Name: Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Apprenez le clonage sans couture pour construire des vecteurs d'expression complexes du PRRSV par recombinaison homologue. Cette méthode permet d'assembler efficacement plusieurs fragments d'ADN dans le vecteur pVAX1.

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Ce travail a été soutenu par le soutien financier des fonds d’initiation à la recherche doctorale fournis par l’Université normale de Chine Ouest (n° 20E059).

1. Préparation du modèle du gène du SDRP
<ol><li>Décongeler le stock viral dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Ajouter 0,2 mL de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 3 min.</li>
	<li>Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 × g à 4 °C. REMARQUE : Le mélange est divisé en trois phases, à savoir, une phase aqueuse incolore, une interphase et une phase phénol-chloroforme rouge.</li>
	<li>Pipetez la phase aqueuse incolore et transférez-la dans un nouveau tube.</li>
	<li>Bien mélanger la phase aqueuse avec 0,5 mL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 °C. REMARQUE : Le fond du tube a un précipité d’ARN blanc.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube.</li>
	<li>Ajoutez 1 ml d’éthanol à 75 % pour remettre la pastille en suspension et agitez brièvement.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 7 500 × g à 4 °C. À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube.</li>
	<li>Faites sécher l’ARN pendant 5 min, ajoutez 20 à 50 μL d’eau exempte de RNase pour remettre l’ARN en suspension et mélangez soigneusement.</li>
	<li>Procédez à la transcription inverse ; configurez les réactions pour effectuer la transcription inverse comme indiqué dans le tableau 1. REMARQUE : Pour assurer une transcription inverse réussie, utilisez des matrices d’ARN de haute qualité.</li>
	<li>Utilisez l’ADNc obtenu pour la PCR ou stockez-le à -20 °C.</li>
</ol>2. Conception de l’amorce PCR
<ol><li>Conception de l’amorce avant<ol><li>Ouvrez le logiciel et choisissez Nouveau fichier ADN.</li>
		<li>Collez la séquence du gène PRRSV (GenBank : FJ548852.1) de NCBI dans le logiciel. Cliquez sur OK pour générer les fichiers de séquence.</li>
		<li>Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments. Concevez l’amorce de séquence spécifique des fragments. Dans la plupart des cas, la température de fusion préférable (Tm) est comprise entre 55 °C et 62 °C, et la teneur en GC est de 40 à 60 %.</li>
		<li>Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer.</li>
		<li>Collez la séquence spécifique et ajoutez des séquences de chevauchement du vecteur au premier nucléotide 5' de l’amorce de la séquence spécifique. Près de chaque jonction, choisissez 20-40 pb pour servir de région de chevauchement entre les deux fragments adjacents.</li>
		<li>Nommez l’amorce avant contenant les porte-à-faux et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1).</li>
		<li>Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle.</li>
	</ol></li>
	<li>Conception de l’amorce inversée<ol><li>Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments dans le logiciel. Concevez l’amorce de séquence spécifique inverse des fragments.</li>
		<li>Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer.</li>
		<li>Collez la séquence spécifique et ajoutez le site de restriction au premier nucléotide 5' de l’amorce de séquence spécifique. REMARQUE : Les sites de restriction ajoutés doivent être absents du fragment d’insertion et du vecteur, à l’exception des sites de clonage multiples.</li>
		<li>Ajoutez des séquences de vecteurs en surplomb de 20 à 40 pb au premier nucléotide 5' du site de restriction.</li>
		<li>Nommez l’amorce inverse contenant les surplombs et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1).</li>
		<li>Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle.</li>
	</ol></li>
</ol>3. La PCR pour amplifier les fragments
<ol><li>Mettre en place six réactions PCR individuelles (tableau 2) : pour le fragment 1, utiliser les amorces P1 et P2 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 2, utiliser les amorces P3 et P4 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 3, utiliser les amorces P5 et P6 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour amplifier le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2). REMARQUE : Décongelez, mélangez et centrifugez brièvement chaque composant avant utilisation.</li>
	<li>Exécutez la PCR à l’aide du protocole en trois étapes du Tableau 2.</li>
	<li>Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.</li>
	<li>Analysez les échantillons à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.</li>
</ol>4. Purification des fragments de PCR
REMARQUE : La purification des produits PCR à partir d’un gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir le tableau des matériaux) est importante pour la construction vectorielle.
<ol><li>Ajoutez 9 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 45 μL de produits PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.</li>
	<li>Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % pour séparer les fragments d’ADN. REMARQUE : Ne réutilisez pas le tampon de fonctionnement TAE car sa valeur de pH affectera la récupération des fragments d’ADN.</li>
	<li>Une fois les bandes correctement séparées, utilisez un scalpel bien aiguisé pour exciser soigneusement les bandes d’ADN. REMARQUE : Minimisez la taille de la tranche de gel en coupant l’excès d’agarose.</li>
