Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to

L'objectif général de cette procédure est de générer un transporteur suffisamment stable pour des études structurales, et d'utiliser ce transporteur modifié afin de produire des cristaux diffractant à haute résolution par cristallographie aux rayons X. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale, telles que la manière de déterminer la structure de protéines membranaires qui constituent des cibles thérapeutiques importantes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de sélectionner une conformation liée à un médicament en utilisant un test fonctionnel.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les transporteurs de neurotransmetteurs, elle peut également être appliquée aux récepteurs, aux canaux et aux protéines solubles, qui se lient à de petites molécules avec une forte affinité. Resuspendre soigneusement les cellules HEK293S GnTI minus traitées à la trypsine dans du DMEM complété avec 10 % de sérum de veau fœtal jusqu'à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre dans un réservoir à pipette jetable. À l'aide d'une pipette multipuits, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque puits d'une plaque revêtue de poly-D-lysine.

Resuspendre les cellules dans le réservoir de la pipette après avoir rempli chaque plaque afin d'assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 °C avec 8 % de dioxyde de carbone. Remplacer le milieu cellulaire une heure avant la transvection.

Préparez les complexes de réactif de transvection d'ADN en mélangeant 450 nanogrammes d'ADN avec 45 microlitres de DMEM sans sérum pour chaque construction devant être analysée dans le fond cert TC. Ajoutez ensuite 1,6 microlitre du réactif de transvection à 45 microlitres de DMEM sans sérum et mélangez. Ajoutez immédiatement la solution de réactif de transvection diluée à la solution d'ADN et mélangez.

Ne pas mélanger les solutions dans l'ordre inverse. Attendre de 10 à 15 minutes avant d'ajouter 20 microliters du mélange d'ADN du réactif de transvection à quatre des puits. Incuber les cellules avec 200 nanomolaire de citalopram et 25 microliters de TBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Pour solubiliser les cellules, ajouter 25 microlitres de C12M à huit millimolaire, de CHS à un millimolaire et du cocktail d'inhibiteurs de protéase dans du TBS. Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante. Puis ajouter 50 microlitres de TBS contenant 20 nanomolaire de citalopram tritié, 0,1 % d'albumine sérique bovine et des milligrammes par millilitre de billes d'assay d'affinité SPA (scintillation proximity assay) avec marqueur His, à trois puits pour chaque construit.

Pour le dernier puits, ajoutez la même solution TBS, mais complétée par de la sertraline à 100 micromolaire afin de déterminer la liaison non spécifique. Veillez à ce que les billes SPA d'affinité pour la marque his soient bien homogénéisées avant leur ajout dans la plaque 96 puits. Mesurez la liaison du citalopram tritié à l'aide d'un compteur à scintillation 96 puits à température ambiante, avec un temps de comptage d'une minute par puits.

Continuer à compter les plaques jusqu'à ce que le nombre total atteigne un plateau d'environ 36 heures. Après la mesure, chauffer les plaques pendant 15 minutes dans un bloc chauffant muni d'un couvercle chauffant à 33 degrés Celsius. Mesurer à nouveau la fixation du citalopram tritié après le chauffage.

Répétez ces étapes en modifiant l'étape de chauffage. Ajustez les températures de chauffage en fonction de la température de fusion apparente de la protéine cible et de la thermostabilité du construit le plus stable. Poursuivez le chauffage des plaques jusqu'à ce que tous les construits présentent de faibles comptes spécifiques.

Faire pousser des cellules HEK293S GnTI négatives en suspension à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone et 85 % d'humidité sur un agitateur à 130 tr/min dans un milieu d'expression 293 complété avec 2 % de sérum bovin fœtal. Infecter 10 litres de ces cellules avec le virus P2 à une multiplicité d'infection de deux et à une densité de trois millions de cellules par millilitre. Ajouter du butyrate de sodium 12 à 16 heures après l'infection à une concentration de 10 millimolaire à partir d'une solution mère de un molaire.

48 à 60 heures après l'infection, récolter les cellules par centrifugation à 4 000 × g pendant 15 minutes. Éliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 150 millilitres de TBS contenant 2 micromolaire d'escitalopram ou d'autres inhibiteurs du SERT.

les cellules provenant de 10 litres de culture dans de l’eau tiède à environ 30 degrés Celsius et les resuspendre en faisant passer rapidement les cellules à travers une pipette de 10 millilitres jusqu’à homogénéité. Ajouter toutes les cellules dans un bécher muni d’un barreau d’agitation, puis ajouter toute la solution de détergent aux cellules sous agitation. Solubiliser les cellules à quatre degrés Celsius pendant une heure avec agitation.

