Name: Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Apprenez une procédure de plaie perforante pour étudier la formation du thrombus hémostatique chez la souris. Cette méthode combine microscopie électronique à large rayon pour analyser la structure des plaquettes et améliorer le ciblage thérapeutique.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hémostase par ponction et microscopie électronique montagée

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solution saline normale à 0,9 %</td><td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint ensemble veineuses du cuir chevelu</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint Aiguilles hypodermiques</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint Aiguilles hypodermiques spécialisées</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool (alcool isopropylique à 70 %)</td><td>Medline</td><td>MDS090670Z</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante pour animaux</td><td>Physitemp Instruments</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 Couleur R2 Microscopie Caméra</td> Carl <td>Zeiss</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringues Luer-Lok, 20 mL</td><td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire 35 mm x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton</td><td>Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 Activateur</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride dodécényle succinique/ DDSA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pansement, 5", courbe, dentelée, à pointe étroite</td> Pince à pansement <td>Integra Miltex</td><td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>, 5", standard, dentelé</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812</td><td>Microscopie électronique à résine Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique, anhydre 200 proof</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Rack de tubes à 4 voies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Minuterie numérique Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pompe à perfusion à seringue unique</td><td>Fisher Scientific</td><td>7801001</td><td></td></tr><tr><td>Éponges de gaze 2 » x 2 »- 4 plis</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldéhyde (solution à 10 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthésie par inhalation liquide, 100 mL</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine de style bijoutier Pince, Style 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td><td>Besoin de 2 paires.</td></tr><tr><td>Tube de pompe L/S, silicone, L/S 15 ; 25 ft</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de plomb</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green 4</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>18100</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II Tête de pompe</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Entraînement numérique à vitesse variable Masterflex L/S</td><td>VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" Coupe-fil</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium 4 % Solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (solution 16 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp Régulateur</td> <td>de températurePhysitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène, réactif ACS</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Béchers en verre Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de température rectale pour souris</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic Invisible Tape, 3/4 » x 1000"</td><td>3M Company</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de cacodylate de sodium 0,2 m, pH 7,4</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur électronique à faible débit SomnoFlo</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Starter Kit pour souris</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Broches Minutien en acier inoxydable</td><td>Fine Science Outils</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope steREO Discovery.V12</td><td>Microscopie Carl Zeiss</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Élastomère</td><td>de silicone World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>tapis en silicone</td></tr><tr><td>Microscopie électronique à</td><td>acide tannique</td> Sciences <td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Micro Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Von Graefe Pince de pansement pour les yeux, 2.75", incurvée, dentelée</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818</td><td>Besoin de 2 paires.</td></tr><tr><td>Ciseaux Wagner</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura Tondeuse pour animaux</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite Software</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Quantification des effets du médicament sur le temps de saignement de la plaie perforante Les temps de saignement des plaies par perforation fournissent un modèle physiologique d’un risque médicamenteux qui peut être facilement réalisé chez la souris. Les résultats qui découlent d’une expérience de plaie perforante sont prédictifs. Ici, nous montrons une courbe d’hémorragie dose-réponse dabigatran. Le dabigatran, un inhibiteur de la thrombine, est utilisé comme anticoagulant oral à action directe, ce que l’on appelle le DOAC12. Le modèle de plaie par perforation de la veine jugulaire a été utilisé pour évaluer le risque inhérent à différentes doses de dabigatran par le biais d’une hémorragie prolongée potentielle due à la formation retardée de thrombus chez la souris. Une dose variable de 15, 50 ou 150 μg/kg de dabigatran a été administrée par voie intraveineuse (i.v.) 20 minutes avant la ponction de la veine jugulaire. Nous montrons les moyennes du temps de saignement à différentes concentrations de dabigatran (Figure 4). Au niveau de la dose, on observe un allongement significatif du temps de saignement, p &lt;0,051. Cela indique un facteur de risque important dans l’utilisation du médicament chez l’homme. Expérimentalement, le médicament à ces doses a un effet significatif sur l’ultrastructure du thrombus en formation.