	<li>Pesez la tranche de gel dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml, ajoutez un volume égal de tampon de liaison à la tranche de gel (p. ex., de 0,3 mL à une tranche de 0,3 g) et laissez incuber à 60 °C pendant 7 min.</li>
	<li>Insérez une mini-colonne dans un tube de prélèvement de 2 ml. Ajouter 700 μL de solution d’ADN/agarose de l’étape 4.4 dans la mini-colonne.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de tampon de liaison et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.</li>
	<li>Ajouter 700 μL de tampon de lavage et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.</li>
	<li>Faites tourner la mini-colonne vide pendant 2 min à vitesse maximale pour sécher la matrice de la colonne. Placez la mini-colonne dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml.</li>
	<li>Ajouter 20 μL d’eau déminéralisée directement au centre de la membrane de la colonne et laisser reposer à température ambiante pendant 2 min. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 1 min.</li>
	<li>Stockez l’ADN à -20 °C.</li>
</ol>5. Préparation d’un vecteur linéarisé
REMARQUE : Après avoir préparé le plasmide, les enzymes sélectionnées peuvent être utilisées pour le couper. La digestion longue ou la digestion à double enzyme est cruciale pour assurer la digestion de tout l’ADN. Cela réduira le nombre de clones faussement positifs dans les expériences ultérieures.
<ol><li>Linéarisation pVAX1
	<ol><li>Préparez le mélange réactionnel à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3). REMARQUE : Le volume d’eau doit être ajouté pour conserver le volume total de réaction indiqué. Ici, 1 μg du plasmide a été digéré avec des enzymes dans le mélange réactionnel. En fonction de la concentration du plasmide, le volume du plasmide peut être ajusté dans le mélange réactionnel.</li>
		<li>Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min.</li>
		<li>Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Linéarisation pVAX1-F1 NOTE : pVAX1-F1 est le vecteur obtenu à partir du premier tour de recombinaison de pVAX1 (NdeI et HindIII) et du fragment 1. pVAX1-F2 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F1 (NdeI) et du fragment 2. pVAX1-F3 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F2 (NdeI) et du fragment 3. pVAX1-F4 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F3 (NdeI) et du fragment 4. pVAX1-F5 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F4 (EcoRV et NtoI) et du fragment 5.<ol><li>Pour chaque vecteur, préparer le mélange réactionnel séparément à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3).</li>
		<li>Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min.</li>
		<li>Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Sous-clonage vers un nouveau vecteur
REMARQUE : Une bonne efficacité de clonage peut être obtenue en utilisant 50 à 200 ng de vecteur et d’inserts.
<ol><li>Configurez la réaction de clonage et d’assemblage sans couture ExonArt (Tableau 4). Ajustez le volume total de réaction à 10 μL à l’aide deH2O désionisé stérilisé et mélangez.</li>
	<li>Incuber la réaction dans un thermocycleur pendant 15 à 60 min à 50 °C. Conservez les échantillons sur de la glace. REMARQUE : Prolonger l’incubation jusqu’à 60 min peut améliorer l’efficacité de l’assemblage.</li>
	<li>Décongeler des cellules DH5α chimiquement compétentes sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 10 μL du produit d’assemblage dans les cellules compétentes ; Ensuite, mélangez doucement en pipetant de haut en bas.</li>
	<li>Placez le mélange sur de la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Choc thermique à 45 °C pendant 45 s et transfert des tubes sur de la glace pendant 3 min.</li>
	<li>Ajouter 900 μL de fluide SOC dans le tube.</li>
	<li>Agitez le tube à 225 tr/min pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.</li>
	<li>Centrifuger la réaction de transformation à 6 000 × g pendant 2 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de milieu SOC frais.</li>
	<li>Étalez la suspension cellulaire transformée sur une plaque LB séparée avec 50 μg/mL de kanamycine.</li>
	<li>Incuber toutes les assiettes pendant la nuit à 37 °C. Choisissez des colonies isolées individuelles dans chaque plaque expérimentale.</li>
</ol>7. Analyse des transformants
<ol><li>Prélever huit colonies dans 20 μL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.</li>
	<li>Configurez la réaction PCR de la colonie et exécutez la PCR (Tableau 5). REMARQUE : Pour la réaction de PCR de la colonie pour le fragment 1, utilisez les amorces P1 et P2 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 2, utilisez les amorces P3 et P4 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 3, utilisez les amorces P5 et P6 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour détecter le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2).</li>
	<li>Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.</li>
	<li>Analysez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.</li>
	<li>Sélectionner une colonie positive dans 5 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et faire pousser toute la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Obtenez le plasmide à l’aide d’une mini-trousse d’ADN plasmidique (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Visualisez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.</li>
</ol>

