Name: AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Découvrez la méthode AQRNA-seq pour quantifier les petits ARN comme les microARN et les ARN de transfert chez Mycobacterium bovis BCG. Cette technique permet une quantification absolue précise des ARN pendant la dormance induite par la famine.

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Les auteurs de ce travail sont reconnaissants envers les auteurs de l’article original décrivant la technologie AQRNA-seq7. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) et de la National Research Foundation de Singapour par le biais de l’Alliance Singapour-MIT pour la recherche et la technologie Antimicrobial Resistance IRG.

Analyse de la dynamique de l’ARNt à l’aide de l’AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. est l’inventeur de deux brevets (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) relatifs à l’œuvre publiée.

Le flux de travail de préparation de la banque AQRNA-seq est conçu pour maximiser la capture d’ARN dans un échantillon et minimiser la chute de polymérase lors de la transcription inverse7. Grâce à une ligature de liaison en deux étapes, de nouveaux oligonucléotides d’ADN (Linker 1 et Linker 2) sont ligaturés en excès pour compléter pleinement l’ARN de l’échantillon. Les agents de liaison en excès peuvent être éliminés efficacement avec RecJf, une exonucléase de 5' à 3' spécifique aux ADN monocaté...

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), également connu sous le nom de séquençage massivement parallèle, est une technologie de séquençage de l’ADN qui implique la fragmentation de l’ADN, la ligature d’oligonucléotides adaptateurs, l’amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l’ADN et le réassemblage des séquences de fragments dans un génome. L’adaptation du NGS à l’ARN séquencé (RNA-seq) est une approche puissante pour identifier et quantifier les transcrits d’ARN et leurs variants1. Des développements innovants dans les flux de travail de préparation de banques d’ARN et les pipelines d’analyse bioinformatique, associés aux progrès de l’instrumentation de laboratoire, ont élargi le répertoire des applications de séquençage de l’ARN, progressant au-delà du séquençage de l’exome vers des omiques fonctionnelles avancées telles que le profilage d’ARN non codant2, l’analyse de cellule unique3, la transcriptomique spatiale 4,5, l’analyse d’épissage alternatif6, entre autres. Ces méthodes avancées de séquençage de l’ARN révèlent des fonctions complexes de l’ARN grâce à l’analyse quantitative du transcriptome dans les cellules et les tissus normaux et malades.
Malgré ces avancées en matière de RNA-seq, plusieurs caractéristiques techniques clés limitent la puissance quantitative de la méthode. Bien que la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN permettent une quantification précise et exacte des changements dans les niveaux d’ARN entre des variables expérimentales (c’est-à-dire des échantillons biologiques et/ou des états physiologiques), elles ne peuvent pas fournir de comparaisons quantitatives des niveaux de molécules d’ARN dans un échantillon. Par exemple, la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN ne peuvent pas quantifier avec précision le nombre relatif de copies de molécules isoaccepteurs d’ARNt individuelles dans un pool cellulaire d’ARNt exprimés. Comme souligné dans la publicationcomplémentaire 7, cette limitation du séquençage de l’ARN découle de plusieurs caractéristiques de la structure de l’ARN et de la biochimie de la préparation des banques. Par exemple, l’activité des enzymes de ligature utilisées pour fixer les liaisons de séquençage aux extrémités 3' et 5' aux molécules d’ARN est fortement influencée par l’identité des nucléotides terminaux de l’ARN et des liaisons de séquençage. Cela conduit à de grandes variations dans l’efficacité des ligatures de liaison et à de profondes augmentations artificielles des lectures de séquençage 8,9,10.
Une deuxième série de limitations découle des propriétés structurelles inhérentes aux molécules d’ARN. Plus précisément, la formation de la structure secondaire de l’ARN et les changements dynamiques dans les dizaines de modifications post-transcriptionnelles de l’ARN de l’épitranscriptome peuvent provoquer une chute ou une mutation de la polymérase au cours de la transcription inverse. Ces erreurs entraînent une synthèse incomplète ou tronquée de l’ADNc ou une séquence d’ARN altérée. Bien que ces deux phénomènes puissent être exploités pour cartographier des structures secondaires ou certaines modifications, ils dégradent la précision quantitative du séquençage de l’ARN si les étapes ultérieures de préparation de la bibliothèque ne parviennent pas à capturer des ADNc tronqués ou si le traitement des données rejette des séquences mutées ne correspondant pas à un ensemble de données de référence11,12. De plus, l’immense diversité chimique, de longueur et structurelle des transcrits d’ARN, ainsi que le manque d’outils pour fragmenter uniformément les ARN longs, diminuent l’applicabilité de la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN à toutes les espèces d’ARN13.
La méthode AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) a été développée pour lever plusieurs de ces contraintes techniques et biologiques qui limitent la précision quantitative7. En minimisant les biais dépendants de la séquence dans la capture, la ligature et l’amplification lors de la préparation de la bibliothèque de séquençage de l’ARN, AQRNA-seq atteint une linéarité supérieure par rapport aux autres méthodes, quantifiant avec précision 75 % d’une bibliothèque de référence de 963 miARN avec une précision 2 fois supérieure. Cette corrélation linéaire du nombre de lectures de séquençage et de l’abondance de l’ARN est également observée dans l’analyse d’un pool de longueurs variables d’étalons d’oligonucléotides d’ARN et en référence à des méthodes orthogonales comme le transfert de Northern. L’établissement de la linéarité entre le nombre de lectures de séquençage et l’abondance de l’ARN permet à l’AQRNA-seq d’obtenir une quantification précise et absolue de toutes les espèces d’ARN au sein d’un échantillon.
Voici une description du protocole pour le flux de travail de préparation de la bibliothèque AQRNA-seq et du pipeline d’analyse de données en aval qui l’accompagne. La méthode a été appliquée pour élucider la dynamique de l’abondance de l’ARNt pendant la dormance induite par la famine et la réanimation ultérieure dans le modèle de tuberculose du modèle de la tuberculose à Bacilles de Calmette et Guérin de Mycobacterium bovis . Les résultats ont été présentés pour la visualisation exploratoire des données de séquençage, ainsi que pour les analyses ultérieures de regroupement et d’expression différentielle qui ont révélé des modèles discernables dans l’abondance de l’ARNt associés à divers phénotypes.

