Name: Détermination des interactions protéine-ligand à laide différentielle à balayage Fluorimétrie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Apprenez à estimer la constante de dissociation des interactions protéine-ligand par fluorimétrie différentielle à balayage. Cette méthode rapide et accessible permet d'analyser l'affinité des ligands pour les protéines en quelques heures seulement.

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Ce travail a été financé par une subvention du BBSRC (numéro de subvention BB/H019685/1 et BB/E527663/1) à l’Université d’Exeter.

1 Détermination d&#39;une valeur approximative de la constante de dissociation (c&#39;est à dire, à moins d&#39;un ordre de grandeur) <ol><li> Préparer le mélange indiqué dans le tableau 1. </li><li> Préparer les stocks du ligand d&#39;intérêt à la concentration la plus élevée disponible, puis à six dix dilutions de cette. Si un K d approximatif est connu d&#39;après les données antérieures, visent à avoir au moins deux concentrations au-dessus et au-dessous de la valeur de Kd. </li><li> Aliquote de 18 ul du mélange dans huit puits dans une plaque qPCR. Ajouter 2 ul de solvant dans le premier puits. Ajouter 2 ul de chaque membre de la série ligand de dilution (étape 1.2) à un puits de chacune des sept autres puits. </li><li> Placez un joint qPCR sur la plaque. Pour obtenir une bonne étanchéité de la plaque, placer un applicateur à main (voir les tableaux de réactifs spécifiques) dans le milieu de la plaque. Lisser le joint d&#39;un côté, puis répétez de l&#39;autre moitié dela plaque. </li><li> Centrifuger la plaque à 500 g pendant deux minutes pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Placer la plaque dans un instrument StepOne qPCR. Sélectionnez l&#39;option &quot;courbe en fusion&quot;, les filtres de ROX, et choisir la vitesse de rampe rapide (cela donne une pause de 2 min à 25 ° C, suivie d&#39;une rampe à 99 ° C pendant 40 min, puis 2 min de pause). Exécutez une dénaturation thermique. REMARQUE: Les fichiers de script pour effectuer une course sont disponibles en ligne à l&#39;adresse http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> À la fin de la course de l&#39;instrument, cliquez sur le bouton &quot;Analyser&quot; sur l&#39;écran. Enregistrez le fichier de résultat. </li><li> Ouvrez le logiciel Shift thermique des protéines. <ol><li> Créer une nouvelle étude; dans l&#39;onglet Propriétés, donner ce nom, et dans l&#39;onglet Conditions, détail des ligands. </li><li> Allez sur l&#39;onglet Fichiers de l&#39;expérience, et importer le fichier enregistré des résultats (des XXX.eds), et définir le contenu de chaque puits (modèle files sont disponibles auprès des auteurs). </li><li> Allez sur l&#39;onglet d&#39;analyse, et appuyez sur le bouton &quot;Analyser&quot;. NOTE: Ce rapport analysera les résultats. Il est possible d&#39;exporter les résultats pour complément d&#39;enquête avec Excel en utilisant l&#39;onglet Exporter. Les résultats sont exportés dans un format délimité onglet. Il est préférable d&#39;ouvrir le fichier exporté dans Excel, et immédiatement enregistrer au format Excel. </li></ol></li><li> Vérifier que la protéine en présence du solvant seul donne un résultat similaire à celui représenté sur la figure 1A. Ensuite, examinez les températures de fusion observés dans les résultats dans le volet &quot;répliqué&quot;. Assurez-vous que cela montre une nette augmentation de la température de fusion avec l&#39;augmentation de la concentration de ligand. REMARQUE: Idéalement, ce sera de fournir une température maximale de fusion clair (en supposant que la protéine est entièrement ligand lié), et un K approximative d où la température de fusion est à mi-chemin entre la protéine et ligand libre-au maximum. </li></ol> 2. expérimental pour la détermination de la constante de dissociation <ol><li> Préparer le mélange détaillées au tableau 2 comme un mélange maître. </li><li> Préparation des stocks de ligand à quinze concentrations différentes, qui sera dilué dix fois dans l&#39;expérience finale. Idéalement, inclure des concentrations d&#39;au moins deux ordres de grandeur au-dessus et au-dessous de la valeur de Kd d&#39;environ, et les concentrations centrer sur la valeur de Kd d&#39;environ. Focus sur sept des points à l&#39;intérieur d&#39;un ordre de grandeur de la valeur de Kd d&#39;environ, avec quatre points de part et d&#39;autre de cette; si il ya un choix, inclure plus de points à des valeurs qui saturent. REMARQUE: Si nécessaire, il est possible de modifier les conditions expérimentales telles que les stocks de ligands sont au double de la concentration expérimentale, où ligand solubilité est un facteur limitant. </li><li> Ajouter 120 ul du maîtremélanger à huit puits dans une plaque de puits à fond en U 96, à agir comme un réservoir pour une distribution commode du mélange maître. Utiliser une pipette à 8 canaux pour distribuer 18 pi dans une colonne d&#39;une plaque de PCR. Répétez l&#39;opération pour une période de cinq colonnes, pour donner un total de 48 puits remplis dans un modèle 6 x 8 sur la plaque. </li><li> Ajouter 20 ul de stocks de ligand, ou le solvant, pour séparer les puits dans une plaque de puits à fond en U 96. En utilisant une pipette à 8 canaux, aspirer 2 pi de huit stocks de ligands différents (ou solvant). Ajouter à une colonne de la plaque de PCR qui a été rempli de mélange maître à l&#39;étape 2.3. Répéter l&#39;opération avec les mêmes huit ligand / stocks de solvants pour deux autres colonnes. Aspirer 2 pi de huit ligands ou de solvants stocks restants et les ajouter à une quatrième colonne de la plaque. Répétez cette opération pour les deux autres colonnes. Cela donnera des échantillons en triple pour les 16 ligand et des échantillons de solvants. </li><li> Placer un joint qPCR sur la plaque (voir l&#39;étape 1.4). </li><li> Centrifuger la plaque à 500 g pourdeux minutes. