein-base structures nucléaires 2-5. Electron imagerie spectroscopique: Afin de cartographier la distribution des éléments à haute sensibilité et une résolution dans le microscope électronique, on peut utiliser un spectromètre d&#39;imagerie qui sélectionne les électrons qui ont été inélastique par des interactions avec les électrons de coque intérieure d&#39;un élément dans l&#39;échantillon 6. En raison des quantités spécifiques d&#39;énergie éléments sont perdues à la suite de l&#39;ionisation d&#39;atomes dans l&#39;échantillon, ces électrons peuvent être séparées et visualisées en utilisant un spectromètre qui est attaché à la microscopie électronique. Ainsi, l&#39;analyse du spectre des électrons qui ont interagi avec l&#39;échantillon révèle des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de l&#39;échantillon 7. Les électrons qui ne perdent pas d&#39;énergie lors du passage à travers l&#39;échantillon se trouvent dans le &quot;pic sans perte» de la perte d&#39;énergie d&#39;électronsspectre. L&#39;abondance de ces électrons est lié à la masse, la densité et l&#39;épaisseur de l&#39;éprouvette et est constitué d&#39;électrons qui passent à travers l&#39;échantillon sans entrer en collision avec l&#39;échantillon ou la perte d&#39;énergie lors du passage à travers l&#39;échantillon. Cette information peut être utile pour la quantification absolue des nombres d&#39;atomes d&#39;un élément spécifique présent dans l&#39;échantillon 8. Depuis échantillons biologiques sont essentiellement des éléments légers qui dévient mal les électrons dans le faisceau incident de TEM, les méthodes de coloration utilisant sels de métaux lourds doivent être appliquées afin de générer contraste dans l&#39;échantillon. Le manque de spécificité de la plupart de ces agents de contraste et de l&#39;incapacité de visualiser plus d&#39;une tache où la spécificité est possible a limité la valeur de la microscopie électronique conventionnelle dans l&#39;étude du noyau. ESI possède des avantages significatifs sur TEM classique, en particulier pour l&#39;étude des structures du noyau de la cellule.Il est possible d&#39;exploiter la nature riche en phosphore de l&#39;ADN et de complexes macromoléculaires contenant de l&#39;ARN à distinguer des complexes de nucléoprotéine de complexes de protéines et de résoudre les différents complexes de nucléoprotéine en fonction de leur densité d&#39;acides nucléiques. Le matériau biologique restant peut être imagée sur la base de l&#39;abondance de l&#39;azote. Cartographie seulement ces deux éléments et l&#39;analyse de leur distribution et l&#39;abondance relative au sein de différentes structures anatomiques nous fournit beaucoup d&#39;informations sur le noyau. Par exemple, il est facile d&#39;identifier la chromatine et les ribosomes dans la carte représentant l&#39;abondance de phosphore. L&#39;espace de interchromatiniens, des complexes de pore nucléaire, corps nucléaires et, d&#39;autre part, peuvent être facilement détectés dans l&#39;image de mappage d&#39;azote. Système générateur d&#39;oxygène singulet Mini (miniSOG) Bien ESI représente une technique puissante pour étudier la structure de la chromatine in situ car il prendres avantage des rapports caractéristiques entre dans la composition élémentaire de l&#39;azote et du phosphore, la composition élémentaire ne peut normalement pas être utilisé pour établir une discrimination entre les différentes populations de complexes protéiques. Les anticorps marqués avec de petites particules d&#39;or dans la plage du nanomètre ont été largement utilisés pour cartographier l&#39;emplacement des molécules individuelles. Depuis la particule d&#39;or est généralement fixé à un anticorps secondaire, il apparaîtra dans une circonférence d&#39;environ 20 nm autour de l&#39;épitope détecté par l&#39;anticorps primaire. Dans les échantillons de post-enrobage, les anticorps peuvent uniquement détecter les epitopes qui sont exposés à la surface des sections. Bien qu&#39;il soit possible de prouver la présence d&#39;un antigène et le relier à une certaine structure anatomique de la cellule, l&#39;information qui est obtenue est incomplète, car la plupart des epitopes sont obscurcies par de la résine. Techniques, qui utilisent des protocoles similaires à ceux utilisés pour la microscopie par fluorescence pré-enrobage, pour permettre l&#39;accès à travers les antigènestoute la profondeur de l&#39;échantillon, mais les étapes de perméabilisation qui sont nécessaires pour permettre à l&#39;anticorps de pénétrer dans la cellule nécessite généralement l&#39;enlèvement de membranes lipidiques et éliminer les composants qui ne peuvent être résolus par des aldéhydes. De plus, le fixateur d&#39;aldéhyde préféré pour la préservation du ultrastructure, le glutaraldéhyde, des epitopes communément détruit et, par conséquent, le paraformaldéhyde