Un flux de travail en ligne pour sélectionner des amplificateurs spécifiques à des gènes et des tissus

Nous nous intéressons au décodage du génome non codant pour comprendre comment les gènes sont régulés, pour être exprimés au bon moment et au bon endroit. Nous développons des protocoles conviviaux à l’aide d’outils de génomique basés sur le Web pour rendre les découvertes améliorées accessibles à tous les biologistes. Une large disponibilité de données multimodales qui peuvent aider à affiner l’emplacement des amplificateurs et l’accès facile à ces données via des interfaces Web open source.

Cela permet une identification complète des amplificateurs sans nécessiter d’expertise en programmation de la part des chercheurs. Ce protocole fournit une base pour toute personne sans formation en biologie des amplificateurs pour commencer à naviguer dans des ensembles de données accessibles au public afin de récupérer des amplificateurs pour les gènes d’intérêt. Nous utilisons TBX5, un acteur bien connu de la biologie cardiaque, comme étude de cas.

Notre flux de travail a identifié 21 amplificateurs, qui pourraient faire la lumière sur les mécanismes de développement cardiaque et les cardiopathies congénitales. Nous élargirons notre protocole avec de nouvelles sources de données, y compris la génomique spatiale, tout en développant des outils conviviaux supplémentaires pour les biologistes. Pour commencer, ouvrez le navigateur Ensembl Genome.

Sélectionnez l’assemblage du génome qui correspond à l’espèce et à la version d’intérêt. Entrez le gène d’intérêt dans le champ de recherche et cliquez sur OK.Dans les résultats, cliquez sur l’ID de gène Ensembl approprié.Faites ensuite défiler jusqu’à la section « Résumé » et cliquez sur le lien Région en détail » pour visualiser la région environnante du gène d’intérêt. Maintenant, recherchez les deux gènes qui flanquent le gène d’intérêt à l’aide de la piste Gene Legend.

Ces gènes apparaissent comme des éléments visuels représentant des annotations fusionnées d’Ensembl et de Havana dans les annotations de gènes de base de la piste GENCODE. Déterminez la directionnalité du gène d’intérêt en observant les signes supérieurs ou inférieurs à côté des noms de gènes. Cliquez et faites glisser le curseur sur la région intergénique entre ces gènes, puis cliquez sur Aller à la région" dans la fenêtre contextuelle pour afficher la région sélectionnée.

Personnalisez l’affichage en cliquant sur Ajouter ou Supprimer les pistes en haut du visualiseur de pistes. Utilisez les commandes de zoom et de navigation pour ajuster la vue afin d’améliorer la visualisation de la région. Dans l’onglet Visualiseur d’onglets Région en détail, cliquez sur Configurer cette page' dans la barre latérale.

Dans la barre latérale Configurer l’image de la région, sous Régulation, sélectionnez Activité par cellule ou tissu. Utilisez la barre de recherche de cellules ou de tissus pour trouver et sélectionner les tissus souhaités, ou utilisez l’index alphabétique sous la barre. Cliquez sur l’onglet « Expériences » à côté de l’option « Cellule ou Tissu ».

Choisissez H3K4me1 et H3K27ac comme marqueur pour les amplificateurs et H3K4me3 comme marqueur pour les promoteurs, puis cliquez sur Configurer l’affichage des pistes. Ensuite, sélectionnez Afficher les traces" pour visualiser les régions marquées par H3K4me1 dans la région de détection de l’amplificateur et les régions marquées par H3K4me3 en amont du gène d’intérêt. Cliquez sur les éléments visuels ou de boîte colorés dans la piste H3K4me1 pour récupérer les coordonnées génomiques des régions marquées dans la zone de détection définie.

Cela ouvre la fenêtre contextuelle Hists and Pols, qui affiche l’emplacement génomique de l’élément en paires de bases. Vous pouvez également définir manuellement les régions d’intérêt pour chaque caractéristique génomique en cliquant et en faisant glisser sur la piste pour entourer les pics graphiques sous les pistes H3K4me1 ou H3K27ac. Copiez ensuite les coordonnées de l’emplacement génomique dans un fichier texte et enregistrez le fichier au format BED.

Accédez au portail de données 4DN. Sur la page d’accueil, assurez-vous que l’option « Ensembles d’expériences » est sélectionnée comme axe Y de la barre empilée principale, que « Type d’expérience » est sélectionné comme axe des X et que le graphique est regroupé par organisme. Localisez la barre In Situ Hi-C le long de l’axe X et cliquez sur la partie représentant les ensembles d’expériences humaines.

Dans la popup, cliquez sur le bouton « Parcourir » et sélectionnez « myoblastes du muscle cardiaque » et notre gène d’intérêt, TBX5, associé à l’organogenèse cardiaque. Cliquez sur le lien dans la colonne « Titre » de l’échantillon biologique correspondant au tissu d’intérêt. Ensuite, dans l’onglet « Fichiers traités », cliquez sur Explorer les données » pour examiner plus en détail l’ensemble de données Hi-C.

Entrez les coordonnées du promoteur identifié dans le tissu d’intérêt et faites un clic droit sur la carte thermique pour marquer la région horizontalement. Ces lignes permettent de suivre visuellement la région du promoteur sur la carte thermique. Si nécessaire, ajustez la vue en la faisant glisser verticalement jusqu’à ce que les limites supérieure et inférieure des coordonnées Y de la barre de recherche s’alignent sur les limites de la région d’intérêt.

Pour supprimer les lignes indésirables, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la ligne et sélectionnez Horizontal ou Règle verticale, puis cliquez sur Fermer la série. Entrez les coordonnées de tous les amplificateurs de contrôle validés expérimentalement pour calculer le seuil d’interaction en fonction de leurs valeurs d’interaction minimales. Affichez les trois amplificateurs de contrôle de la littérature à côté de la région promotrice d’Ensembl à l’aide de la vue pré-préparée.

Définissez ensuite le seuil d’amplification du promoteur à l’aide de ces amplificateurs de contrôle en sélectionnant le score d’interaction non nul le plus bas, comme indiqué par la clé de couleur sur le côté droit de la matrice de la carte thermique. Entrez les coordonnées génomiques de toutes les régions d’amplification associées à H3K4me1 et marquez verticalement sur la carte thermique Hi-C. Filtrez les régions qui interagissent faiblement en comparant les scores d’interaction des régions marquées H3K4me3 au seuil d’interaction.

Sélectionnez les coordonnées génomiques montrant les fréquences d’interaction au-dessus de ce seuil, qui apparaissent sous forme de signaux plus concentrés ou plus sombres sur la carte thermique, et enregistrez-les au format BED. Trois des quatre amplificateurs cardiaques identifiés dans le navigateur d’amplificateurs cardiaques VISTA, HS2329, mm1282 et mm370, chevauchaient des régions prédites par le protocole de détection des amplificateurs basés sur le Web. Enhancer Deux chevauchaient à la fois une région prédite par le protocole de détection de l’enhancer et un enhancer validé expérimentalement.

Enhancer 16 a montré un chevauchement avec les régions d’amplification prédites et les données expérimentales antérieures. Enhancer Nine n’a pas chevauché les amplificateurs prévus du pipeline, mais a montré un enrichissement partiel du signal H3K4me1.