<table><tbody><tr><td>2-cétoglutarate&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Préparez une solution fonctionnelle (1 M) et stockez-la à -20&ordm ; C</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-Triphosphate (ATP)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (composant # : N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM) ; préparer une solution de travail (10 mM) et la stocker à -20&ordm ; C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Stocker à température ambiante</td></tr><tr>Sulfate<td>d’ammonium, de fer(II) hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Préparer une solution de travail (0,25 M) et la conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bioanalyseur de petits ARN</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp ;</td><td>L’analyse des petits ARN est utilisée pour vérifier la qualité des ARN d’entrée et l’efficacité des réactions enzymatiques (par exemple, la ligature Linker 1)</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA ; 10 mg/mL)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Ce produit a été abandonné le 15/12/2022 et est remplacé par de l’albumine recombinante, qualité biologie moléculaire (NEB B9200).</td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>Macron Chimie Fine</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Déméthylase&nbsp ;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>La déméthylase est livrée avec le prétraitement de l’ARNt rtStar Kit de synthèse d’ADNc premier brin (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Mélange de solutions de désoxynucléotide (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (composant # : N0447LVIAL)</td><td>Ce mélange de solutions dNTP contient des concentrations équimolaires de dATP, dCTP, dGTP et dTTP (10 mM chacune)</td></tr><tr><td>Bloc chauffant double numérique</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>Le bloc chauffant est utilisé avec le QIAquick&nbsp ; Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td></tr><tr><td>DyeEx&nbsp ; Kit d’essorage 2.0</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp ;</td><td>Efficace pour éliminer les restes courts (par exemple, les oligos de moins de 10 pb de longueur)</td></tr><tr><td>Alimentation par électrophorèse</td><td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes PCR (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique (éthanol), pur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp ;</td><td>L’éthanol pur est utilisé avec le kit Oligo Clean and Concentrator de Zymo Research</td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Violet (6X), pas de SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (composant # : B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S contient une échelle d’ADN Quick-Load Purple 50 bp et un colorant de chargement de gel, Violet (6X), sans SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>Le spectrophotomètre est utilisé pour mesurer les concentrations d’oligo-éléments à l’aide de la loi de Beer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Préparez une solution de travail (1 M ; pH = 8 avec NaOH) et conservez-la à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)&nbsp ;</td><td>Produits scientifiques VWR</td><td>BDH3028</td><td>Préparez une solution de travail (5 M) et conservez-la à température ambiante</td></tr><tr><td>L’alcool isopropylique (isopropanol), Pure</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>L’isopropanol est utilisé avec le QIAquick&nbsp ; Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Préparez une solution de travail (0,5 M) et conservez-la à -20&ordm ; C</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (composant # : B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L contient RecJf (30 U/&mu ; L) et NEBuffer 2 (10X) ; Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases (non traitée au DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean & Kit de concentrateur&nbsp ;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061° ;</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>PEG 8000 (solution à 50 %)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (composant # : B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM) ; préparer une solution de travail (10 mM) et la stocker à -20&ordm ; C</td></tr><tr><td>Thermocycleur Peltier</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Phénol :choloroforme :isoamyle&nbsp ; alcool 25:24:1 pH = 5,2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tampon PrimeScript (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Transcriptase inverse</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp ; Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Ce kit nécessite un bloc chauffant et de l’isopropanol pour fonctionner avec l’échelle</td></tr><tr><td>d’ADN Quick-Load Purple 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (composant # : N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (composant # : N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S contient une échelle d’ADN Quick-Load Purple 50 bp et un colorant de chargement en gel, violet (6X), sans SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp ; (30 U/&mu ; L)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (composant # : M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L contient RecJf (30 U/&mu ; L) et NEBuffer 2 (10X) ; Conserver à -20 &deg ; </td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase C (souris ; 40 U/&mu ; L)&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0314L&nbsp ;( composant # : M0314LVIAL)</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp ; ADN polymérase&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp ;</td><td>TaKaRa 638509 contient SeqAMP&nbsp ; ADN polymérase&nbsp ; et SeqAMP&nbsp ; Tampon PCR (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp ; Tampon PCR (2X)&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp ;</td><td>TaKaRa 638509 contient SeqAMP&nbsp ; ADN polymérase&nbsp ; et SeqAMP&nbsp ; Tampon PCR (2X)</td></tr><tr><td>Crevette Phosphatase alcaline (1 U/&mu ; L)&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0371L&nbsp ;( composant # : M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; S5881</td><td>Préparer une solution de travail (5 M) et la conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (400 U/&mu ; L)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp ;( composant # : M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L contient de l’ADN ligase T4 (400 U/&mu ; L) et tampon de réaction de l’ADN ligase T4 (10X)</td></tr><tr><td>Tampon de réaction de l’ADN ligase T4 (10X)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp ;( composant # : B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L contient de l’ADN ligase T4 (400 U/&mu ; L) et T4 ADN ligase tampon (10X)</td></tr><tr><td>T4 ARN ligase 1 (30 U/&mu ; L)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (composant # : M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM)</td></tr><tr><td>Tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (composant # : B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq pour la quantification de petits arn