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument qPCR. Exécutez une dénaturation thermique en utilisant les paramètres spécifiés à l&#39;étape 1.6. </li><li> À la fin de la course de l&#39;instrument, cliquez sur le bouton &quot;Analyser&quot; sur l&#39;écran. Enregistrez le fichier de résultat. </li><li> Ouvrez le logiciel Shift thermique des protéines. Créer une nouvelle étude; dans l&#39;onglet Propriétés, donner ce nom, et dans l&#39;onglet Conditions, détail des ligands. </li><li> Allez sur l&#39;onglet Fichiers de l&#39;expérience, et importer le fichier enregistré des résultats (des XXX.eds), et définir le contenu de chaque puits. REMARQUE: Les fichiers de modèles sont disponibles en ligne à l&#39;adresse http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Allez sur l&#39;onglet d&#39;analyse, et appuyez sur le bouton &quot;Analyser&quot;. <ol><li> Choisissez l&#39;onglet &quot;répliques&quot; dans le menu sur le côté gauche de l&#39;écran pour afficher les résultats sous forme de triple. Évaluer la fiabilité des données sur la base de serrage des trois exemplaires sont. Should triplicats montrent une faible reproductibilité, examiner de près les données brutes. </li><li> Analyser les données en utilisant à la fois la Boltzmann ou méthodes dérivés pour évaluer la température de fusion. Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Répliquer les résultats&quot;, et dans le &quot;Répliquer résultats complot&quot;, basculer le «complot par:&quot; touche entre «Tm - Boltzmann» et «Tm - dérivé&quot;. Sélectionnez la méthode qui donne la plus grande reproductibilité de l&#39;échantillon. Exporter les résultats pour complément d&#39;enquête avec Excel en utilisant l&#39;onglet Exporter. NOTE: Pour les échantillons qui montrent des transitions multiples, il est presque toujours préférable d&#39;utiliser la méthode de la dérivée en mode de fusion multiple. Les résultats sont exportés dans un format délimité onglet. Il est préférable d&#39;ouvrir le fichier exporté dans Excel, et immédiatement enregistrer au format Excel. </li><li> Recommencer l&#39;expérience au moins deux fois, y compris un motif sur un autre jour, pour assurer la reproductibilité des résultats. Si l&#39;analyse des données (voir l&#39;étape 3 ci-dessous)indiquent que la valeur de K d est significativement différente de l&#39;estimation initiale, de modifier les concentrations de ligand en conséquence (voir l&#39;étape 2.2) pour assurer une bonne gamme de valeurs autour de K d. </li></ol> 3 Analyse des données pour déterminer la constante de dissociation sous dénaturation thermique <ol><li> Insérer un tableau Excel dans des concentrations de ligand et de la température de fusion. </li><li> Ouvrez le logiciel GraphPad Prism, et de créer une table XY. Entrez les données, en utilisant la colonne de X pour les concentrations de ligand et la colonne Y pour la fusion des résultats de température. REMARQUE: un exemple montré est la figure 1B. Un script avec des équations préchargées, et d&#39;autres instructions pour l&#39;utilisation du logiciel de statistiques SPSS, sont disponibles en ligne à l&#39;adresse http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Dans l&#39;onglet Analyse, sélectionnez l&#39;option de modifier le paramètre d&#39;analyses (Ctrl + T). Pour entrer dans le modèle correct, sélectionnez &quot;Nouveau&quot; et &quot;Créer une nouvelle équation&quot;. Insérez l&#39;équation détaillé dans le tableau 3 comme «site de liaison ligand unique&quot;. REMARQUE: Un exemple de ces étapes est illustrée à la figure 1C. Lorsque vous utilisez le script avec les équations préchargés, l&#39;équation pertinente peut être dirigé choisi parmi la liste plutôt que saisies. Dérivation de cette équation est fournie en annexe. </li><li> Sélectionnez les &quot;Règles de valeurs initiales&quot; boîte, et entrez règles pour les valeurs initiales comme indiqué dans le tableau 3. </li><li> Contraindre le paramètre P, comme &quot;Constant égal à&quot; et entrez la concentration finale de protéines (dans les mêmes unités que le ligand est donnée dans). </li><li> Cliquez sur OK pour effectuer l&#39;analyse. REMARQUE: Un exemple de ces étapes est illustrée à la figure 1D. Le logiciel graphique produit une figure montrant les données et l&#39;ajustement du modèle. Des exemples de tanalyses es sont présentés dans les données représentatives. </li></ol> 4. adaptation de données à des modèles de coopération Pour ajuster les données à un modèle coopératif, choisir entre un modèle coopératif simple, ou un modèle où deux constantes de dissociation distincts sont définis. La première approche est préférable dans le cas de coopérativité négative, ou comme une enquête initiale. Toutefois, en principe, il est préférable dans les cas de coopération positive pour modéliser deux dissociation des constantes 18. Dans ce cas, la modélisation peut procéder soit en supposant liaison séquentielle de ligands, ou indépendant de liaison des ligands. <ol><li> Suivez les mêmes étapes initiales que dans le protocole 3 Toutefois, à l&#39;étape 3.3, insérer des équations dans le tableau 3 répertorié comme &quot;modèle coopératif simple&quot;, &quot;liaison séquentielle de deux ligands&quot;, ou &quot;liaison indépendante des deux ligands&quot; 18. </li><li> Sélectionnez les règles pertinentes pour les valeurs initialesassocié à chacune de ces équations dans le tableau 3. </li><li> Étudier l&#39;adaptation du modèle aux données. Si les données s&#39;adapter mal, envisager un autre modèle. REMARQUE: il est également important d&#39;examiner attentivement la mise en place de la température de fusion de données par le logiciel Shift thermique des protéines (étape 2.9): il est parfois nécessaire de modifier les paramètres ici pour obtenir les meilleurs résultats. Une autre considération est de savoir si la gamme de points de données est idéal, et si il ya des points anormaux: soit un ensemble limité de données de chaque côté de K d, ou un point anormal unique (en particulier à des concentrations les