Évaluation de l’état d’activation plaquettaire dans la formation d’un thrombus de plaie perforante L’approche WA-TEM fournit à la fois une vue d’ensemble d’une zone de blessure dans un seul plan lorsqu’elle est observée à un grossissement plus faible et beaucoup de détails à un grossissement plus élevé (figure 5). Les détails obtenus peuvent être directement placés dans le contexte de l’aperçu. Nous avons utilisé cette approche pour évaluer le recrutement de plaquettes en forme de discoïde dans un thrombus de plaie perforante en formation. Les plaquettes circulantes sont discoïdes, d’où leur nom, et contiennent un ensemble complet de granules sécrétoires. Une question clé a été de savoir comment les plaquettes circulantes peuvent être recrutées dans le thrombus en croissance sans perturber les propriétés de libre circulation des plaquettes restantes. Nos travaux mettent en évidence une hypothèse Tether and Activate dans laquelle les plaquettes circulantes sont recrutées dans le thrombus, une par une, par un processus d’attache sous forme de plaquettes discoïdes contenant un ensemble complet d’organites2. La preuve de cela provient de WA-TEM de thrombus de la veine jugulaire 1 minute après la ponction. Après la coupe pour obtenir des coupes complètes du thrombus à partir du milieu de la plaie encore saignante, nous avons imagé 500 à 800 images, 4 000 x 4 000 pixels, une taille de pixel de 3,185 nm dans une grille raster XY rectangulaire sur toute la dimension du thrombus en coupe efficace à l’aide d’une platine automatisée et d’un microscope électronique à transmission à l’aide du logiciel SerialEM10. Les cadres ont ensuite été assemblés à l’aide du logiciel eTomo, qui fait partie de la suite de programmes IMOD11. Il en résulte une seule image de taille variable, par exemple, 120 000 pixels sur 90 000 pixels qui est en plein écran à faible zoom, 0,02, ou en détail à zoom élevé, de 0,25 à 1,0 à l’aide du logiciel 3DMOD, qui fait également partie de la suite de programmes IMOD (Figure 5). Dans le net, l’analyse assistée par logiciel a révélé que les plaquettes discoïdes liées en périphérie, associées à des thrombus, dans le trou de ponction étaient espacées comme des perles sur une ficelle. À une courte distance à l’intérieur du thrombus, la forme discoïde était moins distincte et les plaquettes étaient plus étroitement associées les unes aux autres. Plus profondément dans le thrombus, les plaquettes étaient arrondies, serrées et partiellement dégranulées. Une séquence morphologique suggérait la liaison initiale des plaquettes au thrombus par le biais d’une longue molécule d’attache, probablement le facteur de von Willebrand, et que toutes les autres étapes d’activation plaquettaire étaient limitées à l’intérieur du thrombus en formation. Par conséquent, le recrutement plaquettaire dans le thrombus pourrait se produire sans perturber la circulation du sang dans la veine jugulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration chirurgicale pour réaliser une expérience de thrombus de ponction de la veine jugulaire ou de l’artère fémorale. L’équipement chirurgical (A) et les instruments (B) sont soigneusement disposés pour assurer l’efficacité du mouvement, car le timing est critique pendant l’expérience. (C) Après la fixation par perfusion, la partie du vaisseau contenant le thrombus de la plaie perforante est épinglée à un tapis de silicone dans une boîte de culture de 35 mm pendant l’observation au microscope optique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> Figure 2 : Passage d’un vaisseau sanguin à des échantillons intégrés dans du plastique qui seront sectionnés pour WA-TEM ou SBF-SEM. (A) Une artère fémorale avec une plaie perforante et une formation de thrombus extravasculaire en accumulation (cercle et flèche) est représentée. (B) Un thrombus (cercle et flèche) est incrusté dans du plastique pour la coupe pour WA-TEM avec un microtome pour l’imagerie 2D ultérieure. (C) Un thrombus (cercle et flèche) est incrusté dans du plastique, découpé de manière à donner un bâton court, de moins de 1 mm, pour la fixation à une broche à l’intérieur d’une chambre d’imagerie SBF-SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> Figure 3 : Formation d’une plaie perforante à un thrombus : schéma du flux préparatif d’une plaie perforante (A) à une coupe d’image d’un thrombus de la veine jugulaire post-ponction de 1 min (B). La paroi du vaisseau est étiquetée en bleu sur la tranche d’image, les petits points noirs près de la paroi du vaisseau sont des globules rouges et les agrégats de plaquettes du thrombus apparaissent sous forme de zones gris foncé. Ce chiffre a été modifié au lieu de1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> Figure 4 : Exemple de données, sous forme graphique, générées dans une expérience de plaie par perforation de la veine jugulaire. Une courbe d’hémorragie dose-réponse du dabigatran est illustrée. Ce chiffre a été modifié au lieu de1. Les moyennes du temps de purge à différentes concentrations de dabigatran sont indiquées ainsi que des barres d’erreur indiquant un écart type plus ou moins. L’analyse statistique à l’aide du test t de Student a indiqué une valeur p de &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> Figure 5 : Images WA-TEM d’une tranche assemblées pour former un montage. (A) Des images individuelles à haute résolution sont collectées, puis assemblées dans le but de placer les caractéristiques dans un contexte plus large. (B) En zoomant vers le haut, des détails importants peuvent être mis en contexte (poly : leucocyte polymorphonucléaire, endo : endothélium et col : fibres de collagène). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l'enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Cryo Electron Microscope, soit à balayage (MEB) ou de transmission (TEM), sont largement utilisés pour la caractérisation des échantillons biologiques ou d'autres matériaux avec une forte teneur en eau 1. Une SEM / Focused Ion Beam (FIB) est utilisé pour identifier les caractéristiques d'intérêt dans des échantillons et extraire une lame mince, électron-transparent pour le transfert à un cryo-MET.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

