Détermination des interactions protéine-ligand à l'aide différentielle à balayage Fluorimétrie

L’objectif global de cette procédure est d’estimer la constante de dissociation pour l’interaction d’un ligand protéique. Pour ce faire, on prépare d’abord des mélanges de protéines avec différentes concentrations du ligand ainsi qu’un colorant indicateur. La deuxième étape consiste à chauffer ces échantillons tout en enregistrant la fluorescence de l’indicateur pour suivre le déroulement de la protéine.

Ensuite, les courbes de dépliage des protéines sont converties en une série de températures de fusion. La dernière étape consiste à ajuster ces données à un modèle approprié pour estimer la constante de dissociation. En fin de compte, la fluorométrie différentielle à balayage est utilisée pour mieux comprendre l’interaction d’une protéine avec ses ligands.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’isotherme, le titrage, la calorimétrie et la résonance plasma de surface est qu’elle peut être réalisée en quelques heures en utilisant uniquement des quantités modérées d’échantillon dans un instrument déjà disponible dans la plupart des instituts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chimie des protéines, telles que l’affinité des ligands pour les protéines et la force relative des interactions. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode éprouvent des difficultés, car le choix des échantillons à utiliser et l’analyse des données peuvent être difficiles.

Avant de commencer cette procédure, préparez les solutions suivantes. Un mélange contenant les réactifs détaillés dans ce tableau et les stocks du ligand d’intérêt à la plus haute concentration disponible, ainsi que six dilutions décuplées de cette concentration. Si l’on connaît une constante de dissociation approximative à partir de données antérieures, préparer au moins deux concentrations au-dessus et au-dessous du kd.

Un exemple de tableau est présenté ici. Aliquote 18 microlitres du mélange dans chacun des huit puits. Dans la plaque A-Q-P-C-R, ajoutez deux microlitres de solvant dans le premier puits de chacun des sept puits restants, ajoutez deux microlitres de chaque membre de la série de dilution du ligand.

Placez le joint A-Q-P-C-R sur la plaque pour obtenir une bonne étanchéité de la plaque. Placez un applicateur à main au milieu de la plaque, lissez le joint d’un côté, puis répétez l’opération sur l’autre moitié de la plaque. Centrifugez la plaque à 500 fois G pendant deux minutes pour éliminer les bulles d’air.

Ensuite, placez la plaque dans un instrument QPCR de première étape. Sélectionnez l’option de courbe de fusion, les filtres de roches et choisissez la vitesse de rampe rapide. Effectuer une dénaturation thermique à la fin de l’analyse de l’instrument.

Cliquez sur le bouton d’analyse à l’écran. Enregistrez le fichier de résultat. Ouvrez le logiciel de décalage thermique des protéines.

Créez une nouvelle étude dans l’onglet des propriétés, donnez-lui un nom, et dans l’onglet des conditions, détaillez les ligands. Accédez à l’onglet Fichiers d’expérience et importez le fichier de résultats enregistré.

Définissez le contenu de chacun. Eh bien, passez à l’onglet d’analyse et appuyez sur le bouton d’analyse pour analyser les résultats. Vérifiez que la protéine en présence de solvant seul donne un résultat similaire à celui montré sur cette figure.

Ensuite, examinez les températures de fusion observées dans les résultats de la douleur répliquée. Assurez-vous que cela montre une nette augmentation de la température de fusion avec l’augmentation de la concentration de ligand. Ces données seront utilisées pour fournir une valeur approximative de la constante de dissociation, comme décrit dans l’article d’accompagnement.

Ces solutions sont nécessaires à la procédure de détermination de la constante de dissociation, d’un mélange maître tel que détaillé dans ce tableau et de stocks du ligand à 15 concentrations différentes, qui seront dilués dix fois. Dans l’expérience finale. Idéalement, incluez les concentrations de ligands, d’au moins deux ordres de grandeur au-dessus et en dessous du kd estimé, et centrez les concentrations sur le kd estimé.

Un exemple de série de dilution est présenté ici. Concentrez-vous sur sept des points dans un ordre de grandeur du KD estimé avec quatre autres points de chaque côté de celui-ci. S’il y a un choix, incluez plus de points aux valeurs qui saturent.

Ajoutez 120 microlitres du mélange principal à chacun des huit puits dans une plaque à 96 puits à fond en U pour servir de réservoir pour une distribution pratique du mélange principal. Ensuite, à l’aide d’une pipette à huit canaux, versez 18 microlitres du mélange principal dans une colonne d’une plaque PCR. Répétez l’opération pour cinq autres colonnes pour obtenir un total de 48 puits remplis selon un motif de six par huit sur la plaque.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tiges de ligand ou de solvant dans chacun des huit puits. Dans une autre plaque à fond en U de 96 puits, à l’aide d’une pipette à huit canaux, aspirez deux microlitres de huit ligands ou solvants différents, et ajoutez-les à une colonne de la plaque PCR qui a été remplie avec le mélange maître. Répétez l’opération avec les huit mêmes ligands ou solvants.