plus élevées de ligand), peut affecter de manière significative les résultats. </li><li> Répéter l&#39;expérience au moins deux fois (voir l&#39;étape 2.12) afin d&#39;assurer la reproductibilité. </li></ol> 5. adaptation de données à des courbes montrant Changements binaires dans Température de fusion De temps en temps, au lieu d&#39;une réponse graduée de ligand, les protéines ont étéobservé à adopter une réponse binaire, où l&#39;échantillon est clairement lié séparé de l&#39;échantillon non lié. Un exemple est fourni dans les résultats représentatifs (figure 4). Dans ce cas, l&#39;ajustement de la température de fusion ne fournira pas un bon ajustement pour K d. <ol><li> Exporter la production de données brutes à partir du logiciel de déplacement thermique de la protéine. Pour chaque point de température, calculer la moyenne de fluorescence pour le ligand de zéro, et les concentrations les plus élevées de ligand. Compiler les résultats de chaque point à côté de ces données. Remarque: l&#39;erreur créée ici est inférieure à l&#39;erreur dans les températures de fusion ajustées. </li><li> Ouvrez le logiciel de statistiques SPSS. Copiez les températures, les deux ensembles de données moyennes, et les données pour chaque expérience d&#39;une fenêtre de données dans SPSS. Dans l&#39;onglet variables, définir le jeu de données moyen sans ligand comme «faible», et l&#39;ensemble de données de moyenne pour la plus forte concentration de ligand comme «élevé». </li><li> Télécharger le fichier de syntaxe disponibleen ligne à l&#39;adresse http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Sélectionnez &quot;Exécuter → Exécuter tous&quot;. </li><li> Copiez la proportion des résultats liés à un nouveau classeur Excel, avec les concentrations de ligand pertinents. </li><li> Ouvrez le logiciel Graphpad, et de créer une table XY. Entrez les données, en utilisant la colonne de X pour les concentrations de ligand et la colonne Y pour la fusion des résultats de température. Dans l&#39;onglet d&#39;analyse, sélectionnez &quot;Paramètres d&#39;analyse du changement». Pour entrer dans le modèle correct, sélectionnez &quot;Nouveau&quot; et &quot;Créer une nouvelle équation&quot;. Entrez l&#39;équation donnée dans le tableau 3, inscrit comme «Analyse des changements binaires de la température de fusion&quot;. </li><li> Cochez la case «Règles pour les valeurs initiales&quot;, et entrez règles pour les valeurs initiales détaillées dans le Tableau 3. Contraindre le paramètre P, comme &quot;Constant égal à&quot; et entrez la concentration finale de protéines (dans les mêmes unités que la ligae est donnée dans). REMARQUE: des exemples de réalisation de ces boîtes pour le protocole de l&#39;article 3 sont présentés à la figure 1C, D. </li><li> Si il est un bon ajustement, les résultats peuvent être améliorés en extrapolant le résultat attendu à la concentration de ligand infini. A partir du modèle de la proportion lié à chaque concentration de ligand, examiner la valeur de la valeur la plus élevée de la concentration du ligand. Si cela est 0,99 ou plus, une analyse plus approfondie est peu probable pour améliorer les résultats. </li><li> Si la proportion est inférieure à 0,99, une étape supplémentaire est nécessaire pour corriger les effets de la protéine non liée à la plus forte concentration de l&#39;échantillon de ligand. A l&#39;étape 5.2, écrire la proportion de ligand lié au point de concentration de ligand le plus élevé (de l&#39;étape 5.7) dans R2 cellule (une cellule différente peut être utilisée, de manière appropriée et R2 remplacé dans l&#39;équation dans le tableau 3). Créer une colonne supplémentaire après la moyenne des résultats de concentrations plus élevées de ligand. Dans les sapinst cellule, copier l&#39;équation figurant au tableau 3 que &quot;l&#39;extrapolation à l&#39;infini concentration ligand&quot;. Copiez cette formule pour les cellules restantes dans cette colonne. Note: Ce calcul supprime l&#39;effet de la protéine non liée à la concentration la plus élevée de ligand. La différence entre la protéine de ligand libre et le ligand de concentration plus élevée est multiplié par l&#39;inverse de la proportion lié à la concentration la plus élevée de ligand pour fournir la différence attendue entre les états de protéines complètement liés et non liés à chaque point de température. Cette différence est ajouté ou soustrait de l&#39;état non lié à donner la fluorescence attendu pour la protéine entièrement ligand lié. </li><li> Remplacer la colonne de concentration de ligand maximale dans la fiche technique SPSS avec cette nouvelle colonne, et répéter l&#39;ajustement des données. REMARQUE: les étapes 5.7 à 5.9 peuvent avoir besoin d&#39;être répétée si le modèle suggère un autre changement significatif dans la proportion liée à des concentrations d maximales ligand(si c&#39;est le cas, il serait sans doute idéal pour répéter l&#39;expérience avec un point de concentration de ligand supérieur inclus). </li><li> Dans les cas où la protéine présente un comportement coopératif et affiche décalage binaire, l&#39;équation a proposé à l&#39;étape 5.5 doit être substitué avec celles de l&#39;étape 4.1. Le &quot;Top&quot; et les paramètres &quot;bas&quot; devraient être remplacés par 1 et 0 respectivement. </li><li> Répéter l&#39;expérience au moins deux fois (voir l&#39;étape 2.12) afin d&#39;assurer la reproductibilité. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Différentielle à balayage fluorimétrie a démontré sa puissance comme une méthode robuste et polyvalent pour la caractérisation des protéines, et l'identification des ligands protéiques potentiels. Les succès bien documentés dans d'accélérer la stabilisation des protéines, la découverte de médicaments (en particulier dans les laboratoires moins bien financés) et la cristallisation 10,23-25 ​​ont fait une méthode intéressante pour le dépistage initial de composés. Les composés ajoutés aux protéines montrent une augmentation dépendante de la dose dans le ressort clairement de 7,9 température de fusion. Cependant, il ya eu quelques tentatives d'utiliser les résultats de ces expériences pour déterminer les constantes de liaison apparentes pour aider dans le classement des composés pour leur affinité. Ici, nous présentons une méthode systématique permettant de déterminer une constante de dissociation apparente pour des protéines en présence d'un ligand. Les résultats présentés ici démontrent que DSF peut rapidement et vigoureusement fournir des estimations de la constante de dissociation pourune combinaison de la protéine-ligand. Les données observées peuvent être manipulés avec des outils disponibles dans le commerce pour fournir une détermination rapide de K d, sans la nécessité d'émettre des hypothèses sur la valeur probable de paramètres. La méthode a un avantage considérable sur certaines des méthodes comparables de parcimonie en protéines et en temps requis. L'expérience décrite ici va consommer 0,13 mg de protéine par essai (environ 0,4 mg pour des expériences répétées en triple exemplaire). Cela se compare favorablement avec calorimétrie de titration isotherme (ITC), où une expérience unique avec une protéine de 40 kDa moyenne va consommer un montant similaire. L'ensemble des expériences requises pour ce protocole consommer environ 4 heures, y compris la préparation, pour une seule série d'expériences. Encore une fois, cela est susceptible d'être beaucoup plus rapide que les procédés tels que le CCI ou résonance de plasmon de surface, qui ont souvent besoin tout puissant optimisation considérable pour atteindre les meilleures données. Nos résultats démontrent qu'il subsiste un besoin d'examiner soigneusement les données brutes, l'ajustement de ces données afin de déterminer la température de fusion, et l'ajustement des données de température de fusion pour déterminer la constante de dissociation. Une première difficulté est la forme de données brutes produites dans la fusion de la protéine. Dans certains cas, la forme peut ne pas se rapprocher de celle observée sur la figure 1A. Les problèmes courants sont faibles changements de température sur la liaison de ligand, une forte fluorescence de fond, et de multiples transitions inhabituelles de température. Déplacements à basse température sont visibles sur la liaison d'un certain nombre de ligands. Pour cette méthode, le paramètre le plus critique est l'erreur sur la mesure de la T m, par rapport au changement de température. Les données peuvent généralement être monté normalement lorsque l'écart type de mesures triples ne dépasse pas 10% de la variation de température de fusion entre la protéine non liée et entièrement lié. Notre expérience est que lorsque cette températuredéplacements rature ne sont de 2 ° C, cela peut être suffisant pour ajuster les données, si les points de données individuels sont très précis. Une deuxième question est particulièrement en forme des courbes. Celles-ci diffèrent souvent entre les protéines libres et les formulaires de ligand lié, comme la liaison ligand affecte les modes de la protéine déroulement. Dans ces cas, l'utilisateur doit déterminer si les données peuvent être utilisés en tenant compte appropriée des modèles à utiliser pour la détermination de la température de fusion et la constante de dissociation. Un autre problème commun est que l'addition d'un cofacteur de la protéine (par exemple, MgCl 2 dans notre exemple avec l'hexokinase) est nécessaire pour obtenir les données les plus fiables. Notre expérience a été que l'examen minutieux de tous les facteurs susceptibles de l'expérience au stade de la prise de mesures initiales est essentielle pour obtenir les meilleurs résultats. En outre, les traitements théoriques alternatifs peuvent révéler des caractéristiques de ces données 15,17. Enfin, il n'est pas rare que certaines protéines qui contain nativement exposée régions hydrophobes à montrer une forte fluorescence de fond. Il ya un certain nombre de solutions à ces problèmes, qui ont été largement décrites ailleurs 6,9. En particulier, l'utilisateur doit se demander si l'utilisation de l'Boltzmann ou modèles dérivés (figure 4), et dans le cas de l'utilisation d'instruments dérivés, si plusieurs fond doivent être modélisés. Les deux méthodes de modélisation du dépliement thermique diffèrent en ce que la méthode de Boltzmann correspond aux données expérimentales à l'équation de Boltzmann, en supposant une forme sigmoïdale régulière de la courbe de dépliement. En revanche, la méthode de la dérivée prend la première dérivée des données expérimentales à chaque point (en bas sur la figure 1A), et considère que la température de fusion pour être le point de la plus haute dérivée première. Procédé dérivé renvoie généralement une température de fusion supérieure d'environ 2-3 ° C. La plupart des protéines reviendront un plus cohérenterésultat (à savoir, l'erreur-type de la température de fusion pour les expériences en triple est plus faible) pour une des deux méthodes. Il s'agit généralement intimement liée à la forme précise de la courbe de dépliement des protéines, et il est nécessaire de déterminer la meilleure méthode empiriquement dans chaque cas. Lorsque le modèle dérivé est utilisé, il est également important de tenir compte de multiples événements de fusion. Certaines données montrent clairement preuve de transitions multiples, et dans ces cas, les résultats sont susceptibles d'être plus facile à interpréter si ces événements de fusion multiples sont modélisés. Dans le cadre de ce protocole, il est souvent le cas que l'addition de ligand peut provoquer une protéine de passer d'avoir plusieurs transitions de fusion à une seule transition (par exemple, en stabilisant le sous-domaine le plus thermiquement fragiles), ou vice versa. Nous serions donc plaider pour que les données brutes sont examinés ensemble avant d'envisager l'approche sera préférable d'utiliser. À la suite de la modélisation des