Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to S -citalopram

L’objectif global de cette procédure est de générer un transporteur suffisamment stable pour les études structurales, et d’utiliser ce transporteur modifié pour produire des cristaux qui se défractent à haute résolution par cristallographie aux rayons X. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale, telles que la résolution de la structure des protéines membranaires qui sont des cibles médicamenteuses importantes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour sélectionner une conformation liée à un médicament à l’aide d’un test fonctionnel.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des transporteurs de neurotransmetteurs, elle peut également être appliquée aux récepteurs, aux canaux et aux protéines solubles, qui se lient à de petites molécules avec une grande affinité. Remettre en suspension complètement des cellules HEK293S GnTI moins trypsonisées dans du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre dans un réservoir de pipette jetable. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque recouverte de poly-D-lysine.

Remettez les cellules en suspension dans le réservoir de la pipette après avoir rempli chaque plaque pour assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone. Remplacez le support de la cellule une heure avant la transvection.

Préparez les complexes de réactifs de transvection de l’ADN en mélangeant 450 nanogrammes d’ADN avec 45 microlitres de DMEM sans sérum pour chaque construction du fond du certificat TC à cribler. Ajoutez ensuite 1,6 microlitre de réactif de transvection à 45 microlitres de DMEM sans sérum et mélangez. Ajouter immédiatement la solution de réactif de transvection diluée à la solution d’ADN et mélanger.

Ne mélangez pas les solutions dans l’ordre inverse. Attendez 10 à 15 minutes avant d’ajouter 20 microlitres du mélange d’ADN réactif de transvection dans quatre des puits. Incuber les cellules avec 200 nanomolaires de citalopram et 25 microlitres de TBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Pour solubiliser les cellules, ajoutez 25 microlitres de C12M millimolaire, un CHS millimolaire et un cocktail d’inhibiteurs de protéase dans TBS. Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante. Ajoutez ensuite 50 microlitres de TBS avec 20 nanomolaires de citalopram tritié, 0,1 % d’albumine sérique bovine et des milligrammes par millilitre de son test de proximité de scintillation d’affinité de marquage ou de billes SPA, dans trois puits pour chaque construction.

Pour le dernier puits, ajoutez la même solution de TBS, mais complétez avec 100 micromolaires de sertraline pour déterminer la liaison non spécifique. Assurez-vous que les perles SPA d’affinité avec son étiquette sont bien mélangées lorsque vous les ajoutez à la plaque à 96 puits. Mesurez la liaison du citalopram tritié à l’aide d’un compteur à scintillation de 96 puits à température ambiante avec un temps de comptage d’une minute par puits.

Continuez à compter les plaques jusqu’à ce que le nombre total se stabilise à environ 36 heures. Après la mesure, chauffez les plaques pendant 15 minutes dans un bloc chauffant avec un couvercle chauffant à 33 degrés Celsius. Mesurez à nouveau le citalopram tritié en liant après chauffage.

Répétez ces étapes en modifiant l’étape de chauffage. Ajustez les températures de chauffage en fonction de la température de fusion apparente de la protéine cible et de la thermostabilité de la construction la plus stable. Continuez à chauffer les plaques jusqu’à ce que toutes les constructions aient un faible nombre spécifique.

Cultivez HEK293S cellules GnTI moins en suspension à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone et 85 % d’humidité sur un agitateur à 130 tr/min et 293 milieux d’expression complétés par 2 % de sérum bovin fœtal. Infectez 10 litres de cellules avec le virus P2 à une multiplicité d’infection de deux et une densité de trois millions de cellules par millilitre. 12 à 16 heures après l’infection, ajouter du butyrate de sodium à une concentration de 10 millimolaires à partir d’un stock d’une molaire.

48 à 60 heures après l’infection, récoltez les cellules par centrifugation à 4 000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le surnageant. Remettre en suspension des cellules dans 150 millilitres de TBS avec 2 micromolaires d’escitalopram ou d’autres inhibiteurs du SERT.

les cellules de 10 litres de culture dans de l’eau chaude à environ 30 degrés Celsius et les remettre en suspension en passant rapidement les cellules à travers une pipette de 10 millilitres jusqu’à ce qu’elles soient homogènes. Ajoutez toutes les cellules dans un bécher avec une barre d’agitation et ajoutez toute la solution détergente dans les cellules tout en remuant. Solubiliser les cellules à quatre degrés Celsius pendant une heure en remuant.

Faites tourner le lysat à 8 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Décantez le surnageant dans des tubes ultra-centrifuges propres et jetez la pastille. Ensuite, faites tourner le surnageant à 100 000 fois G pendant une heure dans une ultra-centrifugeuse.

