in vivo Imagerie calcique de la réponse des neurones des ganglions de la racine dorsale aux stimuli somatiques et viscéraux

Notre recherche se concentre sur les neurones et les circuits du système somatosensoriel impliqués dans la narration des effets analgésiques de l’acupuncture sur la douleur viscérale tout en essayant d’ajuster les réponses neuronales de la neuro DRG aux stimuli d’acupuncture. Les méthodes traditionnelles, telles que l’électro-enregistrement, ne peuvent pas examiner efficacement le nombre suffisant de cellules et les liens cellulaires spécifiques distincts pour identifier les neurones viscéraux ou somatiques réactifs in vivo. L’étude des rôles fonctionnels des neurones DRG dans l’effet analgésique de l’acupuncture a été difficile en raison de contraintes technologiques.

Nous avons introduit une approche générale pour observer la responsabilité d’un neurone DRG numéro six dans la simulation intracolique et d’acupuncture in vivo. Le protocole décrit les procédures d’observation de l’activité des neurones DRG in vivo en réponse à l’entrée somatique et viscère. Il s’agit d’une amélioration par rapport à l’étude précédente, qui se concentrait uniquement sur l’étude des réponses neuronales dans L5 DRG sous les stimuli somatiques.

À l’avenir, avec la bonne configuration, l’imagerie CAS in vivo DRG pourra être réalisée dans les segments thoraciques ou cervicaux, fournissant un outil plus puissant pour étudier la nociception viscérale et les effets de l’acupuncture. Cette méthode est essentielle pour l’apprentissage des chercheurs en acupuncture. Pour commencer, placez la souris trachéostomisée en position couchée sur le coussin chauffant.

Faites une incision médiane de sept centimètres de long dans le bas du dos et étendez-la de la cinquième vertèbre lombaire à la première vertèbre sacrée. Ensuite, écartez soigneusement les muscles longissimus lumborum pour exposer les apophyses épineuses des trois vertèbres. Déplacez les parties internes du longissimus lumborum bilatéral, des muscles dorsaux de la colonne lombaire et des muscles dorsaux de la demi-épine lombaire pour exposer les trois apophyses articulaires et mammilaires successives avec le segment d’enregistrement au milieu des vertèbres.

Maintenant, immobilisez en toute sécurité l’animal avec une pince à dents sur les processus articulaires bilatéraux des vertèbres voisines. À l’aide d’une pince rongeur, vous pouvez retirer les apophyses articulaires et mammilaires gauche ou droite des quatre ou six vertèbres lombaires. Exposez soigneusement les six DRG lombaires gauche ou droit après avoir dégagé les tissus conjonctifs au-dessus.

Assurez-vous de garder l’épineurium intact du côté choisi des six vertèbres lombaires. Couvrez les zones exposées avec de petites boules de coton imbibées de solution saline pour maintenir l’état actif. Maintenant, connectez le système d’administration d’anesthésie à faible débit à la canule trachéale pour intuber les souris.

Positionnez l’animal avec le DRG exposé sur un coussin chauffant situé sur la scène d’une pince vertébrale personnalisée. À l’aide de deux pinces sur les colonnes vertébrales des vertèbres voisines, sécurisez l’animal pour minimiser les mouvements pendant les tests. Ensuite, remplacez les boules de coton imbibées de sérum physiologique jusqu’à ce que la zone chirurgicale soit suffisamment propre.

Insérez la pince vertébrale personnalisée dans la platine de microscope conçue sur mesure. Pour l’imagerie, placez une lentille d’objectif à air à longue distance de travail d’un microscope confocal sur le DRG exposé. Capturez des piles Z timelapse des quatre ou six DRG lombaires intacts avec 25 micromètres par pas et une résolution de 512 par 512 ou 1 024 x 1 024 pixels.

Effectuez un balayage XYZT du DRG avec quatre à huit piles, englobant un à trois états de base, deux à trois stimuli d’acupuncture ou de distension colorectale viscérale, et un à deux états post-stimuli. Ensuite, appliquez des stimuli de brossage ou de pincement sur le bas du dos, les membres postérieurs ou la patte arrière de l’animal pour évaluer le champ récepteur le plus sensible des neurones DRG imagés. Administrez les stimuli d’acupuncture manuellement ou à l’aide d’un point d’acupuncture et d’un stimulateur nerveux disponibles dans le commerce.

Utilisez la distension colorectale avec un manomètre d’air fabriqué par vous-même pour induire des stimuli viscéraux. À l’aide d’un microscope confocal, mesurez l’augmentation de la fluorescence verte de la GCaMP neuronale lors de la liaison au calcium intracellulaire suite à des stimuli somatiques ou viscéraux. À l’aide d’un logiciel d’imagerie, éclaircissez la vidéo à l’aide de l’option couleur.

Délimitez manuellement les cellules visibles et déterminez la taille des cellules et l’intensité relative de la fluorescence. Exprimer l’intensité de fluorescence en rapport avec l’augmentation de la fluorescence maximale évoquée par rapport au niveau basal. Les six neurones DRG lombaires n’ont généralement pas de fluorescence GFP de base, peut-être influencée par les niveaux d’expression de GCaMP et les dommages chirurgicaux.

Les stimuli de distension colorectale ont induit une augmentation rapide et transitoire de la fluorescence de GCaMP. Des réponses similaires ont été observées avec l’application d’électroacupuncture BL25. Des cartes thermiques et des graphiques linéaires ont montré les réponses de tous les neurones encerclés à la distension colorectale et à l’électroacupuncture BL25.

L’histogramme montre les diamètres des neurones sensibles à la distension colorectale et à l’électroacupuncture BL25.