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq fournit une relation linéaire directe entre le nombre de lectures de séquençage et le petit nombre de copies d’ARN dans un échantillon biologique, permettant ainsi une quantification précise du pool de petits ARN. La procédure de préparation de la banque AQRNA-seq décrite ici implique l’utilisation de liaisons de séquençage conçues sur mesure et une étape pour réduire les modifications de l’ARN de méthylation qui bloquent la processivité de la transcription inverse, ce qui entraîne une augmentation du rendement d’ADNc de pleine longueur. En outre, une mise en œuvre détaillée du pipeline bioinformatique qui l’accompagne est présentée. Cette démonstration de l’AQRNA-seq a été réalisée au moyen d’une analyse quantitative des 45 ARNt de Mycobacterium bovis BCG récoltés pendant 5 jours choisis au cours d’une période de 20 jours de privation de nutriments et de 6 jours de réanimation. Les efforts en cours pour améliorer l’efficacité et la rigueur d’AQRNA-seq seront également abordés ici. Il s’agit notamment d’explorer des méthodes permettant d’éviter la purification sur gel afin d’atténuer les problèmes de dimères d’amorce après l’amplification par PCR et d’augmenter la proportion de lectures sur toute la longueur afin de permettre une cartographie de lecture plus précise. Les améliorations futures d’AQRNA-seq seront axées sur la facilitation de l’automatisation et de la mise en œuvre à haut débit de cette technologie pour quantifier toutes les petites espèces d’ARN dans des échantillons de cellules et de tissus provenant de divers organismes.