Clonage du gène SDRP complet dans le vecteur d’expression pVAX1

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La technique d’assemblage Gibson est une méthode de clonage moléculaire basée sur la recombinaison in vitro pour l’assemblage de fragments d’ADN8. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN en un plasmide circulaire dans une réaction isotherme à tube unique. Cependant, l’un des obstacles à la technique d’assemblage Gibson est l’acquisition de longs fragments à partir d’ADNc. Les longs fragments sont difficiles à amplifier avec précision pour de nombreuses raisons. Par exemple, les amorces sont plus faciles à désapparier pendant de longues périodes d’extension, l’ADNc peut ne pas être de bonne qualité ou les régions riches en GC arrêteront la polymérisation de l’ADN. Lorsque le fragment complet ne peut pas être facilement obtenu à partir de l’ADNc par PCR, le fragment complet doit être divisé en plusieurs fragments pour l’amplification. Cependant, à mesure que le nombre et la longueur des fragments d’ADN insérés augmentent, l’efficacité et les clones positifs de l’essai de recombinaison homologue diminueront également de manière significative. Par conséquent, nous avons essayé une solution alternative en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3' des inserts. Ensuite, nous pourrions linéariser le vecteur et joindre les fragments d’ADN dans le vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue et éliminer les sites de restriction indésirables via la réaction de recombinaison homologue.
En tant que l’un des agents pathogènes les plus importants sur le plan économique sur les marchés mondiaux, le SDRP a toujours attiré l’attention des chercheurs au cours des 30 dernières années 10,21,22. Il s’agit d’un virus à ARN à brin positif, d’une longueur d’environ 15 kb, et le long fragment d’ADN ne peut pas être facilement amplifié à partir de l’ADNc. Par conséquent, pour déterminer si cette méthode peut être utilisée pour le clonage de longs fragments, nous avons utilisé le SDRP comme modèle pour le clonage complet du génome. Dans cette étude, nous avons divisé la séquence complète en six fragments et ajouté des sites de restriction appropriés à l’amorce inverse, obtenant six fragments par PCR. Nous avons ensuite réussi à obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV sur toute sa longueur par plusieurs séries de réactions de recombinaison. De plus, le vecteur d’expression du SDRP construit peut servir de modèle pour la transcription in vitro afin d’obtenir des ARN coiffés pour la recherche sur la transfection ou sur les vaccins à ARNm. Pendant ce temps, le plasmide viral à ARNm construit peut être utilisé pour le criblage par lots de composés naturels antiviraux in vitro grâce à des techniques d’interaction moléculaire, telles que la résonance plasmoniquede surface 23,24. Le plasmide pVAX1 répond aux exigences car un test de transcription in vitro nécessite un plasmide à haute copie avec un promoteur T7. En outre, le plasmide pVAX1-PRRSV contenant le promoteur CMV peut être transfecté dans les cellules BHK-21 pour l’expression du génome viral25,26.
En résumé, avec ce protocole, nous démontrons que des gènes longs et complets peuvent être divisés en plusieurs fragments obtenus par amplification PCR. Il est important que les amorces inverses soient introduites dans les sites de restriction appropriés afin que le vecteur d’expression génique complet puisse être obtenu par plusieurs cycles de réactions de recombinaison. Cette méthode peut être utilisée pour les gènes complets qui ne peuvent pas être obtenus directement par une seule PCR ou pour les gènes complets qui ne peuvent pas être obtenus par recombinaison homologue de plusieurs inserts. Par conséquent, cette approche est un complément important à la technique d’assemblage de Gibson, nous prévoyons qu’elle peut être largement utilisée pour le clonage de longs fragments d’ADN et la construction de gènes de fusion.

