Name: Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Découvrez le test de décalage thermique pour étudier la liaison des ligands à la sélénoprotéine O. Cette méthode fluorescence haut débit mesure la stabilité thermique et identifie les conditions de cristallographie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Tests de décalage thermique à haut débit pour les interactions protéine-ligand

<ol><li>Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genes%3A+Time+to+follow+the+roads+less+traveled%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Human genes: Time to follow the roads less traveled.</a> PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).</li>
<li>Kustatscher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+invitation+to+the+understudied+proteins+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An open invitation to the understudied proteins initiative.</a> Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).</li>
<li>Jones, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+genomics+consortium%3A+A+knowledge+platform+for+drug+discovery%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Rand+Health+Q%22%5BJournal%5D)">The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary.</a> Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).</li>
<li>Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efi-est%2C+efi-gnt%2C+and+efi-cgfp%3A+Enzyme+function+initiative+%28efi%29+web+resource+for+genomic+enzymology+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools.</a> J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).</li>
<li>Pace, C. N., Mcgrath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stabilization+of+lysozyme+to+thermal+and+guanidine+hydrochloride+denaturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.</a> J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Huynh, K., Partch, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+stability+and+ligand+interactions+by+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.</a> Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformationally+responsive+dyes+enable+protein-adaptive+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+performing+and+optimizing+differential+scanning+fluorimetry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).</li>
<li>Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+applications+of+differential+scanning+fluorimetry+in+early-stage+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery.</a> Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).</li>
<li>Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+fluorescent+dyes+as+tools+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.</a> Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).</li>
<li>Lucet, I. S., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ligand+binding+to+pseudokinases+using+a+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay.</a> Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+methodology+to+subclassify+pseudokinases+based+on+their+nucleotide-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties.</a> Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).</li>
<li>Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+analysis+of+thermofluor+data+can+readily+provide+quantitative+binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities.</a> Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).</li>
<li>Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-ligand+interactions+using+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry.</a> J Vis Exp. (91), e51809(2014).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).</li>
<li>Taujale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatic+challenges+and+advances+in+illuminating+the+druggable+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome.</a> Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).</li>
<li>Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+for+broke%3A+Targeting+the+human+cancer+pseudokinome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome.</a> Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).</li>
<li>Kung, J. E., Jura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+pharmacological+targeting+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).</li>
<li>Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+kinase-like+domain+in+a+selenoprotein%2C+widespread+in+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life.</a> PLoS One. 7 (2), e32138(2012).</li>
<li>Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+selenoprotein+o%3A+A+redox-active+mitochondrial+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein.</a> PLoS One. 9 (4), e95518(2014).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+ampylation+by+an+evolutionarily+conserved+pseudokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase.</a> Cell. 175 (3), 809-821 (2018).</li>
<li>Frese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alarmone+diadenosine+tetraphosphate+as+a+cosubstrate+for+protein+ampylation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).</li>
<li>Mostert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronucleotide+probes+reveal+a+diverging+specificity+for+ampylation+vs+umpylation+of+human+and+bacterial+nucleotide+transferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases.</a> Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ydiu+domain+modulates+bacterial+stress+signaling+through+Mn2%2B-dependent+umpylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation.</a> Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).</li>
<li>Mukherjee, M., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selenoprotein+o+substrates+using+a+biotinylated+atp+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog.</a> Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).</li>
<li>Kroeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edta+aggregates+induce+sypro+orange-based+fluorescence+in+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay.</a> PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).</li>
<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
<li>Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dsfworld%3A+A+flexible+and+precise+tool+to+analyze+differential+scanning+fluorimetry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data.</a> Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).</li>
<li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+thermofluor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).</li>
<li>Ribeiro, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+pseudoenzyme+classification%2C+evolution%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling.</a> Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).</li>
<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td><td>utilisé pour des résultats représentatifs mais non requis pour fonctionner TSA</td></tr><tr><td>Avanti J-15R avec ensemble de support de microplaques</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 Système de PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, paroi mince, à jupe, transparente/blanche</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>utilisé pour des résultats représentatifs mais non requis pour les performances TSA</td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse (II) tétrahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>utilisé pour des résultats représentatifs mais non requis pour les performances TSA</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhésif, optique</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel colorant</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&prime ;-triphosphate trisodium sel hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6625-100MG</td><td>utilisé pour des résultats représentatifs mais non requis pour effectuer le TSA</td></tr></tbody></table>

utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine o

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

SelO eucaryote se compose d’une séquence de ciblage mitochondrial N-terminal, d’un domaine de type kinase et d’une sélénocystéine hautement conservée à l’extrémité C-terminale de la protéine23. Cette enzyme mitochondriale code pour un domaine pseudokinase qui est conservé des bactéries à l’homme23. L’analyse structurale de l’homologue SelO de Pseudomonas syringae a révélé des altérations des acides aminés dans le site actif qui facilitent la liaison de l’ATP dans une orientation inversée par rapport aux kinases canoniques25. En conséquence, SelO catalyse l’amplylation, plutôt que la phosphorylation, de plusieurs protéines impliquées dans la signalisation antioxydante pour protéger les cellules contre les dommages oxydatifs et la mort cellulaire25. En plus de l’AMPylation, il a été démontré que certaines AMPylases procaryotes et eucaryotes catalysent l’UMPylation27,28.
Nous avons utilisé E . coli recombinant purifié SelO dans la TSA pour examiner la liaison des nucléotides ATP et UTP à SelO en présence de cations divalents. Semblable aux kinases canoniques, SelO héberge le motif DFG dans lequel l’aspartate se lie à l’ion métallique pour coordonner le nucléotide dans le site actif. Tout d’abord, nous avons optimisé la concentration de protéines et de colorants pour des mesures de fluorescence robustes dans la TSA, en déterminant que 5 μM à 10 μM E. coli SelO étaient optimaux avec 5x SYPRO Orange (Figure 2). De plus, nous avons montré que les témoins sans protéine, ainsi que les contrôles sans colorant, avaient un signal de faible fluorescence qui ne répondait pas à l’augmentation de la température. Nous avons détecté des augmentations d’environ +4 °C et +12 °C de la stabilité thermique d’E. coli SelO en présence d’ATP-Mg2+ et d’ATP-Mn2+, respectivement (Figure 3). Cependant, nous n’avons pas observé de changement de stabilité thermique lors de l’incubation avec UTP, ce qui indique que E. coli SelO peut ne pas présenter de liaison détectable à UTP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg"> Figure 1 : configuration du thermocycleur Un exemple du programme de thermocycleur utilisé pour augmenter la température de l’échantillon de +0,5 °C/min tout en mesurant la fluorescence SYPRO Orange à l’aide du canal FRET. La recommandation comprend également une incubation à température ambiante au début et à la fin du protocole. Abréviation : FRET = Transfert d’énergie de résonance de Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation des concentrations en protéines et en colorants. (A) Résultats représentatifs de l’optimisation de la concentration du colorant SYPRO Orange à l’aide de 5 μM d’Escherichia coli SelO. (B) Résultats représentatifs de l’optimisation de la concentration d’E. coli SelO à l’aide du colorant orange SYPRO 5x. La courbe de dénaturation thermique représente les unités de fluorescence relatives (axe y) par rapport à la température (axe x). Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg"> Figure 3 : Courbes de dénaturation thermique et analyses ΔTm de SelO en présence de cations nucléotidiques et divalents. (A) Données brutes des courbes de dénaturation thermique des échantillons (5 μM d’Escherichia coli SelO en présence de 200 μM d’ATP ou UTP et de cations divalents 2 mM, 5x SYPRO Orange) exportées de la machine RT-PCR et tracées. SelO ATP-Mg représente les échantillons avec SelO, ATP et MgCl2, SelO ATP-Mn représente les échantillons avec SelO, ATP et MnCl2, SelO UTP-Mg représente les échantillons avec SelO, UTP et MgCl2, SelO UTP-Mn représente les échantillons avec SelO, UTP et MnCl2. Notez que les témoins sans colorant et sans protéine présentent une faible fluorescence. Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). (B) Courbes de dénaturation thermique tracées à l’intensité la plus élevée et ajustées à l’équation sigmoïdale de Boltzmann. Bien que la dénaturation thermique de SelO n’ait pas été affectée par l’UTP, nous avons observé un changement marqué de la dénaturation thermique en présence d’ATP (courbes violettes). Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). (C) Histogramme illustrant les valeurs de Tm dérivées de l’ajustement sigmoïdal de Boltzmann des données représentées à la figure 3B. Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogramme illustrant la variation de la température de fusion ΔTm (Tm additif - Tm tampon). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire S1 : Exemples de données pour la TSA de SelO en présence de métaux et de nucléotides. Tableur des données brutes exportées à partir de l’appareil RT-PCR et des données traitées pour supprimer les valeurs après l’intensité maximale de la RFU, comme décrit dans les étapes de protocole 5.1 et 5.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

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In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

Ce protocole présente une technique pour sonder les interactions protéine-protéine à l’aide de perles de donneur liées au glutathion avec des co-chaperons à motif TPR fusionnés GST et des perles accepteurs couplées à un peptide dérivé de Hsp90. Nous avons utilisé cette technique pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.

Études des interactions chaperonne-cochapéroé à l’aide d’un essai homogène à base de billes

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à un test de décalage thermique cellulaire pour prédire et valider l’interaction entre les petites molécules et les cibles protéiques.

Prédiction et validation de cibles protéiques de composés à petites molécules

Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.

Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Ici, nous introduisons un protocole pour l’utilisation de substrats affichés à la surface de levure pour des tests de modification enzymatique. La plateforme a été démontrée en utilisant l’analyse de l’activité de déphosphorylation de la tyrosine phosphatase SHP-2 contre l’un de ses substrats en tant que test de modification enzymatique représentatif.

Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Découvrez le test de décalage thermique pour étudier la liaison des ligands à la sélénoprotéine O. Cette méthode fluorescence haut débit mesure la stabilité thermique et identifie les conditions de cristallographie.

Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

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