Après l’ultra-centrifugation, filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,2 micron et jetez la pastille. Ensuite, passez le lysat sur 10 millilitres de résine d’affinité streptococcique dans une colonne à l’aide d’une pompe périsaltique équilibrée dans un tampon de lavage. Connectez ensuite une colonne d’affinité streptococcique à un système de chromatographie liquide à protéines rapides et lavez la colonne à deux millilitres par minute avec 66 millilitres de tampon de lavage.

Éluez la protéine purifiée dans le même tampon de lavage complété par cinq millimolaires de desthiobiotine à raison de 0,5 millilitre par minute en utilisant 33 millilitres de tampon. Collectez des fractions d’un millilitre. Les fractions maximales seront d’environ 10 millilitres.

Pour former les complexes d’anticorps du transporteur, digérez d’abord la protéine purifiée pendant la nuit à température ambiante avec de la thrombine pour éliminer les marqueurs et de l’Endo H pour la déglycosylation. Concentrez la protéine à une concentration de 10 milligrammes par millilitre et à un volume de 250 à 300 microlitres à l’aide d’un concentrateur de protéines centrifuge de 100 kilodaltons de poids moléculaire. Mélangez la protéine SERT concentrée avec 8B6 Fab à un rapport molaire de un à 1,2 dans un volume inférieur à 500 microlitres.

Centrifugez le mélange à 100 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après la centrifugation, récupérez le surnageant contenant le complexe SERT Fab et jetez la pastille. Séparez le complexe à l’aide de la chromatographie liquide protéique rapide sur une colonne d’exclusion stérique.

Équilibrez-le avec du TBS supplémenté à 0,5 millilitre par minute. Avant la cristallisation, concentrez les fractions de pointe de la séparation du complexe à deux milligrammes par millilitre à l’aide d’un concentrateur de protéines centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Une absorbance de deux UA à 280 nanomètres est égale à un milligramme par millilitre.

Ajoutez du Fab supplémentaire dans un rapport de un à 0,05 complexe pour libérer le Fab. Ajoutez également 10 micromolaires de S citalopram. Après centrifugation de l’échantillon, prélever le surnageant contenant le complexe SERT Fab et jeter la pastille.

Installez un tamis suspendu à 24 puits à quatre degrés Celsius selon le tableau un du protocole texte. Pipette de 500 microlitres de chaque solution de réservoir dans une plaque à profil bas de 24 puits avec un produit d’étanchéité appliqué sur chaque puits. Pipette 1,5, 1,75 et deux microlitres du complexe SERT Fab sur une lamelle en verre siliconé de 18 millimètres.

Ensuite, pipetez un microlitre de solution réservoir sur l’échantillon de protéines. Les monocristaux apparaîtront dans environ trois jours et atteindront 100 à 175 micromètres après 14 jours. Voici des résultats représentatifs pour le dépistage de la thermostabilité en présence de citalopram tritié.

Les valeurs de température de fusion tracées en fonction de la liaison maximale montrent des mutants avec une thermostabilité et une expression élevées. Voici les courbes de thermostabilité pour le SERT TC de type sauvage et les trois principaux mutants, Y110A, I291A et T439S. Cette image microscopique montre HEK293S cellules GnTI moins exprimant SERT CC avec une fluorescence verte présente sur la membrane cellulaire.

La chromatographie d’exclusion stérique de détection de fluorescence de SERT CC montre un pic majeur à 15 millilitres. L’analyse par SDS-PAGE montre une seule espèce de protéine largement exempte de contaminants. La séparation représentative des complexes d’anticorps de transporteur par chromatographie d’exclusion stérique est montrée.

Le pic principal à 11,5 millilitres contenait à la fois du SERT et du Fab, comme le montre un gel SDS-PAGE. La microscopie optique du complexe d’anticorps SERT lié au citalopram S après deux semaines de croissance montre des cristaux en forme de prisme d’environ 100 à 175 microns. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les mutations qui stabilisent une protéine membranaire dans une confirmation liée au ligand et de la mise en place de criblages de cristallisation avec des complexes d’anticorps protéiques.

Lorsque vous essayez de faire cette procédure, il est important de se rappeler que les ligands sont nécessaires à la stabilisation du SERT TC et sont essentiels à la cristallisation du SERT CC. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des troubles psychiatriques car le SERT est la cible moléculaire de nombreux médicaments antidépresseurs. À la suite de cette procédure, la fonction du SERT purifié peut être caractérisée à l’aide de méthodes biochimiques et biophysiques.