températures de fusion différentes, d'autres problèmes peuvent survenir dans le montage de ces modèles présentés dans la section de protocole. Il est impératif d'examiner attentivement la forme de l'équation constante de dissociation à l'aide d'une échelle logarithmique, comme cette analyse met en évidence souvent des écarts entre les données observées et le modèle (par ex., Figure 3). Alors que les résultats obtenus sont généralement robustes, les soins d'interprétation offre la possibilité d'extraire de meilleurs résultats, et le plus de sens, à partir des données. Un problème particulier soulevé par ces données est l'interprétation qui doit être placé sur les protéines qui montrent coopérativité, ou des événements multiples de liaison, DSF. Nous avons, à ce jour, seulement observé ce phénomène dans les protéines qui sont censés avoir de multiples événements de liaison spécifiques (par exemple, WCBM, une protéine dont le meilleur homologue est un multimère 26, et qui agit comme un multimère sur la chromatographie d'exclusion stérique [données nonreprésenté]). Il n'est pas du tout évident que la coopérativité négative observée dans DSF dénaturation indique que l'enzyme sera finalement montrer coopérativité négative: non, cela peut être une indication de la liaison complexe qui doit être étudié de manière plus approfondie en utilisant un large éventail de méthodes. Cela ne nous suggèrent, cependant, que plus des études approfondies de ces protéines sont susceptibles d'identifier des effets intéressants. Les valeurs indiquées pour la constante de dissociation à l'aide de ce procédé sont généralement du même ordre que ceux fournis par d'autres méthodes, telles que la calorimétrie de titration isotherme et la résonance de plasmon de surface. Toutefois, les valeurs absolues sont observées fréquemment supérieur à celui observé en utilisant ces méthodes. Ceci est au moins en partie une conséquence du fait que la constante de dissociation est observée à la température de fusion de la protéine avec un ligand. Cette valeur de Kd est généralement plus élevée que celle à des températures physiologiques. Le dissociation constant est lié à la température de la réaction par les équations: <img alt="L'équation 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg"> [1] <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg"> [2] (Où c θ est la concentration de référence standard, Δ R G est la variation de la réaction de Gibbs d'énergie libre, R est la constante molaire des gaz, Δ H est la variation d'enthalpie de la réaction, et Δ S est la variation d'entropie dans la réaction .) Les réactions avec des constantes de dissociation dans la plage de mesure de ce procédé ont généralement un négatif Δ r G, et ainsi l'effet d'une augmentation de la température de l'équation [1] sera d'augmenter la constante de dissociation. Les deux termes Δ H et Δ S qui constituent l'énergie libre de Gibbs (équation [2]) sont température dépendante 27, et l'effet sur ​​la constante de dissociation dépendront de l'ampleur et le signe de ces dépendances de température, et ne seront pas nécessairement interaction dépend. Par conséquent, il n'est pas surprenant que les constantes de dissociation calculées par cette méthode sont parfois supérieures à celles qui sont déterminées par des procédés qui fonctionnent à température ambiante. Influence de la température est, bien entendu, également une mise en garde de nombreuses autres méthodes, qui ont tendance à fournir la constante de dissociation à une température inférieure à la température physiologique. Une autre mise en garde de la méthode de DSF est qu'il s'agit d'une méthode marquée, à la différence de l'ITC. Le marqueur fluorescent utilisé (SYPRO Orange) est hydrophobe, et donc dans certains cas, ne peut rivaliser avec la liaison des ligands hydrophobes des protéines. Par conséquent, il est probable que dans certains cas, la constante de dissociation obtenu sera augmenté artificiellement raison de la compétition avec l'étiquette. Cependant, pour la comparaison de divers ligands, (la principale utilisation deDSF), les différences sont peu susceptibles d'être suffisamment importante pour influer sur le classement des composés par affinité. Un inconvénient potentiel de cette méthode est la limite de détection que l'on peut obtenir. En principe, il ne devrait pas être possible de mesurer avec précision une valeur de Kd qui est inférieure à 50% de la concentration de protéine, et même des valeurs de cette gamme sont susceptibles d'être d'une précision douteuse. Bien que la limite de détection à cette extrémité de l'intervalle peut être prolongée par une petite réduction de la concentration de protéine et de colorant, la sensibilité de l'instrument permet d'éviter en outre la réduction de la concentration en protéine. De même, l'extrémité supérieure de la sensibilité est déterminée par la solubilité du ligand. Pour obtenir une estimation mathématique robuste K d, il est très important d'obtenir des données de 90% de la protéine présente dans le formulaire lié au ligand, ce qui nécessite des concentrations de ligands à être approximatifly dix fois Kd (en supposant l'absence coopérativité). La limite de détection sera donc nécessairement un dixième de la solubilité du ligand dans le tampon approprié. Cela signifie que les limites de détection de la méthode sera généralement comprise entre 1 pM et entre 1 et 100 mM, en fonction de la protéine et le ligand. En conclusion, la fluorimétrie différentielle à balayage est une technique polyvalent applicable à une large gamme de protéines. En utilisant les procédés présentés ici, il est possible de déterminer rapidement et à moindre coût l'affinité d'une protéine pour différents ligands. Cela a un grand potentiel pour des applications dans la purification de protéines et de stabilisation, élucider la fonction ou la spécificité des enzymes de métagénomes, et dans la découverte de médicaments, en particulier dans les petits laboratoires.

