Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon
24 mai 2024
Une procédure de plaie perforante pour la formation de thrombus hémostatiques est présentée ici. Les thrombus formés sont grands et ont des centaines de microns de diamètre. Par conséquent, les approches d’imagerie volumique sont appropriées. Nous suggérons la microscopie électronique à transmission à large zone comme approche à haute résolution accessible au plus grand nombre et détaillons un protocole préparatif.
Nous sommes un laboratoire qui fait des EM de volume, des travaux structurels, pour dire comment les plaquettes s’activent, comment s’agrègent-elles ? Comment forment-ils un thrombus qui provoque l’arrêt du saignement et comment, en cas de stimulation excessive, ils provoquent une coagulation occlusive. Ce faisant, le principe est que si nous connaissons la structure, nous pouvons alors mieux cibler les médicaments et obtenir de meilleurs résultats.
Nous utilisons des modèles murins dans nos recherches, comme le font de nombreux chercheurs, et nous avons tous le défi d’établir comment nos découvertes chez la souris et, dans notre cas, dans les artères et les veines de la souris, se répercutent sur les mécanismes des artères et des veines beaucoup plus grandes chez l’homme. Nous espérons tous que les principes sont les mêmes chez les souris et les humains. Si vous prenez notre travail et que vous utilisez des approches EM en volume, les grandes choses auxquelles nous avons contribué sont un, à savoir que les plaquettes ne sont pas seulement des kamikazes.
Ils retiennent les granulés. Ils font des choses en réponse à un signal. Ils ont des états stables, et ces états stables font partie d’un thrombus normal et ils font également partie d’un caillot inclusif.
Deuxièmement, nous avons apporté le sentiment qu’il y a vraiment une structure dans le thrombus qui se forme, ce n’est pas simplement un tas de briques, mais plutôt c’est une structure ordonnée dans laquelle les plaquettes sont ordonnées en fonction de leur activation, et cetera. Et troisièmement, nous avons apporté le sentiment qu’il devrait être possible d’appliquer et de comprendre à partir de la structure ce qui doit être soit stimulé pour obtenir un bon résultat, soit ce qui doit être supprimé pour donner un résultat qui protégera les gens contre les mauvais résultats. Nous collectons des images séquentielles à l’échelle nanométrique de distances millimétriques.
Nous les assemblons dans une seule image montée. Par conséquent, nous pouvons observer n’importe quel point donné de l’image à une échelle de près du nanomètre au millimètre, ce qui est suffisant pour placer des caractéristiques individuelles à l’intérieur de l’ensemble du thrombus. Les chercheurs disposent maintenant d’un outil puissant, et ils peuvent poser la nouvelle question suivante : comment les cascades de coagulation et les signaux cellulaires ou les médicaments agissent-ils spatialement aux niveaux local et global dans les thrombus ?
Aperçu
Cet article présente une procédure de blessure par perforation pour l'étude de la formation de thrombus hémostatiques, en mettant l'accent sur les gros thrombus formés lors de ce processus. L'utilisation de la microscopie électronique en transmission à grand champ par assemblage d'images est proposée comme une méthode d'imagerie à haute résolution pour analyser ces structures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Hémostase
- Formation de thrombus
Contexte
- Comprendre l'activation et l'agrégation des plaquettes est essentiel pour traiter l'arrêt du saignement.
- La recherche vise à établir un lien entre les résultats obtenus sur des modèles murins et les mécanismes vasculaires humains.
- On sait que les plaquettes conservent des granules, ce qui remet en question les notions antérieures sur leur fonction.
- Les approches de microscopie électronique en volume permettent d'obtenir des informations sur la structure des thrombus.
Objectif de l'étude
- Étudier les aspects structuraux de la formation du thrombus.
- Améliorer le ciblage médicamenteux afin d'obtenir de meilleurs résultats cliniques.
- Explorer les similitudes entre les réponses vasculaires murines et humaines.