Mycobacterium bovis La souche 1173P2 du BCG (bacilles de Calmette et Guérin) subissant une croissance exponentielle a été soumise à une série chronologique (0, 4, 10 et 20 jours) de privation en nutriments, suivie d’une réanimation de 6 jours dans un milieu riche en nutriments, comme présenté précédemment dans Hu et al.7. De petits ARN ont été isolés à partir d’une culture bactérienne, avec trois réplicats biologiques, à chacun des cinq points temporels désignés. Les banques Illumina ont ...

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Le séquençage de l’ARNa cartographie quantitativement les petits ARN tels que les microARN, les ARNt et les fragments d’ARNt dans pratiquement n’importe quel échantillon de cellule ou de tissu. Il peut être utilisé pour cartographier certaines des 170 modifications connues de l’ARNt, mais il existe d’autres méthodes plus spécifiques pour la cartographie. Vous pouvez utiliser AQRNA-seq pour découvrir des biomarqueurs de maladies dans le RNome et explorer les mécanismes de traduction des protéines au niveau des systèmes.La plupart des méthodes de séquençage de l’ARN ne peuvent pas quantifier avec précision l’abondance de molécules d’ARN individuelles dans un échantillon. Cela est dû à la fois aux propriétés structurelles de l’ARN, telles que les structures secondaires, les modifications post-transcriptionnelles, ainsi qu’à la biochimie de la préparation des banques telles que les biais de ligature de mille fois induits par les nucléotides terminaux sur les ARN. AQRNA-seq a été développé pour surmonter plusieurs défis techniques et biologiques, limitant la quantification précise de l’abondance de l’ARN dans l’échantillon.Par rapport à d’autres matières, il atteint la linéarité entre l

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Les microARN (miARN) sont une classe de molécules régulatrices largement conservée. Nous décrivons ici une méthode de clonage de miARN qui repose sur deux étapes de ligature puissantes suivies d’un séquençage à haut débit. Notre méthode permet une quantification précise des miARN à l’échelle du génome.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Un protocole permettant de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARNr bactérien 16S des sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. La méthodologie comprend la co-extraction de l’ADN et de l’ARN ; préparation d’ARN libre d’ADN ; et la quantification du gène et du transcrit de l’ARNr 16S par RT-q-PCR, y compris la construction de la courbe standard.

ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel

Nous décrivons une méthode ciblée basée sur le séquençage de l’ARN qui comprend la préparation de banques d’ADNc indexées, l’hybridation et la capture avec des sondes personnalisées et l’analyse de données pour interroger les transcrits sélectionnés pour l’expression génique, les mutations et les fusions de gènes. Le RNAseq ciblé permet une évaluation rapide et rentable des transcrits sélectionnés sur un séquenceur de bureau.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

Ce protocole décrit une méthode de cartographie pré-ARNm ' extrémité 3 sites de traitement.

Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

Ici, nous décrivons une stratégie étape par étape pour isoler les petits ARN, enrichir les microARN et préparer des échantillons pour le séquençage à haut débit. Nous décrivons ensuite comment traiter les lectures de séquences et les aligner sur les microARN, à l'aide d'outils open source.

Un pipeline complet pour isoler et séquencer les microARN et les analyser à l'aide d'outils Open Source

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Présenté ici est un protocole pour la microdésection laser-capture (LCM) des tissus végétaux. LCM est une technique microscopique pour isoler les zones de tissu d’une manière sans contamination. La procédure comprend la fixation des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN. L’ARN est utilisé dans l’analyse spécifique aux tissus en aval et résolue temporellement des transcriptomes.

Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

Ce travail présente une méthode pour quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster en utilisant l'analyse d'image numérique . Cette méthode rationalise les procédures entre l'acquisition du phénotype et l'analyse des données et comprend le montage des échantillons, l'acquisition d'image, l'extraction de la valeur des pixels et la mesure des traits.

Quantifier la pigmentation abdominale dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Découvrez la méthode AQRNA-seq pour quantifier les petits ARN comme les microARN et les ARN de transfert chez Mycobacterium bovis BCG. Cette technique permet une quantification absolue précise des ARN pendant la dormance induite par la famine.

AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

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