Toutes les protéines se lient avec des affinités variables, à un large éventail d&#39;autres molécules de simples ions à d&#39;autres grandes macromolécules. Dans de nombreux cas, les protéines se lient à des petites molécules partenaires dans le cadre de leur fonction normale (par exemple, une kinase de liaison à l&#39;ATP). Autres interactions peuvent être sans rapport avec la fonction, mais sont expérimentalement utiles comme outils (par exemple, les petites molécules qui stabilisent les protéines pour améliorer la réussite de cristallisation, ou aider à maintenir les protéines en solution); tandis que les petites molécules qui se lient à des sites actifs et les sites allostériques des protéines peuvent agir comme des inhibiteurs, et ainsi de moduler l&#39;activité des enzymes. Il existe une grande variété de techniques qui peuvent être utilisées pour déterminer l&#39;affinité pour les molécules de protéines partenaires. Calorimétrie de titration isotherme 1 est largement considéré comme un &quot;étalon-or&quot;, car il fournit des informations riches sur les réactions, est le marqueur libre, et a limité les possibilités pour unertifacts de l&#39;expérience. Cependant, malgré des améliorations récentes dans la sensibilité de l&#39;instrumentation et de l&#39;automatisation de montage expérimental, il est encore relativement coûteux en termes de besoins en protéines, a au mieux un débit faible à moyen, et est le mieux adapté aux interactions avec modéré à affinités élevées (10 nM à 100 pM Kd) 2. D&#39;autres méthodes étiquettes libres, tels que la résonance des plasmons de surface ou bicouche interférométrie 3 offre des débits plus élevés, et ont réalisé la sensibilité pour détecter des molécules plus petites aussi faibles que 100 Da. Toutefois, les instruments à haut débit pour ces méthodes sont relativement coûteux, sont justifiées que si il y aura un débit continu de projets pertinents, et sont donc susceptibles d&#39;être inaccessibles à de nombreux laboratoires universitaires. Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou thermofluor) a été décrite pour la première fois en 2001 en tant que méthode 4 pour la découverte de médicaments. Dans cette méthod, les protéines sont incubées avec un colorant fluorescent (colorants initialement naphtalène-sulfonique ont été utilisés), ce qui modifie sa fluorescence lors de la liaison à des régions hydrophobes des protéines. L&#39;échantillon de protéine-colorant est ensuite chauffé, et la fluorescence contrôlée comme la chaleur monte. Le dépliement de la protéine, et l&#39;exposition des parties hydrophobes de la protéine, donne naissance à un motif caractéristique de la fluorescence en fonction de la température (Figure 1A). L&#39;essai peut être réalisé en de petites quantités dans un instrument PCR quantitative commerciale, et donc en une seule expérience, un grand nombre d&#39;échantillons peuvent être testés en même temps (habituellement 48, 96 ou 384 échantillons, en fonction du modèle de l&#39;instrument). Des expériences peuvent être effectuées habituellement en environ une heure, offrant la possibilité d&#39;une analyse à haut débit de 5 échantillons. D&#39;autres améliorations de la méthodologie ont vu l&#39;adoption de colorants avec de meilleures propriétés spectrales 6,7 </sup&gt;, outils génériques pour l&#39;analyse des données, et suggéré des protocoles de dépistage initial 8,9. La gamme des applications de la méthode a été étendue, avec un accent particulier sur la création de conditions optimales pour la préparation et le stockage des protéines 10, et sur ​​l&#39;identification de partenaires potentiels de liaison pour faciliter la cristallisation 11. Le débit relativement élevé de la méthode, un coût relativement faible en protéines (~ 2 pg par réaction), et l&#39;applicabilité à l&#39;étude de la faiblesse des molécules de liaison a fait DSF un outil précieux pour le fragment basé la conception de médicaments, en particulier dans un contexte académique 12-14. Malgré la large application de DSF à l&#39;étude des interactions protéine-ligand, peu d&#39;études ont décrit la détermination des constantes de dissociation de ces études. Toutefois, ceux-ci ont tendance à produire des équations détaillées décrivant le déroulement de la protéine, avec de nombreux paramètres qui doivent être montés sur des données éparses ou dans certains cas, estimated 7,15-17. Ces méthodes sont d&#39;une importance particulière dans les cas difficiles, tels que les composés fortement contraignants, ou des protéines présentant des transitions inhabituelles. Cependant, pour de nombreux laboratoires, ces analyses détaillées sont trop lourdes pour une utilisation courante. Nous proposons donc des traitements alternatifs pour les différents scénarios, et montrons comment elles peuvent être utilisées pour ajuster les données résultant de différentes interactions protéine-ligand. Notre méthode utilise l&#39;instrument StepOne qPCR, pour lequel le logiciel d&#39;analyse de données sur mesure est disponible; tout ce qui accélère l&#39;analyse des données, les résultats d&#39;autres instruments peuvent être traitées en utilisant des procédés publiés antérieurement neuf, et en aval à la même analyse peut être effectuée.