En tant que technique essentielle pour construire des outils expérimentaux basés sur l’ADN pour l’expression dans les cellules procaryotes et eucaryotes, le clonage moléculaire est une composante très importante de la biologie expérimentale. Le clonage moléculaire implique quatre processus : l’acquisition de l’ADN de l’insert, la ligature de l’insert dans le vecteur approprié, la transformation du vecteur recombinant en Escherichia coli (E. coli) et l’identification des clones positifs1. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été adoptées pour assembler des molécules d’ADN en utilisant des enzymes de restriction 2,3 et une recombinaison médiée par PCR 4,5,6. La recombinaison homologue, connue sous le nom de technologie de clonage sans soudure, est le groupe de méthodes de clonage, qui permet l’insertion indépendante de la séquence et sans cicatrice d’un ou plusieurs fragments d’ADN dans un vecteur. Cette technologie comprend le clonage indépendant de la séquence et de la ligature (SLIC), l’extrait de clonage de ligature sans couture (SLiCE), l’infusion et l’assemblage Gibson. Il utilise une exonucléase pour dégrader un brin de l’insert et un vecteur pour générer des extrémités cohésives, et soit une réparation in vivo, soit une recombinaison in vitro pour joindre de manière covalente l’insert au vecteur en formant des liaisons phosphodiester. La possibilité de joindre un seul insert à un vecteur à n’importe quelle séquence sans aucune cicatrice est très attrayante. De plus, la technologie a la capacité de joindre 5 à 10 fragments dans un ordre prédéterminé sans restriction de séquence.
En tant que l’une des nombreuses techniques d’ADN recombinant, la technique d’assemblage Gibson, actuellement la méthode de clonage la plus efficace 7,8, est une méthode robuste et élégante basée sur l’exonucléase pour assembler un ou plusieurs fragments d’ADN linéarisés de manière transparente. La réaction d’assemblage de Gibson est réalisée dans des conditions isothermes à l’aide d’un mélange de trois enzymes, à savoir l’exonucléase 5', la polymérase haute fidélité et une ADN ligase thermostable. Les surplombs monobrins de 3' créés par l’exonucléase de 5'-3' contribuent au recuit de fragments qui partagent la complémentarité à une extrémité. La polymérase haute fidélité comble efficacement les lacunes dans les régions monocaténaires recuites en ajoutant des dNTP, et l’ADN ligase thermostable scelle les entailles pour former des molécules d’ADN articulaires8. Par conséquent, cette méthode technique a été largement utilisée pour la construction de vecteurs d’expression génique.
Le syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale qui entraîne des troubles de la reproduction et une insuffisance respiratoire chez les porcs causée par le SDRP à l’âge de9 ans. Le syndrome se manifeste par de la fièvre, de l’anorexie, une pneumonie, une léthargie, une dépression et une détresse respiratoire. De plus, des signes cliniques, notamment une décoloration rouge/bleue des oreilles, ont été observés dans certaines épidémies. En tant que membre de la famille des artérivirus, le SDRP est largement transmis aux pays producteurs de porc par contact direct et échange de liquides, notamment l’urine, le colostrum et la salive. En raison de la propagation du SDRP aux États-Unis, les pertes économiques totales de l’industrie porcine ont été estimées à environ 664 millions de dollars par an, sur la base de l’échelle de reproduction de 5,8 millions de truies et de 110 millions de porcs10,11. Le rapport du Service d’inspection de la santé animale et végétale montre que 49,8 % des porcs non vaccinés présentent la présence du SDRP dans le sérum12 et que de faibles niveaux de SDRP chez les porcs infectés sont excrétés par la salive, les sécrétions nasales, l’urine et les matières fécales13. De multiples stratégies ont été mises en œuvre pour contrôler la propagation du SDRP 14,15,16. En plus des procédures d’élimination visant à créer des populations complètement négatives pour le virus ou à améliorer la biosécurité et la gestion, l’administration de vaccins est un moyen efficace de contrôler le SDRP.
Le SDRP est un virus à ARN monocaténaire enveloppé de polarité positive d’une longueur d’environ 15 kilobases (kb). Le génome du SDRP se compose d’au moins 10 cadres de lecture ouverts (ORF), d’une courte région non traduite de 5' (5' UTR) et d’une queue poly(A) à l’extrémité 3' (Figure 1A)17. Le génome d’un virus à ARN à brin négatif n’est pas infectieux, tandis que le génome d’un virus à ARN à brin positif est infectieux. Il existe deux stratégies principales pour la transfection de l’ARN et de l’ADN afin de générer la descendance du virus18. Cependant, le clonage du fragment complet correspondant au génome de l’ARN est crucial pour la construction de clones infectieux. En raison de la nature longue et complexe du génome du SDRP, il n’est pas facile d’obtenir le génome complet par PCR en une seule fois. De plus, bien que la synthèse artificielle des gènes du SDRP soit une solution efficace, la synthèse de longs fragments est souvent coûteuse. Par conséquent, pour obtenir le vecteur d’expression PRRSV pleine longueur, nous avons tenté de le créer par la méthode de recombinaison homologue à inserts multiples19,20. Malheureusement, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir le vecteur d’expression génique complet. Par conséquent, dans cette étude, nous avons ajouté des sites de restriction appropriés à l’amorce inverse et avons réussi à obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV par plusieurs séries de réactions de recombinaison homologues. De plus, cette méthode peut également réaliser la suppression ou la mutation de gènes cibles et joindre efficacement un grand nombre de fragments d’ADN au vecteur d’expression.