Méthodes utilisées
- Procédure de blessure par piqûre pour la formation du thrombus.
- Microscopie électronique en volume pour l'imagerie des thrombus.
- Modèles murins pour l'étude du comportement des plaquettes.
- Analyse comparative des résultats chez la souris et l'humain.
Résultats principaux
- Les thrombus formés sont volumineux, mesurant des centaines de microns de diamètre.
- Les plaquettes conservent leurs granules, indiquant un rôle plus complexe dans l'hémostase.
- La microscopie électronique en volume fournit des informations détaillées sur la structure de la formation des thrombus.
- Les résultats appuient l'hypothèse selon laquelle les modèles murins peuvent éclairer les mécanismes vasculaires humains.
Conclusions
- L'étude améliore la compréhension de la structure des thrombus et de la fonction des plaquettes.
- La microscopie électronique en volume est un outil précieux pour l'imagerie à haute résolution en recherche hémostatique.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer les résultats dans les systèmes humains.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La microscopie électronique à grande surface en mosaïque des thrombus induits par une plaie de piqûre permet une résolution structurelle sans précédent des processus hémostatiques, soutenant une détection mécanistique des risques lors de la validation précoce de cibles cardiovasculaires. Cette approche comble le fossé entre les résultats obtenus sur les modèles animaux et la biologie vasculaire humaine, éclairant ainsi les stratégies translationnelles de découverte de médicaments antithrombotiques. La cartographie à haute résolution de l'architecture du thrombus améliore la confiance prédictive dans l'engagement de la cible et l'évaluation des résultats fonctionnels tout au long du processus de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- La cartographie structurelle des thrombus permet de préciser les états d'activation des plaquettes et leur organisation spatiale.
- La microscopie électronique en volume permet une détection mécanistique des risques en distinguant l'hémostase de la thrombose pathologique.
- L'imagerie quantitative soutient la validation fonctionnelle des cibles et la priorisation des candidats antithrombotiques.
Développement de criblage et de tests
- Des protocoles validés de préparation des échantillons garantissent des résultats d'imagerie reproductibles pour les analyses en aval.
- Les jeux de données EM assemblés fournissent des lectures normalisées et quantitatives pour les études comparatives.
- Une imagerie haute résolution facilite une évaluation fiable des effets des composés sur la structure des thrombus.
Recherche translationnelle et préclinique
- Les découvertes issues du modèle murin éclairent la continuité translationnelle en associant des biomarqueurs structuraux à des mécanismes vasculaires humains.
- L'imagerie à résolution spatiale soutient l'avancement ciblé de candidats ajusté au risque, visant la fonction plaquettaire.
- Les données structurales quantitatives permettent des comparaisons interspécifiques pour la validation préclinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'étend de la phase initiale de découverte à la recherche préclinique, en soutenant la vérification des hypothèses, la validation des cibles et l'alignement translationnel dans le développement de médicaments cardiovasculaires.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses de la fonction plaquettaire et de l'architecture du thrombus.
- Essais de criblage : Fournit des images quantitatives reproductibles pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Produit des jeux de données structuraux riches permettant des comparaisons statistiques rigoureuses des conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et assure la continuité des modèles murins à l'application chez l'humain.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme d'imagerie évolutive destinée à un usage répété dans divers programmes de recherche cardiovasculaire.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la découverte ciblant les thrombus.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des échantillons et les flux de travail d'imagerie pour assurer la reproductibilité et la scalabilité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et améliore l'efficacité du capital en clarifiant précocement les risques biologiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et des candidats antithrombotiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie électronique et en biologie vasculaire.
- Exige un accès à des instruments d'imagerie avancés et à un logiciel capable de réaliser des mosaïques.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes des protocoles de préparation des échantillons.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les modèles vasculaires ou les espèces utilisés.
- Le débit d'échantillonnage et la gestion des données peuvent limiter l'extensibilité pour les grandes études.