L’objectif de ce protocole est de construire un équivalent tridimensionnel de la peau de pleine épaisseur, qui ressemble à une peau naturelle. Grâce à un dispositif de plaie automatisé spécialement conçu, des plaies précises et reproductibles peuvent être générées en cas de maintien de la stérilité.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

Voici une méthode de visualisation de l’ultrastructure de la matrice extracellulaire dans les tissus cardiaques décellularisés.

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Méthodes pour la préparation du volume des échantillons de taille nanolitres pour microscopie électronique à transmission et un instrument est présenté. Aucune étape de papier-buvard est requise, afin d’éviter les conséquences négatives que cela peut avoir pour les protéines, considérablement réduisant la perte de l’échantillon et permettant l’analyse de lysat pour la protéomique visuel unique cellule.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Ici, nous fournissons une description détaillée de la procédure pour induire des biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris et suivre la fermeture de blessure en temps réel. En outre, des méthodes pour la préparation des tissus pour des analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires du lit de blessure sont fournies.

Effectuer des biopsies de pincement guidées par colonoscopique chez la souris et évaluer les changements ultérieurs des tissus

Ce protocole décrit comment générer des blessures excisionnelles bilatérales et pleine épaisseur chez la souris et comment surveiller, récolter et préparer les plaies pour l’analyse morphométrique. On y trouve une description détaillée de la façon d’utiliser les sections histologiques périodiques pour définir, quantifier et détecter avec précision les défauts morphométriques.

Modèle de cicatrisation des plaies excisional murine et analyse histologique des plaies morphométriques

Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.

In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Le présent protocole décrit comment utiliser une lésion médiée par FeCl3 pour induire une thrombose artérielle, et comment collecter et préparer des échantillons de lésions artérielles à différents stades de la thrombose pour l’analyse en microscopie électronique.

Thrombose artérielle induite par le chlorure ferrique et prélèvement d’échantillons pour analyse en microscopie électronique 3D

Apprenez une procédure de plaie perforante pour étudier la formation du thrombus hémostatique chez la souris. Cette méthode combine microscopie électronique à large rayon pour analyser la structure des plaquettes et améliorer le ciblage thérapeutique.

Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

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