Pour deux autres colonnes, aspirez deux microlitres des huit ligands ou solvants restants, et ajoutez-les à une quatrième colonne de la plaque. Répétez cette opération pour deux autres colonnes. Cela donnera des échantillons en trois exemplaires pour les 16 échantillons de ligands et de solvants.

Placez le sceau A-Q-P-C-R sur la plaque. Centrifugez la plaque à 500 fois G pendant deux minutes. Placez la plaque dans l’instrument QPCR et effectuez une dénaturation thermique en utilisant les paramètres spécifiés précédemment à la fin de l’analyse.

Cliquez sur le bouton d’analyse à l’écran. Enregistrez le fichier de résultat. Ouvrez le logiciel de décalage thermique des protéines.

Créez une nouvelle étude dans l’onglet des propriétés, donnez-lui un nom et dans l’onglet des conditions, détaillez les ligands. Accédez à l’onglet Fichiers d’expérience, importez le fichier de résultats enregistré et définissez le contenu de chacun.

Eh bien, passez à l’onglet d’analyse et appuyez sur le bouton d’analyse. Choisissez l’onglet Répliques dans le menu situé à gauche de l’écran pour afficher les résultats. Comme des triplés.

Évaluez la fiabilité des données en fonction de l’étanchéité des triplets. Les triplets doivent présenter une faible reproductibilité. Examinez attentivement les données brutes.

Analysez les données à l’aide de la méthode boltman ou de la méthode dérivée. Pour évaluer la température de fusion, sélectionnez l’onglet Résultats de réplication et, dans le graphique des résultats de réplication, basculez le graphique par bouton entre tm, boltzmann et dérivée TM. Sélectionnez la méthode qui donne la plus grande reproductibilité de l’échantillon.

Pour les échantillons qui présentent plusieurs transitions, il est presque toujours préférable d’utiliser la méthode dérivée en mode de fusion multiple. Exportez les résultats pour une enquête plus approfondie avec Excel à l’aide de l’onglet d’exportation. Commencez cette analyse en créant un tableau dans Excel des concentrations de ligands et de la température de fusion.

Ouvrez le logiciel GraphPad prism et créez une table XY. Entrez les données à l’aide de la colonne X pour les concentrations de ligands et de la colonne Y pour les résultats de température de fusion. Dans l’onglet analyse, sélectionnez l’option d’ajustement de la courbe de régression non linéaire.

Pour entrer le modèle correct, sélectionnez nouveau et créez une nouvelle équation. Insérez l’équation appropriée en tant que liaison de ligand à site unique. Sélectionnez la case Règles pour les valeurs initiales et entrez les règles pour les valeurs initiales.

Contraindre le paramètre P comme constant égal à entrer dans la concentration finale de protéines. Sélectionnez Analyser pour effectuer l’analyse, Analyse supplémentaire pour ajuster les données à un modèle coopératif ou Ajuster les données aux courbes. L’affichage de décalages binaires de la température de fusion est décrit dans le texte du protocole qui l’accompagne.

Cette méthode a été utilisée pour mesurer l’interaction de l’hexokinase avec le glucose. Un premier dépistage suggère une KD probable de 0,2 à 1,7 millimolaire. Les résultats d’un écran plus grand montrent un bon ajustement au modèle pour un seul événement de liaison avec un KD de 1,2 plus ou moins 0,1 millimolaire, le putatif HETO SQUA L transférase WCBM montre un fort décalage thermique lors de la liaison au GTP.

Un premier dépistage a suggéré un KD de 200 à 500 micromolaires. Une expérience détaillée suggère un KD apparent de 120 plus ou moins 20 micromolaires. Cependant, lorsqu’une échelle logarithmique est utilisée pour l’axe des X, il existe un écart significatif entre le modèle et l’analyse des données des mêmes données avec un modèle coopératif montre un excellent ajustement aux données, ce qui implique que WCBM est anti-coopératif dans sa liaison à GTPA, un résultat assez inhabituel est observé avec le PIB putatif 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.

En l’absence de ligand, et à des concentrations élevées de ligand, on observe un simple schéma de fusion monophasique. Cependant, à des concentrations intermédiaires de ligands, deux pics de fusion distincts sont observés. La transition entre les deux ensembles de pics dépend de la dose sur toute la gamme de concentrations modélisant la fusion biphasique.

En tant que somme d’une proportion du ligand, les résultats de ligand libre et élevé donnent un bon ajustement aux données. Cet ajustement est amélioré en extrapolant le résultat observé pour une concentration élevée de ligands à l’occupation complète. Les données obtenues pour la proportion de WCBI liée au ligand montrent un excellent ajustement à un modèle de liaison simple.

Avec un KD de 58 plus ou moins deux micromolaires Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre ou cinq heures, y compris les répétitions si elle est effectuée correctement Suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que la fluorescence veineuse tiptop et la titration calorimétrique isotherme peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la dépendance à la température et la géométrie STA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer une estimation de la constante de dissociation d’une interaction à l’aide de la grippe à balayage différentiel.