<table><tbody><tr><td>L’instrument de PCR en temps réel StepOne</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF peut être réalisé avec de nombreux autres instruments. L’instrument StepOne dispose d’un logiciel très pratique pour l’analyse des données.</td></tr><tr><td>Logiciel de décalage thermique protéique v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>Plaques optiques 48 puits MicroAmp Fast</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité optique&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad n° de pièce 223-9444 est un fournisseur alternatif</td></tr><tr><td>Plaques à fond en U à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>Pour un fournisseur de plus petit volume, utilisez la référence Sigma n° S5692</td></tr><tr><td>Statistiques SPSS version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>D’autres progiciels de statistiques fourniront des fonctionnalités similaires</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>D’autres progiciels de statistiques offrent des fonctionnalités similaires</td></tr><tr><td>Applicateur manuel (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase de Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher</td><td>10141520</td><td></td> scientifique</tr></tbody></table>

détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage fluorimétrie

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Une large gamme de méthodes sont actuellement disponibles pour la détermination de la constante de dissociation entre une protéine et l&#39;interaction des petites molécules. Cependant, la plupart d&#39;entre eux nécessitent l&#39;accès à des équipements spécialisés, et ont souvent besoin d&#39;un degré d&#39;expertise d&#39;établir efficacement des expériences fiables et analyser les données. Fluorimétrie à balayage différentiel (CSD) est de plus en plus utilisée comme une méthode robuste pour le criblage initial de protéines de petites molécules de l&#39;interaction, soit pour l&#39;identification de partenaires de découverte physiologiques ou de toucher. Cette technique présente l&#39;avantage qu&#39;il suffit d&#39;une machine appropriée pour la PCR quantitative PCR, et si approprié instrumentation est disponible dans la plupart des institutions; une excellente gamme de protocoles sont déjà disponibles; et il existe de fortes précédents dans la littérature pour de multiples utilisations du procédé. Les travaux antérieurs a proposé plusieurs moyens de calculer les constantes de dissociation à partir des données de DSF, mais ceux-ci sont mathématiquement exigeant. Ici, nous DEMtrent un procédé d&#39;estimation des constantes de dissociation à partir d&#39;une quantité modérée de DSF des données expérimentales. Ces données peuvent généralement être recueillies et analysées en une seule journée. Nous démontrons comment les différents modèles peuvent être utilisés pour ajuster les données recueillies à partir des événements de liaison simples, et où les sites de liaison ou indépendants de liaison de coopération sommes présents. Enfin, nous présentons un exemple d&#39;analyse de données dans le cas où les modèles standard ne s&#39;appliquent pas. Ces méthodes sont illustrées avec les données recueillies sur les protéines de contrôle disponibles dans le commerce, et deux protéines de notre programme de recherche. Dans l&#39;ensemble, notre méthode fournit un moyen simple pour les chercheurs d&#39;acquérir rapidement d&#39;autres renseignements sur les interactions protéine-ligand à l&#39;aide de DSF.

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

L’objectif global de cette procédure est d’estimer la constante de dissociation pour l’interaction d’un ligand protéique. Pour ce faire, on prépare d’abord des mélanges de protéines avec différentes concentrations du ligand ainsi qu’un colorant indicateur. La deuxième étape consiste à chauffer ces échantillons tout en enregistrant la fluorescence de l’indicateur pour suivre le déroulement de la protéine.Ensuite, les courbes de dépliage des protéines sont converties en une série de températures de fusion. La dernière étape consiste à ajuster ces données à un modèle approprié pour estimer la constante de dissociation. En fin de compte, la fluorométrie différentielle à balayage est utilisée pour mieux comprendre l’interaction d’une protéine avec ses ligands.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’isotherme, le titrage, la calorimétrie et la résonance plasma de surface est qu’elle peut être réalisée en quelques heures en utilisant uniquement des quantités modérées d’échantillon dans un instrument déjà disponible dans la plupart des instituts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chimie des protéines, telles que l’affinité des ligands pour les protéines et la force relative des interactions. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode éprouvent des difficultés, car le choix des échantillons à utiliser et l’analyse des données peuvent être difficiles.Avant de commencer cette procédure, préparez les solutions suivantes. Un mélange contenant les réactifs détaillés dans ce tableau et les stocks du ligand d’intérêt à la plus haute concentration disponible, ainsi que six dilutions décuplées de cette concentration. Si l’on connaît une constante de dissociation approximative à partir de données antérieures, préparer au moins deux concentrations au-dessus et au-dessous du kd.Un exemple de tableau est présenté ici. Aliquote 18 microlitres du mélange dans chacun des huit puits. Dans la plaque A-Q-P-C-R, ajoutez deux microlitres de solvant dans le premier puits de chacun des sept puits restants, ajoutez deux microlitres de chaque membre de la série de dilution du ligand.Placez le joint A-Q-P-C-R sur la plaque pour obtenir une bonne étanchéité de la plaque. Placez un applicateur à main au milieu de la plaque, lissez le joint d’un côté, puis répétez l’opération sur l’autre moitié de la plaque. Centrifugez la plaque à 500 fois G pendant deux minutes pour éliminer les bulles d’air.Ensuite, placez la plaque dans un instrument QPCR de première étape. Sélectionnez l’option de courbe de fusion, les filtres de roches et choisissez la vitesse de rampe rapide. Effectuer une dénaturation thermique à la fin de l’analyse de l’instrument.Cliquez sur le bouton d’analyse à l’écran. Enregistrez le fichier de résultat. Ouvrez le logiciel de décalage thermique des protéines.Créez une nouvelle étude dans l’onglet des propriétés, donnez-lui un nom, et dans l’onglet des conditions, détaillez les ligands. Accédez à l’onglet Fichiers d’expérience et importez le fichier de résultats enregistré.Définissez le contenu de chacun. Eh bien, passez à l’onglet d’analyse et appuyez sur le bouton d’analyse pour analyser les résultats. Vérifiez que la protéine en présence de solvant seul donne un résultat similaire à celui montré sur cette figure.Ensuite, examinez les températures de fusion observées dans les résultats de la douleur répliquée. Assurez-vous que cela montre une nette augmentation de la température de