<table><tbody><tr><td>1 kb plus Échelle d’ADN</td><td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Universal Green PCR Master Mix</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Sujing Antai Air Technology&nbsp ; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>Équipement d’électrophorèse de l’ADN</td><td>Cleaver Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de chargement d’ADN (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E. Z. N. A. Kit d’extraction de gel</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Mini kit d’ADN plasmidique I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Cultivateur à température debout électro-chauffant</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonage et d’assemblage sans couture ExonArt</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix avec dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>machine à glaçons</td><td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platinum SuperFi II ADN polymérase</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB Plaque de gélose (Kanamycin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB Milieu liquide stérile (Kanamycin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>&mdash ;</td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Agitateurs orbitaux</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>PRRSV virus</td><td>Sichuan Agricultural University</td><td>&mdash ;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Pour concevoir des amorces</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp ; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; Co., Ltd</td><td>Réactif d’extraction d’ARN</td> <td>15596026</td></tr></tbody></table>

une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

La construction de vecteurs d’expression génique est une composante importante des travaux de laboratoire en biologie expérimentale. Avec les progrès techniques tels que l’assemblage Gibson, la construction vectorielle devient relativement simple et efficace. Cependant, lorsque le génome complet du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) ne peut pas être facilement amplifié par une seule réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l’ADNc, ou qu’il est difficile d’acquérir un vecteur d’expression génique complet par recombinaison homologue de plusieurs inserts in vitro, la technique actuelle d’assemblage de Gibson ne parvient pas à atteindre cet objectif.
Par conséquent, nous avons cherché à diviser le génome du SDRP en plusieurs fragments et à introduire des sites de restriction appropriés dans l’amorce inverse pour obtenir des fragments amplifiés par PCR. Après avoir joint le fragment d’ADN précédent dans le vecteur par la technologie de recombinaison homologue, le nouveau vecteur a acquis le site de clivage de l’enzyme de restriction. Ainsi, nous pouvons linéariser le vecteur en utilisant le site de clivage enzymatique nouvellement ajouté et introduire le fragment d’ADN suivant en aval du fragment d’ADN en amont.
Le site de clivage de l’enzyme de restriction introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en amont sera éliminé, et un nouveau site de clivage sera introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en aval. De cette façon, nous pouvons joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un. Cette méthode est applicable pour construire avec succès le vecteur d’expression du SDRP et constitue une méthode efficace pour assembler un grand nombre de fragments dans le vecteur d’expression.