Faire centrifuger le lysat à 8 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Verser le surnageant dans des tubes propres pour ultracentrifugeuse et éliminer le culot. Puis centrifuger le surnageant à 100 000 ×g pendant une heure dans une ultracentrifugeuse.

Après l'ultracentrifugation, filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,2 micron et éliminer le culot. Ensuite, faire passer le lysat sur 10 millilitres de résine d'affinité strep emballée dans une colonne à l'aide d'une pompe péristaltique prééquilibrée avec le tampon de lavage. Puis connecter une colonne d'affinité strep à un système de chromatographie liquide rapide de protéines et laver la colonne à deux millilitres par minute avec 66 millilitres de tampon de lavage.

Éluer la protéine purifiée dans le même tampon de lavage supplémenté avec 5 millimolaire de desthiobiotine à raison de 0,5 millilitre par minute en utilisant 33 millilitres de tampon. Collecter des fractions d'un millilitre. Les fractions du pic seront d'environ 10 millilitres.

Pour former les complexes anticorps-transporteur, digérez d'abord la protéine purifiée toute la nuit à température ambiante avec de la thrombine afin de retirer les étiquettes, et de l'Endo H pour la déglycosylation. Concentrez la protéine jusqu'à une concentration de 10 milligrammes par millilitre et un volume de 250 à 300 microlitres à l'aide d'un concentrateur de protéines par centrifugation ayant une limite de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Mélangez la protéine SERT concentrée avec le fragment 8B6 Fab dans un rapport molaire de un à 1,2, dans un volume inférieur à 500 microlitres.

Centrifuger le mélange à 100 000 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes. Après la centrifugation, récupérer le surnageant contenant le complexe SERT Fab et éliminer le culot. Séparer le complexe par chromatographie liquide rapide de protéines sur une colonne de filtration par taille.

Équilibrer avec du TBS supplémenté à 0,5 millilitre par minute. Avant la cristallisation, concentrer les fractions de pic issues de la séparation du complexe à deux milligrammes par millilitre à l’aide d’un concentrateur protéique centrifuge avec une limite de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Une absorbance de deux UA à 280 nanomètres équivaut à un milligramme par millilitre.

Ajouter des Fab supplémentaires dans un rapport d’un complexe pour 0,05 Fab libres. Ajouter également 10 micromolaire de citalopram S libre. Après centrifugation de l’échantillon, récupérer le surnageant contenant le complexe SERT-Fab et éliminer le culot.

Préparer un écran en goutte suspendue à 24 puits à quatre degrés Celsius selon le tableau un du protocole écrit. Prélever 500 microlitres de chaque solution réservoir dans une plaque à 24 puits de faible hauteur avec un scellant appliqué dans chaque puits. Prélever 1,5, 1,75 et deux microlitres du complexe SERT Fab sur un couvre-objet en verre siliconé de 18 millimètres.

Ensuite, pipeter un microlitre de solution de réservoir sur l'échantillon protéique. Des cristaux uniques apparaîtront en environ trois jours et atteindront une taille de 100 à 175 micromètres après 14 jours. Voici des résultats représentatifs pour le criblage de la thermostabilité en présence de citalopram tritié.

Les valeurs de température de fusion tracées en fonction de la liaison maximale montrent des mutants présentant une forte thermostabilité et une bonne expression. Sont affichées ici les courbes de thermostabilité du SERT TC de type sauvage et des trois meilleurs mutants, Y110A, I291A et T439S. Cette image de microscopie montre des cellules HEK293S GnTI moins exprimant le SERT CC avec une fluorescence verte présente sur la membrane cellulaire.

La chromatographie d'exclusion par taille avec détection de fluorescence du CC de SERT montre un pic principal à 15 millilitres. L'analyse par électrophorèse SDS-PAGE révèle une espèce protéique unique, largement dépourvue de contaminants. Une séparation représentative des complexes anticorps-transporteur par chromatographie d'exclusion par taille est présentée.

Le pic principal élué à 11,5 millilitres contenait à la fois SERT et Fab, comme indiqué sur un gel SDS-PAGE. La microscopie optique du complexe anticorps-SERT lié au s-citalopram après deux semaines de croissance révèle des cristaux de forme prismatique d'environ 100 à 175 microns. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier des mutations capables de stabiliser une protéine membranaire dans une conformation liée à un ligand, ainsi que comment mettre en place des criblages de cristallisation avec des complexes protéine-anticorps.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les ligands sont nécessaires à la stabilisation du complexe SERT TC et qu'ils sont essentiels à la cristallisation du complexe SERT CC. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles psychiatriques, car SERT est la cible moléculaire de nombreux médicaments antidépresseurs. Après cette procédure, la fonction de SERT purifié peut être caractérisée à l'aide de méthodes biochimiques et biophysiques.