est généralement nécessaire. Ceci est moins efficace pour la reticulation protéine-protéine. Un autre inconvénient des anticorps qui sont marqués avec une nanoparticule d&#39;or est que l&#39;or est un matériau dense aux électrons qui crée un très fort contraste qui peuvent masquer des détails de structure intéressants de l&#39;échantillon, qui présente contraste plus faible. L&#39;émergence de la protéine fluorescente verte (GFP) comme une étiquette de protéine exprimée a transformé l&#39;utilisation de la microscopie à fluorescence pour répondre aux questions en biologie cellulaire. Tagging une protéine avec un petit domaine fluorescente permet la cartographie de sa distribution in vivo </em&gt; sans la nécessité de procédures de perméabilisation qui peuvent altérer la structure. Pour traduire le principe de l&#39;utilisation de mots-clés élégant de protéines pour cartographier les distributions de protéines dans une cellule pour la microscopie électronique, a besoin d&#39;un système qui est capable de produire un signal à proximité de la structure d&#39;intérêt et générer contraste dans le TEM. Diaminobenzidine polymérisé est un colorant qui est souvent utilisé en histologie pour détecter la liaison d&#39;anticorps. Cette tache est habituellement déposé en utilisant la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire. Bien que la réaction produit un résultat fiable, la HRP est catalytiquement actif non dans le cytosol des cellules 9. Les produits de réaction de HRP peut aussi diffuser hors du site de génération de sorte que leur résolution est pire que la méthode de Nanogold 10. Afin de contourner ces problèmes, le système / ReAsH flash a été développée 11. Il se compose de protéines de fusion recombinantes qui possèdent un motif tétracystéine. Ce motif permet de liaisonbiarsenic un fluorophore. Quand il est excité, le flash est lié ou ReAsH capable de générer de l&#39;oxygène singulet hautement réactif et donc photoconvert diaminobenzidine (DAB) dans un polymère qui précipite immédiatement sur le site des protéines marquées. Le polymère de DAB peut être coloré avec du tétroxyde d&#39;osmium, qui est électrons dense et donc peut être utilisé pour cartographier la distribution de la protéine de fusion recombinante dans le TEM. En 2011, Shu et al. 10 ont présenté le système miniSOG, qui se compose d&#39;un petit 106 amino tag acides de fusion dérivé d&#39;un flavoprotéine d&#39;Arabidopsis qui est fluorescente et capable de créer de nombreux radicaux oxygène singulet lorsqu&#39;il est excité à 448 lumière bleue nm. Ces radicaux singulet d&#39;oxygène peuvent être utilisés pour oxyder photo-diaminobenzidine pour former des polymères sur la surface et près de la protéine marquée, ce qui est considérablement plus étroite que les anticorps marqués 11 immunologique. Bien que le système FLASH / ReAsH nécessite portant le fluorole chrome et le diaminobenzidine dans les cellules avant de faire la photoconversion, le système ne nécessite que miniSOG diaminobenzidine et de la lumière et en plus est environ deux fois plus efficace à la polymérisation diaminobenzidine. Ici, miniSOG est utilisé en combinaison avec ESI afin de cartographier l&#39;ultrastructure de réparation de l&#39;ADN foyers. Réparation de l&#39;ADN foyers (DRF) ADN non réparé des cassures double brin constituent une grave menace à la cellule, car ils peuvent conduire à des translocations et la perte de l&#39;information génétique. À son tour, cela peut conduire à la sénescence, le cancer et la mort cellulaire. Beaucoup de protéines qui sont impliquées dans l&#39;ADN réparation des cassures double brin accumulent dans les foyers que assembler autour d&#39;un double brin d&#39;ADN briser 12-14. Bien que leur fonction ne soit pas connu, ils représentent le site dans le noyau qui contient le double rupture de brin d&#39;ADN et est le site de l&#39;ADN double brin réparation des cassures. Réparation de l&#39;ADN foci (DRF) ont été caractérisés par microscopie à fluorescence et ils servir de biomarqueurs pour dommages à l&#39;ADN 12,15. Ils sont énormes par rapport à la taille de la cassure double brin et ont été considérés comme relativement homogène jusqu&#39;à ce que des études récentes de microscopie de super-résolution ont révélé des preuves de sous-cloisonnement des molécules au sein de chaque concentrent 16. Afin de comprendre comment ces sites sont organisées, il est nécessaire de visualiser toutes les structures biologiques sous-jacents rapport à l&#39;autre. Cela ne peut être obtenu par microscopie à fluorescence, mais est possible grâce à la microscopie électronique 17,18. Ici, on décrit un procédé qui combine électronique imagerie spectroscopique avec la méthode miniSOG pour illustrer le potentiel de cette approche combinée pour explorer l&#39;ultrastructure de double brin de réparation des cassures de l&#39;ADN.