Dans cet article, nous présentons un système de recombinaison in vitro permettant d’assembler et de réparer des molécules d’ADN qui se chevauchent à l’aide de l’amorce inverse via des sites de restriction introduits en permanence (Figure 1B). Ce système est une procédure simple et efficace comprenant la préparation du vecteur linéaire et des fragments d’insert contenant des surplombs introduits par PCR avec des amorces ayant des séquences d’extension 5' appropriées et des sites de restriction ; une réaction isotherme unique in vitro et la transformation chimique standard de produits de recombinaison en bactéries hôtes appropriées ; et la sélection d’une colonie positive et l’obtention du vecteur recombinant pour la prochaine série de clonage. Pour obtenir le vecteur pVAX1-PRRSV étape par étape, les sites de restriction doivent être absents des inserts et des multiples sites de clonage du vecteur recombinant.
Comme il est difficile d’obtenir des séquences génétiques complètes et complexes avec une seule PCR, les fragments insérés du SDRP n’ont pu être amplifiés qu’avec six réactions de PCR (Figure 1C). Au cours de la première série de recombinaisons, le fragment 1 du SDRP a été inséré avec succès dans le vecteur pVAX1, et le nouveau plasmide recombinant avec les sites de restriction introduits (NheI, un seul site de clivage enzymatique) a été nommé pVAX1-F1 (Figure 1D). Lors du deuxième tour de recombinaison, le vecteur pVAX1-F1 a été linéarisé avec l’enzyme de restriction NheI. Le fragment 2 a été inséré avec succès dans le vecteur pVAX1-F1, produisant le plasmide recombinant pVAX1-F2 avec des sites de restriction (NheI, un site de clivage enzymatique unique) (Figure 1D). Pour le troisième cycle de recombinaison, comme le montre la figure 1D, le fragment 3 a été inséré avec succès dans le vecteur pVAX1-F2 pour obtenir pVAX1-F3 avec des sites de restriction (NheI, un site de clivage enzymatique unique). Dans le quatrième tour de recombinaison, nous avons obtenu le vecteur pVAX1-F4 en introduisant le fragment 4 avec des sites de restriction EcoRV (un seul site de clivage enzymatique). Ensuite, le vecteur pVAX1-F4 a été linéarisé par l’enzyme de restriction EcoRV et NotI. Le fragment 5 a été cloné dans le vecteur pVAX1-F4 pour obtenir pVAX1-F5 avec des sites de restriction (NotI, un seul site de clivage enzymatique). Après le dernier cycle de recombinaison, le vecteur de surexpression pleine longueur du SDRP (pVAX1-PRRSV) a été obtenu avec succès (Fichier supplémentaire 1). Comme l’illustre la figure 1D, le nouveau plasmide recombinant devient de plus en plus grand avec l’introduction continue de fragments. Ainsi, ces résultats ont indiqué que la combinaison de l’ajout de sites de restriction appropriés et de l’utilisation de la technique d’assemblage de Gibson peut permettre d’introduire efficacement des fragments d’ADN dans le vecteur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> Figure 1 : Organisation et construction des vecteurs pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) par recombinaison homologue. (A) Organisation du génome du SDRP. ORF1b code pour l’ARN polymérase ARN-dépendante, l’ARN hélicase et les domaines multinucléaires de liaison au zinc. D’autres ORF codent pour des glycoprotéines associées à la membrane (GP2, GP3, GP4 et GP5), la protéine E, la protéine d’enveloppe membranaire et la protéine de nucléocapside. (B) Schéma du processus de génération du vecteur pVAX1-PRRSV. (C) Le gel d’agarose d’ADN montre l’amplification par PCR des fragments cibles. (D) Avec l’insertion de fragments, la taille du vecteur recombinant augmente progressivement. Abréviations : SDRP = virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ; ORF = cadre de lecture ouvert ; GP = glycoprotéine ; E = protéine E ; M = protéine d’enveloppe membranaire ; N = protéine de nucléocapside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ARN du SDRP</td>
			<td>2 μL (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Eau sans RNase</td>
			<td>11 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Mélange de réaction</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mélange d’enzymes suprême</td>
			<td>3 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Température</td>
			<td>Durée</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr><tr><td>25 °C</td>
			<td>Durée : 10 minutes</td>
			<td>Supprimez l’ADN génomique, des amorces aléatoires s’apparient avec des matrices d’ARN</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>Durée : 15 minutes</td>
			<td>Inactivation rapide de la dsDNase et transcription inverse</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>Durée : 5 minutes</td>
			<td>Inactivation de la transcriptase inverse</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : configuration et conditions de la transcription inverse
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Tampon SuperFi II</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce avant 10 μM</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce inversée 10 μM</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 mM de dNTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ADNc (SDRP)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ADN polymérase Platinum SuperFi II</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>jjH2O</td>
			<td>32 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Étape du cycle</td>
			<td>Température</td>