fusion avec l’augmentation de la concentration de ligand. Ces données seront utilisées pour fournir une valeur approximative de la constante de dissociation, comme décrit dans l’article d’accompagnement.Ces solutions sont nécessaires à la procédure de détermination de la constante de dissociation, d’un mélange maître tel que détaillé dans ce tableau et de stocks du ligand à 15 concentrations différentes, qui seront dilués dix fois. Dans l’expérience finale. Idéalement, incluez les concentrations de ligands, d’au moins deux ordres de grandeur au-dessus et en dessous du kd estimé, et centrez les concentrations sur le kd estimé.Un exemple de série de dilution est présenté ici. Concentrez-vous sur sept des points dans un ordre de grandeur du KD estimé avec quatre autres points de chaque côté de celui-ci. S’il y a un choix, incluez plus de points aux valeurs qui saturent.Ajoutez 120 microlitres du mélange principal à chacun des huit puits dans une plaque à 96 puits à fond en U pour servir de réservoir pour une distribution pratique du mélange principal. Ensuite, à l’aide d’une pipette à huit canaux, versez 18 microlitres du mélange principal dans une colonne d’une plaque PCR. Répétez l’opération pour cinq autres colonnes pour obtenir un total de 48 puits remplis selon un motif de six par huit sur la plaque.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tiges de ligand ou de solvant dans chacun des huit puits. Dans une autre plaque à fond en U de 96 puits, à l’aide d’une pipette à huit canaux, aspirez deux microlitres de huit ligands ou solvants différents, et ajoutez-les à une colonne de la plaque PCR qui a été remplie avec le mélange maître. Répétez l’opération avec les huit mêmes ligands ou solvants.Pour deux autres colonnes, aspirez deux microlitres des huit ligands ou solvants restants, et ajoutez-les à une quatrième colonne de la plaque. Répétez cette opération pour deux autres colonnes. Cela donnera des échantillons en trois exemplaires pour les 16 échantillons de ligands et de solvants.Placez le sceau A-Q-P-C-R sur la plaque. Centrifugez la plaque à 500 fois G pendant deux minutes. Placez la plaque dans l’instrument QPCR et effectuez une dénaturation thermique en utilisant les paramètres spécifiés précédemment à la fin de l’analyse.Cliquez sur le bouton d’analyse à l’écran. Enregistrez le fichier de résultat. Ouvrez le logiciel de décalage thermique des protéines.Créez une nouvelle étude dans l’onglet des propriétés, donnez-lui un nom et dans l’onglet des conditions, détaillez les ligands. Accédez à l’onglet Fichiers d’expérience, importez le fichier de résultats enregistré et définissez le contenu de chacun.Eh bien, passez à l’onglet d’analyse et appuyez sur le bouton d’analyse. Choisissez l’onglet Répliques dans le menu situé à gauche de l’écran pour afficher les résultats. Comme des triplés.Évaluez la fiabilité des données en fonction de l’étanchéité des triplets. Les triplets doivent présenter une faible reproductibilité. Examinez attentivement les données brutes.Analysez les données à l’aide de la méthode boltman ou de la méthode dérivée. Pour évaluer la température de fusion, sélectionnez l’onglet Résultats de réplication et, dans le graphique des résultats de réplication, basculez le graphique par bouton entre tm, boltzmann et dérivée TM. Sélectionnez la méthode qui donne la plus grande reproductibilité de l’échantillon.Pour les échantillons qui présentent plusieurs transitions, il est presque toujours préférable d’utiliser la méthode dérivée en mode de fusion multiple. Exportez les résultats pour une enquête plus approfondie avec Excel à l’aide de l’onglet d’exportation. Commencez cette analyse en créant un tableau dans Excel des concentrations de ligands et de la température de fusion.Ouvrez le logiciel GraphPad prism et créez une table XY. Entrez les données à l’aide de la colonne X pour les concentrations de ligands et de la colonne Y pour les résultats de température de fusion. Dans l’onglet analyse, sélectionnez l’option d’ajustement de la courbe de régression non linéaire.Pour entrer le modèle correct, sélectionnez nouveau et créez une nouvelle équation. Insérez l’équation appropriée en tant que liaison de ligand à site unique. Sélectionnez la case Règles pour les valeurs initiales et entrez les règles pour les valeurs initiales.Contraindre le paramètre P comme constant égal à entrer dans la concentration finale de protéines. Sélectionnez Analyser pour effectuer l’analyse, Analyse supplémentaire pour ajuster les données à un modèle coopératif ou Ajuster les données aux courbes. L’affichage de décalages binaires de la température de fusion est décrit dans le texte du protocole qui l’accompagne.Cette méthode a été utilisée pour mesurer l’interaction de l’hexokinase avec le glucose. Un premier dépistage suggère une KD probable de 0,2 à 1,7 millimolaire. Les résultats d’un écran plus grand montrent un bon ajustement au modèle pour un seul événement de liaison avec un KD de 1,2 plus ou moins 0,1 millimolaire, le putatif HETO SQUA L transférase WCBM montre un fort décalage thermique lors de la liaison au GTP.Un premier dépistage a suggéré un KD de 200 à 500 micromolaires. Une expérience détaillée suggère un KD apparent de 120 plus ou moins 20 micromolaires. Cependant, lorsqu’une échelle logarithmique est utilisée pour l’axe des X, il existe un écart significatif entre le modèle et l’analyse des données des mêmes données avec un modèle coopératif montre un excellent ajustement aux données, ce qui implique que WCBM est anti-coopératif dans sa liaison à GTPA, un résultat assez inhabituel est observé avec le PIB putatif 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.En l’absence de ligand, et à des concentrations élevées de ligand, on observe un simple schéma de fusion monophasique. Cependant, à des concentrations intermédiaires de ligands, deux pics de fusion distincts sont observés. La transition entre les deux ensembles de pics dépend de la dose sur toute la gamme de concentrations modélisant la fusion biphasique.En tant que somme d’une proportion du ligand, les résultats de ligand libre et élevé donnent un bon ajustement aux données. Cet ajustement est amélioré en extrapolant le résultat observé pour une concentration élevée de ligands à l’occupation complète. Les données obtenues pour la proportion de WCBI liée au ligand montrent un excellent ajustement à un modèle de liaison simple.Avec un KD de 58 plus ou moins deux micromolaires Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre ou cinq heures, y compris les répétitions si elle est effectuée correctement Suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que la fluorescence veineuse tiptop et la titration calorimétrique isotherme peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la dépendance à la température et la géométrie STA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer une estimation de la constante de dissociation d’une interaction à l’aide de la grippe à balayage différentiel.

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