<table><tbody><tr><td>Plats à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre quadrillés de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp ;</td><td>Non conçu pour les objectifs d’immersion</td></tr><tr><td>LR Blanc : résine acrylique</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR White accelerator</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate 10 mg comprimés</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten-Point Lab Pen</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbone</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra microtome Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>pourrait même fonctionner avec les anciennes versions</td></tr><tr><td>Micrographie numérique V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>pourrait même fonctionner avec les anciennes versions</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Tsien-Lab<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>source de rayonnement césium 137 « MARC 1"</td><td>&nbsp ;( J.L. Shepherd et ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/FiJi</td><td>open source</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Tubes Eppendorf</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife ultra 35&deg ;</td>Couteau de coupe <td>de diatomées</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate trihydraté</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Attention Toxique !</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde EM Grade 8 %</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Attention Toxique !</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium 4 % solution</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Micoscope à fluorescence inversée Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide</td> <td>chlorhydriqueFisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Cyanure de potassium</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Attention Toxique !</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Attention Toxique !</td></tr><tr><td>Lame de rasoir Single Edge Acier au carbone</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Attention Sharp !</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Filtre à énergie</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des minisog protéines marquées de réparation d&#39;adn en combinaison avec electron imagerie spectroscopique (esi)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Les limites de résolution optique et le défi de l&#39;identification des populations de protéines spécifiques dans microscopie électronique en transmission ont été des obstacles en biologie cellulaire. Plusieurs phénomènes peuvent pas être expliqués par une analyse in vitro dans des systèmes simplifiés et ont besoin d&#39;une information structurelle supplémentaire in situ, en particulier dans la plage comprise entre 1 nm et 0,1 pm, de manière à être entièrement compris. Ici, l&#39;imagerie spectroscopique électronique, une technique de microscopie électronique en transmission qui permet la cartographie simultanée de la distribution des protéines et des acides nucléiques, et une étiquette d&#39;expression, miniSOG, sont combinés pour étudier la structure et l&#39;organisation de l&#39;ADN double brin réparation des cassures foyers.

ESI En comparant les images du noyau ESI (figure 1) avec les images de TEM classiques (par exemple, la figure 1.7) révèle une augmentation spectaculaire des structures anatomiques qui peuvent être facilement distingués. Les crêtes de la chromatine apparaissent en jaune et il est assez facile d&#39;identifier les chromocentres dans les cellules de souris. Nucléoles peut être facilement distinguée de la chrom...

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de cartographier la distribution des protéines de réparation de l'ADN autour des cassures double brin de l'ADN à l'échelle nanométrique. Pour étudier l'ultrastructure de la chromatine endommagée en cours de réparation, on utilise l'imagerie spectroscopique électronique. Ceci est réalisé en générant des constructions d'expression d'ADN codant pour des protéines de fusion de protéines de réponse aux dommages de l'ADN, associées à une protéine fluorescente et au mini-tag SOG.Ensuite, les constructions sont introduites dans les cellules par transfection, puis les cellules sont endommagées soit par un laser, soit par une irradiation gamma. Ensuite, les cellules irradiées et fixées subissent des étapes de préparation à la microscopie électronique afin de rendre visible la distribution de la protéine de réparation marquée avec le mini SOG au microscope électronique. L'imagerie spectroscopique électronique obtenue fournit des images détaillées permettant l'analyse de l'ultrastructure de la chromatine et de la relation entre protéines spécifiques et foyers de réparation de l'ADN.Le principal avantage de cette technologie par rapport à d'autres technologies existantes, comme l'étiquetage par ImmunoGold, est qu'elle ne dépend pas de la disponibilité des anticorps et qu'elle marque de manière assez dense les structures d'intérêt. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car l'oxydation photochimique est très sensible au pH, à l'intensité lumineuse et à la saturation en oxygène. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'oxydation photochimique, de saturation en oxygène et d'illumination sont sensibles à de très petites variations ; il est donc important d'illustrer précisément la manière dont la méthode est réalisée afin de permettre sa reproduction.Le Dr Hilmar Fadden, postdoctorant dans mon laboratoire, vous démontrera la méthode de culture. Des cellules d'ostéosarcome humain exprimant de façon stable les protéines de réparation marquées par le mini SOG et M cherry, comme décrit dans le protocole accompagnant. Après avoir divisé les cellules provenant d'une boîte de 10 centimètres, faire pousser les cellules jusqu'à une confluence de 80 %.Ensuite, placer les cellules sous un microscope à fluorescence et utiliser un stylet stérile en diamant pour délimiter une petite zone d’environ un millimètre carré contenant des cellules exprimant les protéines ectopiques. Une fois marquée, sensibiliser les cellules en ajoutant du herx à la solution afin d’obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre, puis les placer dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, irradier les cellules par micro-irradiation laser en utilisant le laser à état solide de 405 nanomètres d’un microscope confocal afin d’induire un dommage de l’ADN. Après le dommage de l’ADN, fixer les cellules à l’abri de la lumière en utilisant un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon au citrate de sodium 0,1 molaire, à température ambiante, après 30 minutes.Lavez les cellules deux fois avec quatre millilitres de tampon de Cate de sodium 0,1 molaire à un pH de 7,4. Ensuite, traitez les cellules fixées avec deux millilitres d'une solution contenant 50 millimolaires de glycine, 5 millimolaires d'aminotriazole et 10 millimolaires de cyanure de potassium à un pH de 7,4 pendant 30 minutes. Remplacez le tampon par deux millilitres de tampon d'oxydation photochimique à un pH de 7,4, préparé comme décrit dans le protocole accompagnant le texte.Incubez ensuite l'échantillon à l'abri de la lumière sur de la glace tout en faisant barboter de l'oxygène dans la solution pour la maintenir saturée en oxygène. Ensuite, montez soigneusement la boîte contenant les cellules fixées sur un microscope à fluorescence inversé équipé d'un objectif à immersion huile de 40 x, puis déplacez-la vers la zone d'intérêt qui avait été délimitée précédemment. Excitez la mini-étiquette SOG avec de la lumière bleue en utilisant des cubes de filtres destinés à la protéine verte fluorescente.Poursuivez l'illumination même après la disparition complète de la fluorescence verte du mini SOG. Et jusqu'à l'apparition du produit brun d'oxydation photochimique du dia-aminobenzidine polymérisé dans le canal de lumière transmise. Ensuite, post-fixez les cellules avec un millilitre de 2 % de glutaraldéhyde dans un tampon de sodium catécholique 0,1 molaire à pH 7,4 pendant 30 minutes.Ensuite, fixer les membranes cellulaires avec du tétraoxyde d'osmium à 0,1 à 0,5 % dans un tampon de catéchol de sodium 0,1 molaire pendant 20 minutes à pH 7,4. Une fois fixées, déshydrater les cellules par une série de lavages à l'éthanol. Puis incuber les cellules dans un mélange un-à-un d'éthanol à 100 % et de résine acrylique sur un agitateur pendant quatre heures.Ensuite, retirez le mélange et ajoutez de la résine acrylique à 100 % aux échantillons pendant quatre heures supplémentaires. Afin de polymériser la résine, coupez le couvercle d'un tube microcentrifuge de deux millilitres étiqueté à l'aide d'une lame de rasoir et enduisez le bord d'accélérateur de résine acrylique. Remplissez soigneusement le tube aux deux tiers environ avec de la résine LR white à l'aide d'une pipette Pasteur. Veillez à ce que la résine n'entre pas en contact avec l'accélérateur sur le rebord. Retirez la résine ayant pénétré dans les cellules de la boîte et placez la boîte à l'envers sur un tube de microcentrifugeuse tenu verticalement, de sorte que le diamètre du tube remplisse presque entièrement la fenêtre d'observation recouverte de verre du poids de la boîte. Laissez 1 à 2 minutes à l'accélérateur pour sceller le tube et la lame de couverture.Ensuite, retourner le tube afin que la résine recouvre maintenant les cellules. Placer la boîte contenant le tube dans un four à 60 degrés Celsius et polymériser pendant 12 heures. Une fois le bloc polymérisé, retirer la boîte contenant le tube de centrifugation microfuge rempli de résine du four et séparer le tube de centrifugation microfuge de la boîte.Jetez la boîte