			<td>Durée</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation initiale</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 secondes</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 secondes</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>Recuit</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 secondes</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Extension</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 minutes</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Extension finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>Durée : 5 minutes</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Tenir</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Configuration et conditions de la réaction PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Linéarisation pVAX1</td>
			<td>Linéarisation pVAX1-F1</td>
			<td>Linéarisation pVAX1-F2</td>
			<td>Linéarisation pVAX1-F3</td>
			<td>Linéarisation pVAX1-F4</td>
			<td>Linéarisation pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vecteur</td>
			<td>10 μL (1 μg) de pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 μg) de pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) de pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) de pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) de pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 μg) de pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Enzyme de restriction 1</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL d’EcoRV</td>
			<td>1 μL de NotI</td>
		</tr><tr><td>Enzyme de restriction 2</td>
			<td>1 μL de HindIII</td>
			<td>1 μL de HindIII</td>
			<td>0,5 μL de CIAP</td>
			<td>0,5 μL de CIAP</td>
			<td>1 μL de NotI</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>10x tampon FastDigest</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>jjH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>13 μL</td>
			<td>9 μL</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Mélange linéarisé de pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 et pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>Kit de clonage et d’assemblage sans couture ExonArt</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Vecteur linéarisé</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>Fragment</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>jjH2O</td>
			<td>à 10 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 4 : Configuration de la réaction de clonage et d’assemblage sans couture d’ExonArt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x Master Mix PCR vert universel</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce avant 10 μM</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce inversée 10 μM</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Modèle</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>jjH2O</td>
			<td>8,2 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Température</td>
			<td>Durée</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>30 secondes</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 secondes</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 secondes</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 minutes</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>Durée : 5 minutes</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 5 : Configuration et conditions de la PCR de la colonie.
Figure supplémentaire S1 : Schéma du processus de conception de l’amorce. D’autres modèles d’amorces tels que P5 et P6 sont également présentés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Séquences d’amorces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Données de séquençage de l’ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3' des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Ce protocole démontre la construction d’un vecteur d’expression génique long et complexe. Lorsqu’un fragment d’ADN complet ne peut pas être obtenu par une seule PCR à partir d’ADNc, ou que le vecteur d’expression génique complet ne peut pas être obtenu par recombinaison homologue à inserts multiples in vitro, cette méthode est applicable. Actuellement, le clonage par ligature à inserts multiples est utilisé pour obtenir un fragment d’ADN complet à cloner dans un vecteur approprié.Cette méthode permet de réaliser la délétion ou la mutation de gènes cibles et de joindre efficacement un grand nombre de fragments d’ADN au vecteur d’expression.

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virus de la vaccine (VV) a été largement utilisé dans la recherche biomédicale et l'amélioration de la santé humaine. Cet article décrit une méthode simple, très efficace pour modifier le génome de VV en utilisant un système CRISPR-cas9.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est largement utilisé comme une plateforme de vecteur pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires. Cet article décrit une méthode simple et rapide pour la génération de vaccins recombinants HVT-guidé à l’aide d’un NHEJ-CRISPR/Cas9 intégré et système de Cre-Lox.

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.

Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N0)pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).

Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial

Apprenez le clonage sans couture pour construire des vecteurs d'expression complexes du PRRSV par recombinaison homologue. Cette méthode permet d'assembler efficacement plusieurs fragments d'ADN dans le vecteur pVAX1.

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (Vidéo) | JoVE Journal

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

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