en verre à fond plat et ouvrez soigneusement le tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un scalpel afin de libérer le bloc. À l’aide d’un scalpel, taillez le bloc de manière à ne conserver qu’un carré d’un millimètre carré contenant la zone précédemment marquée au stylo en diamant ou en tungstène. Ensuite, fixez le bloc sur un ultramicrotome et taillez-le à l’aide d’un couteau de parage jusqu’à approcher les cellules.Ensuite, passez à un couteau en diamant et taillez des sections ultramince d'environ 50 nanomètres à travers les cellules. Récupérez les sections sur des grilles à haute transmission de 300 mesh. Puis placez les grilles dans une chambre de dépôt de carbone et recouvrez les sections d'environ 0,2 à 0,4 nanomètre de carbone afin de les stabiliser sous le faisceau électronique du microscope électronique en transmission.Chargez les grilles dans un microscope électronique en transmission équipé d'un filtre énergétique. Examinez les cellules sur les coupes en utilisant le mode de transmission normal à faible grossissement et comparez-les aux images de fluorescence prises précédemment. Une fois un noyau présentant une trace de dommage de l'ADN ou des foyers de réparation de l'ADN identifié, passez en mode de filtrage énergétique et enregistrez l'échantillon avec une carte d'épaisseur.Ensuite, enregistrez les images de la carte de phosphore post-seuil à une perte d'énergie électronique de 175 avec une largeur de fente de 20 électronvolts. Enregistrez également les images pre-seuil à une perte d'énergie de 120 électronvolts, également avec une largeur de fente de 20 électronvolts pour l'enregistrement des cartes d'azote. Enregistrez les images post-seuil à 447 électronvolts avec une largeur de fente de 35 électronvolts et les images pre-seuil à 358 électronvolts.Aussi avec une largeur de fente de 35 volts électroniques. Ouvrir les cartes de rapports élémentaires dans un logiciel de traitement d'image tel que celui-ci. Copier la carte d'azote dans le canal rouge et la carte de phosphore dans le canal vert d'une image RVB.Ensuite, superposez et alignez les cartes. Exportez l'image composite au format de fichier TIFF, puis ouvrez l'image dans un logiciel de traitement d'image capable d'utiliser des calques. Ajustez ensuite la plage dynamique de chaque canal en recalculant les valeurs minimale et maximale de l'image sur un jeu de données de huit bits.Ensuite, soustrayez la teneur en phosphore de la carte d'azote dans la fenêtre des couches. Convertissez l'image en une couleur indexée et créez une table de correspondance jaune dans l'espace colorimétrique CMJN pour la carte montrant la distribution des acides nucléiques, et une table de correspondance cyan pour représenter la carte des protéines non chromatiennes. Créez ensuite une nouvelle image et importez les cartes montrant les distributions du phosphore et des protéines non chromatiennes comme couches différentes.Utilisez le mode de transparence de l'écran afin de visualiser les deux couches superposées l'une sur l'autre. On montre ici des cartes de rapports spectroscopiques électroniques provenant de l'intérieur d'un noyau cellulaire, illustrant les emplacements du phosphore et de l'azote lorsque les deux cartes de rapports sont superposées dans l'espace colorimétrique RVB. Une image telle que celle présentée ici est obtenue dans cette image.Les structures jaunes représentent des protéines nucléaires reflétant la présence de phosphore et d'azote. Ici, l'imagerie spectroscopique électronique est utilisée pour observer les changements de la structure des foyers après une irradiation gamma dans des cellules U2 OS. La rangée supérieure montre des images de cellules exprimant de façon stable des protéines de réparation marquées avec M cherry et qui n'ont pas été irradiées.La deuxième ligne montre des cellules fixées trois heures après l'irradiation. La troisième ligne montre des cellules fixées six heures après l'irradiation. L'imagerie spectroscopique électronique révèle que la structure des foyers semble se réorganiser au fil du temps, car la quantité relative de la protéine 53BP1 dans le foyer, indiquée par l'augmentation du signal azoté, semble augmenter, tandis que la chromatine, indiquée par le signal phosphoré, occupe une position plus périphérique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des cellules irradiées exprimant des protéines de réparation mini so afin d'analyser la structure ultrafine de la chromatine dans les foyers de réparation de l'AD à l'aide de l'imagerie spectroscopique électronique. N'oubliez pas que l'utilisation de tampon au cyanure de potassium, de corrélatif au sodium et d'oxyde d'osmium peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que de travailler sous hotte aspirante et de porter des gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Biology

Biologie

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